Name: spontaneous formation and rearrangement of artificial lipid nanotube networks as a bottom-up model for endoplasmic reticulum
Uploaded: 2019-01-22T14:40:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum at JoVE.com

ونحن نشكر الأستاذ الدكتور الدو جيسوركا من "جامعة تشالمرز للتكنولوجيا" في السويد لتعليقاته لا تقدر بثمن في المخطوطة. وقد أمكن هذا العمل من خلال الدعم المالي التي تم الحصول عليها من منحة مشروع "مجلس البحوث في النرويج" (Forskningsrådet) 274433، الارجان: علوم الحياة تقارب البيئة، 2015 منحة مشروع المجلس السويدي للبحوث (Vetenskapsrådet)-04561، فضلا عن بدء التمويل المقدمة من مركز "الطب الجزيئي" النرويج وكلية الرياضيات والعلوم الطبيعية في جامعة أوسلو.

<ol>
	<li>Chen, S., Novick, P., Ferro-Novick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+structure+and+function.">ER structure and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (4), 428-433 (2013).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).</li><li>Pendin, D., McNew, J. A., Daga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+ER+dynamics:+Shaping,+bending,+severing,+and+mending+membranes.">Balancing ER dynamics: Shaping, bending, severing, and mending membranes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 23 (4), 435-442 (2011).</li><li>Bilal, T., G&#246;zen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+dynamics+of+endoplasmic+reticulum-like+lipid+nanotube+networks.">Formation and dynamics of endoplasmic reticulum-like lipid nanotube networks.</a> Biomaterials Science. 5 (7), 1256-1264 (2017).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+determining+the+morphology+of+the+peripheral+ER.">Mechanisms determining the morphology of the peripheral ER.</a> Cell. 143 (5), 774-788 (2010).</li><li>Ozcan, L., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+metabolic+disease+and+other+disorders.">Role of endoplasmic reticulum stress in metabolic disease and other disorders.</a> Annual Review of Medicine. 63, 317-328 (2012).</li><li>Yamanaka, T., Nukina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+dynamics+and+derangement+in+neurological+diseases.">ER dynamics and derangement in neurological diseases.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Taalab, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disordered+neurodegenerative+function:+Concepts+and+facts+about+the+different+roles+of+the+protein+kinase+RNA-like+endoplasmic+reticulum+kinase+(PERK).">Mechanisms of disordered neurodegenerative function: Concepts and facts about the different roles of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK).</a> Reviews in the Neurosciences. , (2018).</li><li>Shemesh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+the+generation+and+interconversion+of+ER+morphologies.">A model for the generation and interconversion of ER morphologies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 5243-5251 (2014).</li><li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmatic+reticulum+shaping+by+generic+mechanisms+and+protein-induced+spontaneous+curvature.">Endoplasmatic reticulum shaping by generic mechanisms and protein-induced spontaneous curvature.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 153-160 (2014).</li><li>Jesorka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+phospholipid+vesicle-nanotube+networks+and+transport+of+molecules+therein.">Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein.</a> Nature Protocols. 6, 791 (2011).</li><li>Hook, D. A., Olhausen, J. A., Krim, J., Dugger, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Oxygen+Plasma+and+UV+Ozone+Methods+for+Cleaning+of+Occluded+Areas+in+MEMS+Devices.">Evaluation of Oxygen Plasma and UV Ozone Methods for Cleaning of Occluded Areas in MEMS Devices.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 19 (6), 1292-1298 (2010).</li><li>G&#246;zen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal+avalanche+ruptures+in+biological+membranes.">Fractal avalanche ruptures in biological membranes.</a> Nature Materials. 9 (11), 908-912 (2010).</li><li>Lobovkina, T., Dommersnes, P., Joanny, J. -. F., Hurtig, J., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zipper+Dynamics+of+Surfactant+Nanotube+Y+Junctions.">Zipper Dynamics of Surfactant Nanotube Y Junctions.</a> Phys Rev Lett. 97, (2006).</li><li>van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>G&#246;zen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+large+area+pores+in+supported+double+bilayers.">Repair of large area pores in supported double bilayers.</a> Soft Matter. 9 (10), 2787-2792 (2013).</li><li>G&#246;zen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+migration+of+molecular+lipid+films+as+a+contactless+fabrication+strategy+for+lipid+nanotube+networks.">Thermal migration of molecular lipid films as a contactless fabrication strategy for lipid nanotube networks.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3822-3826 (2013).</li><li>Sides, P. J., Hoggard, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Zeta+Potential+of+Planar+Solid+Surfaces+by+Means+of+a+Rotating+Disk.">Measurement of the Zeta Potential of Planar Solid Surfaces by Means of a Rotating Disk.</a> Langmuir. 20 (26), 11493-11498 (2004).</li><li>Nissen, J., Jacobs, K., R&#228;dler, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interface+Dynamics+of+Lipid+Membrane+Spreading+on+Solid+Surfaces.">Interface Dynamics of Lipid Membrane Spreading on Solid Surfaces.</a> Physical Review Letters. 86 (9), 1904-1907 (2001).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في المناقشة التالية، يتم وصف الخطوات الحاسمة والتعديلات المحتملة، والقيود المفروضة على البروتوكول. الخطوة الحاسمة الأولى هو الجمعية العامة المناسبة لدائرة المراقبة، نظراً إلى أن التصاق الإطار PDMS إلى السطح3 2س بن ضعيف أصلاً. في الحالة حيث الإطار لا يتقيد بالركيزة بشكل صحيح، سوف تسرب المحتوى من دائرة المراقبة والتجربة سوف يأتي إلى توقف. العوامل الرئيسية التي تعيق مناسبة ختم سطح والإطار 1) الافتقار إلى تنظيف شامل للإطار PDMS (إعادة استخدامها) و 2) الهواء فقاعات أحياناً الحصول على شرك بين الإطار والركيزة. وينبغي استخدام إطار PDMS أعدت حديثا أو تنظيفها جيدا. يجب أن تشطف الإطار قبل وبعد كل استعمال مع الكحول، تليها الشطف بماء دي وبلوودريينج مع النيتروجين. لا تتطلب أسطح3 2س ال أي التنظيف السابقة، نظراً لأنها ملفقة في بيئة تنظيم وتحفظ في حاويات مختومة حتى الاستخدام. نظراً لطبيعة مذبذب Al2O3، فإنه ينبغي أن لا تكون عرضه للحلول بقوة الحمضية أو الأساسية. ويمكن استخدام تصاميم أخرى لدائرة المراقبة، اعتماداً على إمكانية الحصول على الإعداد الفردية. الميزات الهامة لهذه الدائرة هي حرية الوصول إلى عينة السائل من أعلى مفتوحة ويفرط المواد الإطار فيما يتعلق بالحلول المستخدمة والعينات. أبعاد الدائرة أيضا عامل هام، كما أنها ينبغي أن تستوعب كمية من 0.5 إلى 1 مل. منذ السطوح المستخدمة عادة الحجم العادي كوفيرسليبس (24 × 60 مم)، معظمها يتحدد حجم الدائرة بسمك الإطار. على حد علمنا، الفواصل مع حجم وعمق يمكن أن تستوعب أحجام العينة عادة التعامل معها في هذا البروتوكول غير متوفرة تجارياً. ولذلك خصصنا فرعا في البروتوكول للتفاصيل من تلفيق والجمعية في إطار الدائرة عينة.
أن الخطوة الحاسمة الأخرى في هذا البروتوكول هو تبادل المخزن المؤقت. تحديا في هذه الخطوة هو التوقيت اللازم لإجراء هذا التبادل. نشر ملف عند الاتصال مع Al2O3 الركيزة الفورية، والتوسع المستمر دلبم يؤدي إلى تمزيق، تنتهي التجربة (الشكل 2أ، ب). ولذلك، انتشار ينبغي أن ترصد باستمرار، وتبادل المخزن المؤقت يجب أن يتم في الوقت مناسب. لا يمكن إجراء التبادل بعد التهيئة لنشر، بغية السماح للبقع غشاء الوصول حجم أمثل (100-200 ميكرومتر في القطر) بسرعة كبيرة جداً. من ناحية أخرى، تسبب التصاق مستمر على السطح الغشاء عالية التوتر، الأمر الذي يؤدي إلى تمزيق. وهكذا، غشاء جميع بقع في نهاية المطاف تمزق إذا نشر لا تنقطع. توقيت يمزق يختلف بالنسبة لكل تصحيح، نظراً لأنها تعتمد على الحجم والهيكل الداخلي لملف وإمكانية الحصول عليها الدهون فيه. ومن ثم، ينبغي أن يرتب لحظة التبادل إلى تيميبوينت فيه بقع تمزق الأمم المتحدة مع أحجام الأمثل تمثل أغلبية السكان. تحد آخر في الخطوة exchange المخزن المؤقت هو معدل الإزالة والإضافة للمخازن المؤقتة. وقد يؤدون هذا الاستبدال السريع جداً لها تأثير ضار على هياكل غشاء النهائية (الشكل 2ج-ه). نتائج الاستخراج المفرط من Ca2 +-حبيس المخزن المؤقت دون ترك طبقة رقيقة سائلة على الركازة، في غشاء المجففة ومشوهة لا رجعة فيه بقع (الشكل 2-ج). حتى إذا كان يتم الاحتفاظ كمية مناسبة من السائل على السطح، إضافة المفاجئ من المخزن المؤقت تشيلاتور-حبيس أيضا يسبب اضطراب الهياكل الغشاء. الشكل 2 د،ه يظهر مظهر نموذجي لغشاء هيدروديناميكالي تعطل بقع. تعطيل الخصائص المورفولوجية العامة لا تؤثر بالضرورة خصائص ديناميكية الهياكل النهائية (أي ترتيبات جديدة أنبوبي في المناطق المتبقية لا تزال تحدث). بيد أنه سوف يصبح من الصعب على مراقبة التحول المادي على هياكل مشوهة. على سبيل المثال، أنه في الشكل 2د، سيكون من الصعب على تحديد الاتجاه نحو الذي يسحب ملف دلبم.
واحد إمكانية إدخال تعديل على البروتوكول هو تكوين المادة الدهنية المستخدمة. انصب التركيز الرئيسي على فوسفوليبيدات التي تهيمن على التشكيل لائحة في الثدييات والخميرة16 (ﻫ. ز.، فوسفاتيديلتشوليني (PC)، فوسفاتيديليثانولاميني (PE)، وفوسفاتيديلينوسيتول (PI). أجريت التجارب الأصلي باستخدام الكمبيوتر و PI الخلائط4. في النتائج المقدمة، تم استخدام خليط من أجهزة الكمبيوتر ومخدر وهو مشتق من PE. ومع ذلك، وجدت ليست كل الدهون التعسفي التراكيب لإنشاء هياكل أنبوبية التي تم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول. عدد قليل من الدهن التحقيق تجريبيا الخلائط الأخرى تشمل استخراج قلب مجموع وفول الصويا استخراج القطبية واستخراج كولاي القطبية، وخلائط من جهاز كمبيوتر مع stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) بنسب متفاوتة والخلائط من سيرين PC-بي-بي-بوسفاتيديل (PS) بنسب متفاوتة. منذ هياكل أنبوبية غشاء تمتلك الانحناءات عالية وتحتاج إلى ترتيب خاص لجزيئات الدهن الفردية، فمن المتوقع أن ظاهرة لوحظت هي المادة الدهنية الخاصة بالتكوين.
آخر تعديل تطبيق هذا البروتوكول هو الأسلوب لتلفيق السطحية. هنا، استخدمت المدة اختﻻق كوفيرسليبس3 المغلفة2س ال. وهذا يختلف عن الأسلوب ترسب عنها أصلاً، رد الفعل اﻷخرق4. في حين يشير هذا إلى أن أسلوب تصنيع سطحي بديل لا يزال يمكن أن يؤدي إلى توبوليشن مثل ER، يبدو قيد هام واحد خصوصية المواد السطحية. طريقة نشر وقوة الالتصاق يعتمد اعتماداً كبيرا على خصائص المواد السطحية، التي تؤثر على عوامل مثل التفاعل الالكتروستاتيكي، ويتابيليتي، هيدروفوبيسيتي، وخشونة السطح. Al2O3 الأسطح توفر قوة الالتصاق الأمثل، والأفلام الدهن سواء إرفاق بشدة بما فيه الكفاية تنتشر كغشاء بلير دهن مزدوجة وفصل لشبكات أنبوبي الشكل عند إزالة أيونات Ca2 + . اختبرنا سابقا نفس التجربة مع SiO2، التي الحويصلات مولتيلاميلار انتشرت كغشاء bilayer دهن مزدوجة، ولكن لوحظ لا تشكيل شبكة أنبوبية عند إضافة تشيلاتورس17. إزالة المرفقات وتشكيل الأنبوبة يلاحظ فقط في ال2س3 أو محفوراً البلازما ال18. كشفت تحقيقاتنا أن المعلمة المساهمة مما يؤدي إلى هذه ظاهرة زيتا المحتملة من السطوح، لل وال التي كانت2س3 قريبة من الصفر (mV) و SiO2 سلبية إلى حد كبير. إمكانات زيتا البورسليكات يشبه SiO219؛ ولذلك، التصاق الدهن أفلام عن البورسليكات نفس القدر قوية ولا رجعة فيها. في الواقع، دهن مولتيلاميلار الخزان الاتصال مع الأسطح البورسليكات عادة ما يؤدي إلى تمزق الفوري وتشكيل واحد دهن بليرس20. Al2O3 السطوح المطلوبة لهذا البروتوكول لا تتوفر سهولة أو تجارياً. ومع ذلك، يمكن أمر مخصص من مصنعي الزجاج والركيزة التخصص. ينصح بشدة إمكانية الوصول إلى مرافق تنظيم مع معدات تصنيع الأغشية الرقيقة.
الأساليب القائمة الأخرى المنطلقة اختﻻق ER-مثل شبكات أنبوبي2،10 إشراك البروتينات، فضلا عن مدخلات الطاقة الكيميائية (على سبيل المثال-، أنشئ و ATP). ذكرت رابوبورت والزملاء2 تشكيل شبكات ER على الزجاج كوفيرسليبس في المختبر بخلط البروتينات الغشاء الانحناء موجودة في أوروبا، مع فوسفوليبيدات وأنشئ. العمل الذي يقوم به باتشاند et al. 10 يبين كيف يمكن إنشاء مثل هذه الشبكات أنبوبي ديناميكية باستخدام المحركات الجزيئية و ATP كمصدر للطاقة. لا يتطلب هذا البروتوكول قدم بروتينات الغشاء أو التحلل المائي للمركبات العضوية للطاقة. المكونات الأساسية فقط هي الركيزة الصلبة وشكلها. تنقية واستخلاص البروتينات غير مطلوبة. يوفر هذا البروتوكول، فيما يتعلق ببساطة جزيئات التأسيسي، أن أبسط نموذج ER.
مع هذا الأساسية، على أساس المادة الدهنية ER نموذج المنشأة، بناء التعقيد بإضافة المكونات المرتبطة بلائحة من الاهتمام، نظراً لأنها تمكن تحقيق آثار الفردية في النظام. مشابهة لشبكات ER الفعلية، أنابيب في النموذج دينامية. التصريف إلى والهجرة من البروتينات الغشاء المسمى، أو الجسيمات الفلورية في جميع أنحاء الشبكة أنبوبي، قد تعطي معلومات عن اتجاه حركة غشاء. تغليف ورصد السوائل داخل دلبم وأنابيب الفلورسنت أثناء التحول ووضع خرائط ممكنة لنقل المحتوى إينتراتوبولار قد تخدم كنقطة تركيز أخرى. أخيرا، قد اعتمد انتقال من نموذج ER 2D الناتجة من هذا البروتوكول نحو نموذج ER سلس ثلاثي الأبعاد من خلال تغليف الشبكات في أبنية المائية.

لائحة يضطلع بمهام حاسمة في الخلية البيولوجية بما في ذلك طي البروتين والدهون التوليف والكالسيوم اللائحة1،2. مورفولوجيا ER متأصل للمهام التي يؤديها. فهو يجمع بين رصات مستو والمجالات أنبوبي كثيفة الدينامية، التي تتفاعل مع سيتوسكيليتون باستمرار والخضوع لحركة مستمرة وإعادة ترتيب. وتشمل بعض يعيد البناء أن الخضوع لهياكل ER التحول المستمر بين أوراق مستو وأنابيب، وتكوين حويصلة من أو الانصهار التجويف ER، واستطالة الأنابيب الموجودة من قبل وسحب الأنبوب، والانصهار، والكسر3. هيكل غريب من شبكات أنبوبي نشاط غير المواتية. المسارات والآليات التي لائحة ينشئ ويحافظ على هذه المنظمة، وكذلك كيفية هذا يتعلق بوظيفتها ليست يفهم تماما4،5.
ومن المعروف أن لائحة الأعطال عند فإنه يفقد حالته التماثل الساكن، أسفر عن الإجهاد ER، شرط الناجمة عن زيادة في البروتين، وتراكم البروتينات تجمعات، أو التغيرات في توازن الأكسدة و Ca2 + . ER الإجهاد بدوره يسبب تشوه مورفولوجيا الطبيعية من عضية، على وجه التحديد مزعجة على شبكة المنظمة6،7. واستجابة، ينشط الخلية إليه إصلاح العودة إلى حالة التماثل الساكن. يمكن أن يؤدي الفشل في إصلاح إلى الخلية التي يسببها ER المبرمج، مما يسهم في العديد من الأمراض الأيضية والتنكسية مثل مرض الزهايمر ومرض السكري من النوع 2 ومرض باركنسون، والتصلب العضلي الجانبي وآخرون7، 8. البحث الحالي يستهدف تنظيم شبكات ER أنبوبي، وتركز العديد من الدراسات على تشكيل لائحة في المختبر2. القائمة بضعة نماذج2،،من910 تتطلب البروتينات الشروع والحفاظ على غشاء انحناء3،11 ومساعدة عضية التوصل إلى شكله. ومن الواضح أن النظم النموذجية التي تعكس بعض السمات الهيكلية والتنظيمية الرئيسية للائحة، وتوفير الوصول إلى الدراسات التجريبية المتقدمة كبيرة في الطلب.
نحن الحاضرين هنا الإجراءات لإعداد سهلة، خالية من الطاقة والحيوية في المختبر البروتين/الكيميائية نموذجا للائحة، توفير منصة أساسية لدراسة مورفولوجيا ER والمهام المرتبطة بها4. في هذا الأسلوب، يتم ملفقة نموذج ER مع اتباع نهج تصاعدي باستخدام عدد قليل من العناصر، التي يمكن أن تكون متكاملة الجزيئات ذات الاهتمام لإضافة تعقيد. وتمثل الشبكة ER بنية وديناميات. وعلاوة على ذلك، عكسها التحويل بين الغشاء مستو والأنابيب، تكوين حويصلة من أنابيب والانصهار الأنبوبة، انزلاق وتراجع يمكن كل ملاحظة. بالإضافة إلى العمل كنموذج التصاعدي للائحة الخلوية مفهومة، يمكن أن يكون الطريق دهني إلى شبكات أنابيب نانوية الموصوفة في هذا البروتوكول المنطبقة للباحثين دراسة التجميع الذاتي، نانوفلويديكس، وجزيء واحد والغروانيه الظواهر النقل وتدفق Marangoni، وسائر الميادين ذات الصلة. اللبنات فقط الجزيئية المستخدمة في أسلوبنا فوسفوليبيدات. البروتوكول يتطلب العمل المخبري القليل والمعدات الأساسية والوصول لإدراج العناصر الإضافية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Pear-shape flask 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Lenz Laborglasinstrumente</td>
			<td style="width:119px;">3.0314.13&#160;</td>
			<td style="width:167px;">In which the lipid mixture is prepared</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hamilton 5 mL glass syringe (P/N)</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">P/N81520</td>
			<td style="width:167px;">For transfer of the chloroform to beaker</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Custom large hub needle Gauge 22 S</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7748-18</td>
			<td style="width:167px;">Removable needle for syringe specified in row 3</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hamilton 250 &#181;L glass syringe</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7639-01</td>
			<td style="width:167px;">Used for transfer of lipids in chloroform to the flask</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Large hub Gauge 22 S</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7780-03</td>
			<td style="width:167px;">Removable needle for syringe specified&#160; in row 5</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hamilton 50 &#181;L glass syringe</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7637-01</td>
			<td style="width:167px;">Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Small hub Gauge 22 S</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7770-01</td>
			<td style="width:167px;">Removable needle for syringe specified in row 7</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Chloroform anhydrous (&#8805;99%)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td style="width:167px;">Used to complete the lipid mixture to a total of 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Soy L-&#945; Phosphatidyl choline lipid (Soy PC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids Inc</td>
			<td style="width:119px;">441601</td>
			<td style="width:167px;">phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids Inc</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td style="width:167px;">phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">L-&#945; Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids Inc</td>
			<td style="width:119px;">840044</td>
			<td style="width:167px;">alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and G&#246;zen, Biomaterials Science, 2017)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:167px;">Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Digital Dry Baths/Block Heaters</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fischer</td>
			<td style="width:119px;">88870006</td>
			<td style="width:167px;">To warm glycerol in order to decrease its viscosity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycerol for molecular biology (&#8805;99%)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;">For lipid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS buffer&#160; (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to prepare the lipid suspension&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TRIZMA base, primary standard and buffer (&#8805;99%)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;">Used to prepare PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Potassium phosphate tribasic, reagent grade (&#8805;98%) (K3PO4)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5629</td>
			<td style="width:167px;">PBS buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (&#8805;99,5%) KT (MgSO47H2O)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td style="width:167px;">PBS buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">795488</td>
			<td style="width:167px;">PBS buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td style="width:167px;">PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic cleaner USC-TH</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">142-0084</td>
			<td style="width:167px;">Ultrasonication of rehydrated lipids</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rotary evaporator&#160; -&#160; B&#252;chi rotary evaporator Model R-200&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z626797&#160;</td>
			<td style="width:167px;">For evaporation of chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pressure meter - Vacuum regulator IRV-100</td>
			<td style="width:71px;">SMC</td>
			<td style="width:119px;">IRV10/20</td>
			<td style="width:167px;">For controlling the pressure value during lipid dehydration</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">&#160;HEPES &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;">HEPES-buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, &#8805;98% (titration) (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">S3014</td>
			<td style="width:167px;">HEPES-buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:130px;width:216px;">Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;96.0% (CaCl2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">C5670</td>
			<td style="width:167px;">To prepare Calcium-HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Used to promote the formation of tubular networks.&#160; Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">&#160;1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid tetrasodium salt &#8805;95% (HPLC) (BAPTA-Na4)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14513</td>
			<td style="width:167px;">Chelator-HEPES buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30620</td>
			<td style="width:167px;">Basic solution used to adjust the pH of the buffers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pH meter accumet&#8482; AE150 pH</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1544693</td>
			<td style="width:167px;">Used to measure the pH of all buffers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">HECH41042012</td>
			<td style="width:167px;">6 cm, used for making the PDMS sheet</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Potassium hydroxide ACS reagent, &#8805;85%, pellets (KOH)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:167px;">To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropanol prima ren 99.5%</td>
			<td style="width:71px;">Antibac AS</td>
			<td style="width:119px;">600079</td>
			<td style="width:167px;">KOH solution ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Heating and drying oven - venticell</td>
			<td style="width:71px;">MMM Medcenter Einrichtungen GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MC000714</td>
			<td style="width:167px;">For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dichlorodimethylsilane &#8805;99.5%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">440272</td>
			<td style="width:167px;">Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vacuum pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-79202-05</td>
			<td style="width:167px;">Connected to desiccator&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Dow corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">24236-10</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Kit to make PDMS solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone elastomer base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable scalpel</td>
			<td style="width:71px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:119px;">11798343</td>
			<td style="width:167px;">Used to cut the PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">Cover slips</td>
			<td style="width:71px;">Menzel -Gl&#228;ser&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MEZ102460</td>
			<td style="width:167px;">24x60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Atomic layer deposition system</td>
			<td style="width:71px;">Beneq</td>
			<td style="width:119px;">TFS200 (model number)</td>
			<td style="width:167px;">Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Ellipsometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">J.A. Woollan Co.</td>
			<td style="width:119px;">Alpha-SE (model name)</td>
			<td style="width:167px;">System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser scanning confocal&#160; microscope&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica TCS SP8 X</td>
			<td style="width:167px;">Microscope used for visualization of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Objective 40x, 1.3 NA</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">1550635</td>
			<td style="width:167px;">Used for visualization of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">White light laser source</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica TCS SP8 X</td>
			<td style="width:167px;">For excitation of the membrane fluorophore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spontaneous formation and rearrangement of artificial lipid nanotube networks as a bottom-up model for endoplasmic reticulum

نحن نقدم طريقة ملائمة لتشكيل نموذج عضية هيكلية التصاعدي هيولى (ER). النموذج يتكون من الأنابيب النانوية ليبيديك العالية الكثافة التي، من حيث التشكل وديناميات، تذكرنا ER. الشبكات مستمدة من بلير مزدوجة فسفوليبيد غشاء بقع التمسك شفافة Al2O3 الركازة. هو وساطة الالتصاق من Ca2 + في المخزن المؤقت المحيطة. يتسبب نضوب اللاحقة من Ca2 + عن طريق باتا/يدتا انكماش الغشاء، أسفر عن تشكيل شبكة أنابيب نانوية الدهن عفوية. الأسلوب فقط تضم فوسفوليبيدات والأسطح ميكروفابريكاتيد لتشكيل نموذج ER بسيطة ولا تتطلب إضافة البروتينات أو الطاقة الكيميائية (مثلاً، أنشئ أو ATP). على النقيض من مورفولوجية 3D هيولى الخلوية، هذا النموذج ثنائي الأبعاد (وأن كان يتم الاحتفاظ بإبعاد أنبوب نانوي، والهندسة، وهيكل، وديناميات). هذا نموذج فريد من نوعه في المختبر ER تتكون من عدد قليل من العناصر، من السهل بناء، ويمكن أن يلاحظ تحت مجهر خفيفة. يمكن أن يكون هيكل الناتج زينت المزيد للحصول على وظائف إضافية, مثل إضافة البروتينات المرتبطة ER أو الجسيمات دراسة الظواهر النقل بين الأنابيب. الشبكات الاصطناعية الموصوفة هنا هي النماذج الهيكلية المناسبة للخلوي ER، مورفولوجيا المميزة الفريدة التي أثبتت أن تكون متصلة بوظيفتها البيولوجية، بينما التفاصيل المتعلقة بتشكيل المجال أنبوبي و ترتيبات جديدة داخل ما زالت لا تماما مفهومة. ونلاحظ أن هذا الأسلوب يستخدم ال2س3 مجهرية رقيقة الفيلم المغلفة كوفيرسليبس، التي هي متوفرة تجارياً وإنما تتطلب الأوامر الخاصة. ولذلك، فمن المستحسن أن يكون الوصول إلى مرفق ميكروفابريكيشن لإعداد.

تعليق المادة الدهنية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1 من البروتوكول والمستخدمة في التجارب التي تحتوي على نوعين رئيسيين من حويصلات: ملفس وجوفس. الشكل 1 أ-1F يظهر ليزر المسح ميكروجرافس [كنفوكل] من الحويصلات في العينة الأولى التي شيدت في 3D. الشكل 1 ويبين A-1_C ملف (إيداع الدهنية) في xyz و xz yz الطائرات، على التوالي. الشكل 1 د-1F يوضح آراء مماثلة حويصلة أونيلاميلار العملاقة (جيوف). الجزء الداخلي من جوفس، التي تفتقر إلى مولتيلاميلاريتي، أجوف؛ ومن ثم فالمواد الدهنية لنشر محدودة إلى حد كبير. ولذلك، الخزانات الدهون مفيدة فقط لهذا الأسلوب هي ملفس.
عندما يتم نقل تعليق المادة الدهنية إلى دائرة المراقبة تتضمن Ca2 +-هيبيس المخزن المؤقت (الشكل 1ز)، بدء ملفس (الشكل 1A-1_C) ليستقر على السطح3 2س ال. عند الاتصال، الحويصلات تنضم إلى السطح، ويبدأ غشاء بلير دهن شقة مزدوجة دائرية (دلبم) لنشر من كل ملف على دعم الصلبة (الشكل 1ح-1J). ملف يعمل كخزان ينص الدهون دلبم الآخذة في الاتساع باستمرار. الغشاء القاصي بلير (العلوي)، وفيما يتعلق بدعم متين، متصل بالغشاء بلير الدانية (السفلي) على طول محيط الحافة الدائرية، تنفيذ اقتراح متداول (الشكل 1أنا). يتم وضع بليرس اثنين رفضا قاطعا فوق بعضها البعض، وجود سوى طبقة رقيقة سائلة مغلفة بينهما. أثناء نشر، تتمسك الغشاء الدانية باستمرار إلى السطح التأييد تحتها، بينما يتم سحبها الغشاء القاصي أفقياً عند الحواف على حافة الغشاء الدانية الآخذة في التوسع. نشر دلبم هو وساطة من Ca2 +، الذي يعمل بمثابة عامل فوسوجينيك بين المجموعات دهن الرأس من الغشاء الدانية والركيزة الصلبة4.
وإذا استمر انتشار لفترات طويلة، التوتر الغشاء الزيادات، مما أدى إلى تمزق (الشكل 2ألف و 2 باء). بعد هذه النقطة، يمكن لم يعد الناجمة عن انكماش الغشاء، هو أمر ضروري لخلق مورفولوجية أنبوبي ER. ولذلك، من المهم أن نعترف تمزق الأغشية. حيث يتم فلوريسسينتلي المسمى الدهون في تجاربنا، يمزق يمكن مباشرة ملاحظة. مؤشر رئيسي لتمزيق هو الانخفاض الكبير في كثافة fluorescence في تمزق المنطقة (الشكل 2ألف و 2 باء)14. يمزق نتيجة لزيادة التوتر وتشكيل المسام اللاحقة في غشاء البعيدة. المناطق التي تمزق تحت مجهر فلوري، ولذلك يحمل نصف كثافة الانبعاثات (بلير الدانية واحد) من مناطق المستقرات (بلير مزدوجة)14 (الشكل 2ب). أثناء تشكيل المسام، ترحيل مواد الغشاء، الذي كان في البداية المتمركزة في المناطق التي تمزق، إلى حواف نشر التصحيح. يؤدي هذا بدوره نمو منطقة التصحيح الشامل. ولذلك، يمكن أيضا ملاحظة توسع سريع في كفاف التصحيح دائرية أثناء يمزق.
لتجنب نمو واسع النطاق مما أدى إلى تمزق البقع، فورا بعد منطقة التصحيح دائرية تصل إلى 100-200 ميكرون، تتم إزالة Ca2 +-حبيس المخزن المؤقت بلطف مع ماصة تلقائي حتى طبقة رقيقة من بقايا السائل على السطح. ثم يتم إضافة المخزن المؤقت تشيلاتور-حبيس بلطف إلى الدائرة الشروع في سحب (الشكل 1ك). جفاف كامل للعينة (الشكل 2ج) أو التبادل السريع للمخازن المؤقتة (الشكل 2د و 2E) يسبب اضطرابات أو تمزيق أو تشوه بقع. إضافة chelators تدريجيا يزيل Ca2 + من المسافة بين المياه السطحية والغشاء. المخزن المؤقت تشيلاتور-هيبيس يصل تدريجيا إلى الفضاء فيما بعد الركيزة bilayer، بدءاً من محيط التصحيح الغشاء الدهني. ولذلك، يبدأ من حواف دائرية التصحيح إزالة مواقع التثبيت وتنتشر إلى الداخل (الشكل 1ك-1Q). نتيجة ديبينينج، يبدأ الغشاء الدهني في فصل وسحب من الداخل الحواف، تتقدم نحو ملف في المركز. تؤدي عملية سحب إلى واجهة جديدة لتطوير شبكات أنبوبي lipidic4 (الشكل 1لتر-1Y) بشكل حيوي. المناطق المستمرة للتثبيت، التي لا تسمح للغشاء لفصل تماما، تبقى على جدولة السطحية ونوكليتي، مما يؤدي إلى شبكة متفرعة طويلة من الأنابيب النانوية. (الشكل 1لتر-1Y). ولوحظت تعلق الرفع المستمر، وكذلك سحب الأنابيب النانوية الدهن مع مرور الزمن نتيجة عملية تدريجية الخلبية. هذا كوارسينينج وإعادة ترتيب فروع الشبكة دوراً رئيسيا في السلوك الديناميكي للشبكات أنبوبي، التي تشبه لائحة السلس.
الشكل 1 لام-1Y يظهر ميكروجرافس من أنبوب نانوي الشبكات التي تم الحصول عليها في البروتوكول. الشكل 1 L ملحوظ عن قرب المنطقة في الشكل 1م في إطار أبيض. المناطق مشرق الأحمر مستمرة في الشكل 1لتر و 1 م هي الكسر التراجع من دلبم (ملحوظ مع خط متقطع أزرق في الشكل 1م). صورة مجهرية لشبكة أنبوبية الشكل 1ن و 1O هو مقلوب لزيادة التباين. الشكل 1 P و 1Q يصور الحد كثافة أنبوبي في منطقة غشاء على مدى 3 ساعات و 20 دقيقة. انخفاض كثافة أنبوبي يحدث بسبب ديبينينج تدريجي يتبعه تراجع دلبم من على سطح الأرض خلال الفترة التجريبية. مع مرور الوقت، العدد من النقاط التي تحررت من تعلق الزيادات، مما يؤدي إلى ترتيبات جديدة وتخفيض المساحة المشمولة بأنابيب (الشكل 1ف و 1Q). يرجع سببها ترتيبات جديدة أنبوبي تدنية الطاقة الحرة السطحية أنبوب نانوي الدهن علقت بين اثنين من النقاط الثابتة. أنها راسخة أن الطريقة الأكثر فعالية لتقليل الطاقة السطحية من أنبوب نانوي الحد طول15. ولذلك، عند إزالة المثبتة منطقتي فوسوجينيك، الذي عقد في البداية الأنابيب النانوية على السطح،، الأنابيب النانوية الشريحة وترتيب نفسها عفويا، اعتماد على طول الحد أدنى. تتسبب هذه ترتيبات جديدة على تغطية انخفاض تدريجيا من السطح من الأنابيب النانوية (الشكل 1ف و 1Q).
ونحن لا يمكن تصور Ca2 +-بوساطة نقاط التثبيت، ولكن علينا إنشاء مواقعها كالنقاط التي يكون فيها أنابيب يتحول المحطة الطرفية أو حادة. المنعطفات الحادة يشار إلى الخامس-تقاطعات15 أو نقاط التحول بسبب التحول المفاجئ في اتجاه المحاذاة أنبوب (الأسهم الخضراء في الشكل 1R و 1 X). ويمثل نقطة النهاية محطة الأنبوب، مما يحول دون التراجع (الأسهم البرتقالي في الشكل 1X) الأنبوب. وخلال عملية إعادة تنظيم، التصرف نشاط مواتي من الأنابيب التي اعتبرت "Y-تقاطعات" أو "3-طريقة تقاطعات"، تظهر. Y-التقاطع يربط ثلاثة أنابيب مع حوالي 120° الزوايا بين كل أنبوبة، حيث يمكن تأمين طول أنبوب مجموع أقصر. ذ-الوصلات، التي لا تملك نقطة نهاية، وبدلاً من ذلك يتم وضعه بين الأنابيب النانوية متعددة، هي غير مثبت. هذا هو نوع Y-مفرق الوحيدة التي يمكن أن تؤدي إلى انزلاق (الأسهم الزرقاء، الشكل 1R). كما هو مبين في الشكل 1R و 1S، ينحدر من Y-تقاطع على طول نتائج تقاطع غير مستقرة جداً في تشكيل الفردية اثنان تقاطعات Y (الأسهم الزرقاء في الشكل 1S). يمثل خط أبيض متقطع فرضه على الشكل 1S كفاف الجزء شبكة أنبوبية في الشكل 1R. جزء صغير من Y-الوصلات تمتلك محطات نهاية (السهم الأصفر في الشكل 1تي) الذي، على مر الزمن، في نهاية المطاف سحب (الشكل 1يو). تحويل الخامس-تقاطع إلى واحد، يمكن ملاحظة أنبوب مستقيم ديبينينج من نقطة التقاطع لأجزاء الخط اثنين، وسحب أحد أنابيب تشكيل الشكل الخامس في الشكل 1V و 1 وات و الشكل 1X و 1Y، على التوالي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58923/58923fig1v3.jpg"> الشكل 1 : تحويل الدهون الودائع للشبكات مثل ER أنبوبي. (واو) ليزر المسح ميكروجرافس [كنفوكل] من الحويصلات في العينة الأولى، التي شيدت في 3D. (أ-ج) دهن مولتيلاميلار حويصلة (ملف، إيداع الدهنية) في xyz و xz yz طائرات، على التوالي. (د-و) آراء مماثلة لحويصلة أونيلاميلار العملاقة (جيوف). الجزء الداخلي من جوفس جوفاء، مما يجعل المواد الدهنية لنشر محدودة إلى حد كبير. خزانات الدهون مفيدة لهذا الأسلوب هي بالتالي ملفس-(ز) شكل توضيحي لدائرة المراقبة التي شنت على مجهر مقلوب التي تودع في المخزن المؤقت والدهون. تتألف الدائرة من PDMS الإطار انضمت إلى ساترة3 المغلفة2س ال، توفير أعلى المجلد مفتوح. (ح-ي) رسم توضيحي لظاهرة انتشار ملف حضور Ca2 +. (ح) عند الاتصال مع Al2O3، ينتشر ملف تلقائياً في شكل تعميما، الدهن بلير غشاء مزدوج (دلبم). (ط) عرض الجانب التخطيطي دلبم في الطائرة xz، حيث تؤدي أطراف الاقتراح المتداول. ملف (د = 5-15 ميكرون) ودلبم (سمك = 10 نيوتن متر) لا يتم رسمها بمقياس. (ي) صورة مجهرية [كنفوكل] من دلبم نشر من عرض أعلى. (ك) يصف الخطوة الرئيسية لهذا البروتوكول، حيث يتم تبادل المخزن المؤقت إلى واحدة تحتوي على Ca2 + خالب وكلاء ويحول دون انتشار، مما تسبب في تراجع دلبم لملف ويؤدي إلى تشكيل الأنابيب النانوية الدهن. (ل-Y) ميكروجرافس من أنبوب نانوي الشبكات التي تم الحصول عليها باستخدام الأسلوب هو موضح. (ل) عن قرب المنطقة في (م) علامة في إطار. وتمثل المناطق مشرق الأحمر مستمرة في (لام وميم) دلبم (ملحوظ مع خط متقطع أزرق أيضا في م). هو عكس صورة مجهرية من شبكة أنبوبية في (N و O) زيادة التباين. (P و Q) تصوير للحد كثافة أنبوبي في منطقة غشاء على مدى 3 ح و 20 دقيقة (ص ص) الممثل ترتيبات إعادة أنبوبي. (R و S) انزلاق (T و U) الانتقال من Y-تقاطع إلى الخامس-تقاطع طريق سحب واحد نقطة النهاية، و (V و W) إزالة التثبيت من نقطة تحول، وأسفر عن القضاء على مفترق الخامس. (س وص) سحب نقطة النهاية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58923/58923fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58923/58923fig2.jpg"> الشكل 2 : نتائج سلبية محتملة. (أ وب) يمزق الغشاء البعيدة نظراً لفترة طويلة وقت الانتظار قبل الصرف من المخازن المؤقتة. مجالات تمزق، حيث يصبح الغشاء الدانية مرئية، تظهر كمناطق مظلمة بالمقارنة مع مناطق الغشاء المتمزق البعيدة. الداخلي للفريق ب يبين شدة الضوء على طول السهم الأزرق على صورة مجهرية. كثافة المناطق تمزق الغشاء (بلير الدانية مفرد يصبح مرئياً) تناظر نصف كثافة الغشاء المتمزق (بلير القاصي مزدوجة). (ج) مظهر تصحيحًا الدهن جافة تشكلت نتيجة لإزالة جميع السائل من دائرة المراقبة. (دال وهاء) اضطراب الغشاء بالتبادل السريع للمخازن المؤقتة عبر ماصة التلقائي. في (د)، قد انقسم ملف ملفس 2، مما يؤدي إلى تصحيح دهن غير دائرية، ومشوه. (ﻫ)، ينعكس نمط التدفق (الأسهم)، تم إنشاؤها بواسطة حقن قوية من المخزن المؤقت تشيلاتور-هيبيس، على هيكل غشاء توبولاتيد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58923/58923fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum at JoVE.com

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

المدعومة من الصلبة، خالية من البروتين، وضعف فسفوليبيد بلير الأغشية (دلبم) يمكن أن تتحول إلى شبكات أنابيب نانوية معقدة ودينامية في الدهون ويمكن أن تكون بمثابة 2D نماذج ينطلق من هيولى.

تشكيل عفوية وإعادة ترتيب شبكات أنابيب نانوية اصطناعية الدهن كنموذج التصاعدي هيولى

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

يحتوي الـ إندوبلاسميكي تيكولوم على مجال أنبوبي ديناميكي يتفاعل باستمرار مع الهيكل الخلوي الذي يخضع للحركة المستمرة وإعادة الترتيب. كيف تقوم وحدة ER بإنشاء هذه المؤسسة والحفاظ عليها لم يتم فهمها بالكامل بعد. هنا نقدم مسألة مريحة لتشكيل نموذج من القاعدة إلى القمة الهيكلية لـ ER ، والذي يتكون من نظام غشاء خال من البروتين مدعوم من المواد الصلبة يمكن نقله إلى شبكات الأنابيب النانوية الدهنية المعقدة.الهيدروفيليك هو مركب عضوي للطاقة. لا يلزم تنقية البروتين واستخراج البروتين. المكونات الأساسية الوحيدة هي الركيزة الصلبة والفوسفولبيدات التي توفر نموذج ER الأساسية.نقل حلول الدهون الذائبة إلى قارورة مقلوب 10 ملليلتر على شكل الكمثرى إضافة إلى كمية إجمالية قدرها 3000 ميكروغرام من الدهون و 300 ميكرولترات من الكلوروفورم. ثم قم بتوصيل القارورة بمبخر دوار وضعه بإمالة 45 درجة. قم بتدوير القارورة عند 24 دورة في الدقيقة داخل حمام مائي عند درجة حرارة 23 درجة مئوية لمدة ست ساعات مع انخفاض ضغط الهواء لإزالة الكلوروفورم ببطء وبشكل كامل.بدء تقليل الضغط مباشرة بعد بدء التناوب من قبل خطوات من 20 كيلوباسكال كل دقيقتين حتى يصل الضغط 20 كيلوباسكال. بعد ست ساعات، ووقف التناوب وزيادة ضغط الهواء مرة أخرى تدريجيا من قبل خطوات من 20 كيلوباسكال كل دقيقتين حتى تصل إلى 100 كيلوباسكال. إزالة القارورة من المبخر الدوار وإضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني و 30 ميكرولترات من الجلسرين.دوامة بلطف قارورة إلى حل الجلسرين. استخدام سدادة الزجاج ضيق الهواء لختم قارورة تحتوي على الدهون. تخزين القارورة في الثلاجة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لالتهاء وتورم في الأفلام الدهنية.في اليوم التالي، sonicate الدهون مع حمام الماء بالموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة وعلى تردد 35 كيلو هرتز حتى تحقيق تعليق الدهون قليلاً تعكر موحدة. يمكن أن يستغرق Sonication حوالي 10 إلى 30 ثانية. صوتنة طويلة تنتج الحرارة وتضر تشكيل vesical.هذه الخطوات تسفر عن تعليق يحتوي على نوعين من الهياكل الحتوية. Vesicles multilamellar وهايوليات unilamellar العملاقة. للتخزين، تقسيم تعليق الدهون إلى 100 aliquots ميكرولتر باستخدام ما مجموعه 30 أنابيب microcentrifuge.تخزين aliquots في الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية. فلاش تجميد مع النيتروجين السائل ليس من الضروري. ذوبان تعليق الدهون ونقل قطرة 4 ميكرولتر من التعليق على شريحة المجهر الزجاجي نظيفة أو زلة الغطاء.بعد 20 دقيقة من جفاف، وسوف تنهار قطرات في فيلم دائري مسطح من الدهون التي هي مرئية للعين. إعادة هيدرات الفيلم الدهون مع ملليلتر واحد من عازلة HEPES لمدة 3 دقائق. إعداد غرفة المراقبة مع أعلى مفتوحة للسماح لتبادل العازلة عن طريق ماصة التلقائي، وهو مطلوب لبدء تحويل ER كما هو مفصل في بروتوكول النص.بعد إزالة لوح PDMS المعالجة مع ملعقة، استخدم مشرط لقطع الإطار إلى الأبعاد والهندسة المناسبة لفتح المتاحة في مرحلة المجهر. أبعاد 1.5 في 1.5 في 0.5 سنتيمتر مناسبة لمعظم الاجهزة. جلب الجانب السلس من إطار PDMS في اتصال مع الجانب النشط من السطح حيث يتواجد فيلم أكسيد الألومنيوم والضغط بلطف لدفع الإطار والسطح ضد بعضها البعض لجعلها تلتزم.ملء غرفة المراقبة فورا مع الكالسيوم HEPES العازلة. لا تملأ حجم الغرفة بأكمله للسماح بإضافة الدهون المُعاد تهيؤها في الخطوة اللاحقة. ضع الغرفة على مرحلة المجهر confocal.نقل المواد الدهنية rehydrated، والآن تعليق تحتوي على vesicles العملاقة، إلى الغرفة مع ماصة المراعي البلاستيكية. انتظر 10 إلى 20 دقيقة للسماح للحرفيات التمسك الركيزة وتنتشر عبر السطح. يبدأ الانتشار مباشرة بعد ترسب الدهون على السطح.قبل أن ينتشر الدهون هيكل تبادل العازلة يجب أن يتم بلطف ممكن إزالة سريعة أو إضافة سريعة من الاضطرابات العازلة هياكل الدهون على السطح. بعد مراقبة ينتشر الدهون متعددة، وإزالة ببطء المخزن المؤقت المحيط عن طريق ماصات التلقائي. مثل هذا أن يبقى فقط فيلم عازلة رقيقة على الجزء السفلي.الحرص على تجنب الإزالة السريعة. انتقل إلى تبادل المخزن المؤقت المحيط بملء غرفة المراقبة ببطء بمخزن chelator HEPES باستخدام ماصة تلقائية. تجنب الإضافة المفاجئة.الخطوة النهائية تسفر عن شبكات نانوية ديناميكية شكلت نتيجة للتخلص من الدبابيس المستحثة و التراجع من DLBM إلى vesicles متعدد البرام. تظهر هنا صور صغيرة لشبكات الأنابيب النانوية التي تم الحصول عليها في البروتوكول. في هذه الصورة، المناطق الحمراء الساطعة المستمرة هي الجزء المتراجع من DLBM، الذي تم وضع علامة عليه بخط أزرق متقطع.يظهر هنا، هو micrograph من شبكة أنبوبي التي تم عكسها لزيادة التباين. هنا ، يتم إظهار انخفاض الكثافة الأنبوبية على منطقة الغشاء على مدار ثلاث ساعات و 20 دقيقة. يحدث انخفاض الكثافة الأنبوبية بسبب إزالة الدبابيس التدريجية التي يتبعها تراجع DLBM من السطح.ويمكن تحديد مواقع نقاط التثبيت بوساطة الكالسيوم باعتبارها النقاط التي يكون فيها الأنبوب محطة أو المنعطفات الحادة. ويشار إلى المنعطفات الحادة كـ V تقاطعات أو نقاط تحول بسبب التحول المفاجئ في اتجاه محاذاة الأنابيب. نقطة النهاية يمثل نهاية الأنبوب الذي يمنع أنبوب من التراجع.إذا استمر الانتشار لفترات طويلة ، يزداد التوتر الغشاء مما يؤدي إلى تمزقات. منذ التسمية الفلورية الدهون fluorescently، ويمكن أن يلاحظ مباشرة تمزق. ومن المؤشرات الرئيسية للتمزق الانخفاض الكبير في شدة الفلورنس في المنطقة الممزقة.الجفاف الكامل للعينة أو التبادل السريع للمخازن يسبب اضطرابًا أو تمزقًا أو تشوهًا للبقع. يمكن بناء تعقيد النموذج عن طريق إضافة المكونات المرتبطة ER مثل بروتينات الدهون. ويمكن أيضا أن يكون هذا النموذج ضمني لدراسة التجميع الذاتي، نانولويدييكس، تدفق المارانغوني، وظواهر النقل.الكلوروفورم هو سام ومتقلب للغاية وينبغي دائما أن تعامل تحت غطاء محرك الدخان ومع المعدات الواقية الشخصية المرتبطة بما في ذلك قفازات مختبر خلات البولي فينيل، ومعطف المختبر، ونظارات السلامة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

خلفية رفض الإسفار في الرنين وMicrospectroscopy رامان العفوي

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

التوليف من البروتين الاصطناعي Intein بوساطة هيدروجيل

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

تحليل غشاء أنبوبي الشبكات في القلب Myocytes من أتريا والبطينات

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

صورة موجهة، التصنيع القائم على الليزر من شبكات ميكروفلويديك المستمدة الأوعية الدموية.

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...