Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Dette arbejde blev muliggjort af tilskud fra det nationale Institut for almen medicinsk videnskab (NIGMS) (5P20GM103427), en del af National Institutes of Health (NIH)

1. medier forberedelse
<ol><li>Forberede minimal medier (MM) med 0,25% glukose. For at gøre 1 L mm med 0,25% glukose, tilsættes 200 mL sterilt M9 saltopløsning, 2 mL sterilt 1 M MgSO4, 100 µL i sterile 1 M CaCl2og 12,5 mL sterilt 20% (w/v) glukose til vand (dH2O) på en endelige mængden af 1 L.</li>
	<li>Overføre krævede medier til en steril flaske med steril teknik. Forberede det beløb, der kræves afhængigt af antallet af kanaler bliver brugt. Typisk, hver kanal kræver 200 µL til grunding, 300 µL til såning og 1300 µL til 24 h eksperiment.</li>
	<li>Placere flasken i en inkubator eller vand bad sat på den eksperimentelle temperatur. Medierne bør være på eksperiment temperatur før brugen for at undgå boblerne danner i microchannels.</li>
</ol>2. udarbejdelse af en Overnight og eksperimenterende kultur af PA01-EGFP.
<ol><li>Placer 15 mL af eksperimentelle medier i en steril sidearm kolbe og podes med én eller to kolonier fra en agar plade stribet med PA01-EGFP. Udvid kultur for 12-16 h på en inkubator/shaker bord på 37 ° C og 180-220 rpm.</li>
	<li>Måle OD600 overnight kultur. Når OD600 er større end 0,80, fortyndes den overnight kultur til den endelige OD af 0,8 bruger friske MM. sted den eksperimenterende kultur i en inkubator eller vandbad ved 37 ° C indtil brug for såning mikrofluid kanaler. Kontrollere OD600 igen umiddelbart før såning for at sikre, at det ikke har ændret sig væsentligt fra målet OD600, 0,8 i dette tilfælde.</li>
</ol>3. udstyr start
<ol><li>Konfigurere systemet station ifølge brugervejledning, svarende til opsætning i figur 1. For at undgå en fejl i tilslutning af instrumentet til softwaren, tænde instrumentet i følgende rækkefølge: PC arbejdsstation Fluorescens-modulet. Sørg for, at fluorescens lukkeren er på (blåt lys af udløserknappen på) Hardware controllere Imaging system Controller (Se Tabel af materialer) CCD kamera Imaging Station (mikroskop) Bemærk: Temperatur af opvarmet plade bør justeres til den ønskede temperatur, eksperimenterende.</li>
	<li>Start programmet kontrol og Indtast plade nummeret på etiketten på den side af pladen. Bemærk: Efter kontrol program starter der vil være to separate programvinduer, for den software, der styrer mikroskop/billedbehandling software og for den kontrolmodul, der styrer pumpen og grænsefladen godt-plade. Dette er vist i Figur S1, hvor menuen "Multi Dimensional erhvervelse" er åben på toppen og kontrolmodulet er indstillet til en autorun på bunden.</li>
</ol>4. priming og såning mikrofluid plade
Bemærk: Priming, såning, bakteriel vedhæftet fil og vækst er illustreret i figur 3.
<ol><li>Fjerne 48-godt mikrofluid pladen fra emballage og sørg for at berøre glasoverfladen i bunden af pladen. Rene glas dias i bunden af pladen godt med en linse væv, en fnugfri klud eller en lav-lint tørre.</li>
	<li>For at prime mikrofluid kanaler, afpipetteres 200 µL af 37 ° C MM i output godt, være omhyggelig med at undgå boblerne. Pladen anbringes i stadiet plade og tørre interface med ethanol, giver mulighed for at tørre, før forsegling det på plade scenen.</li>
	<li>I Manuel tilstand på den kontrolmodul, skal du indstille væske som LB ved 37 ° C og Max Shear på 5,00 dyne/cm2. Klik på output brøndene for at aktivere flow fra output til input, priming af kanaler. Efter 5 min grunding, pause flow til at forberede sig til såning. Forsigtigt fjerne pladen fra scenen og tilsæt resterende medier fra output, men ikke at fjerne nogen af medier fra den inderste cirkel, der fører til mikrofluid kanalerne.</li>
	<li>For at frø de eksperimentelle kanaler, først afpipetteres 300 µL af MM ind i input godt efterfulgt af pipettering 300 µL af bakteriekulturen til output godt ind i output godt. Læg pladen tilbage i plade scenen og sørg for at tørre grænsefladen før du placerer det på tallerkenen.</li>
	<li>Kontrolmodulet, fokusere på en enkelt kanal ved hjælp af de levende kamera foder efter at placere plade scenen på mikroskop-scenen. Mens visuelt overvågning af den levende foder, genoptage flow på 1,00-2,00 dyne/cm2 for ca 2-4 s at tillade celler til at indtaste den eksperimentelle kanal men ikke i de serpentine kanaler. Forlade pladen på stadiet temperatur kontrolleret for 1 h til celle vedhæftet fil. Under 1 h inkubation, kan kontrolmodul og Montage softwaren være sat op for autorun (trin 5). Bemærk: Mængden af tid til såning varierer med medier og organisme, så det bør overvåges nøje af den levende foder indtil optimeret og bruges som en generel tidsramme. Såning i hele pladen kan variere, som ville kræve mere tid anvendt flow til visse kolonner af kanaler for komplet såning.</li>
	<li>Efter perioden vedhæftet fil, forsigtigt fjerne pladen fra scenen og afpipetteres bakterier fra output først at undgå at forstyrre kanalen. Med en ny pipette tip, skal du fjerne medier fra input brøndene.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig3.jpg"> Figur 3 : Eksperimenterende oversigt over priming, såning og fastgørelse af PA01-EGFP i mikrofluid kanalerne. Priming, såning og vedhæftet fil er skitseret. Det første trin i priming kræver friske medier introduceret til output. De seeding indebærer lige mængder af medier og bakteriel kultur i input og output wells, henholdsvis. Kultur bør ikke passere visning segment af den eksperimentelle kanal (rød linje) til at undgå tilstopning af serpentine kanaler. Efter Inkubationstiden er overstået, flyder friske medier løbende fra input, til visning kammer og til stikkontakten. Dette indleder vedhæftet fil og vækst af bakterielle biofilm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
5. indstilling af Software
<ol><li>Softwaren, Åbn "Flere dimensionelle erhvervelse" for at kontrollere mikroskop billede erhvervelse. Under menuen "Main" Vælg "Timelapse", "Flere fase positioner" og "Flere bølgelængder" (Figur S1A).<ol>
<li>Opsætning af gemme indstillinger, skabe et simpelt Navn, og sørg for, at Increment basisnavn hvis filen findes er markeret. Klik på Vælg mappe for at vælge den mappe, hvor alle filer vil blive gemt. Omfatte væsentlige detaljer af eksperimentet i beskrivelsen.</li>
		<li>Under fanen Timelapse justere varigheden af den eksperimentelle til 24 h. For at kontrollere, hvor ofte billeder er erhvervet, angive Tidsintervallet , så billeder er erhvervet hvert 5 min hele eksperimentet. Antallet af tiden point justerer automatisk med de angivne parametre.</li>
		<li>Sæt stadie positioner ved hjælp af de levende kamera foder i lysfelt mikroskop, giver mulighed for korrekt placering og fokus. Start med 10 X mål, fokus på midten af kanalen, ligger over eller under kanalnumre indgraveret på pladen. Skifte til 20 X målet, at finde den optimale visningsområde og brændplanet inden for kanalen. Føje positionen til listen eller erstatte den forudindstillede kanal holdning med de nye indstillinger.</li>
		<li>Angiv antallet af bølgelængder til 3 under menuen bølgelængder . For bølgelængde 1 (W1), Vælg FITC 100% CAM med en 10 ms eksponeringstid. For bølgelængde 2 (W2), Vælg Brightfield 50% CAM 50% VIS med en minimal eksponeringstid på 3 ms. For bølgelængde 3 (W3), som Alle lukket filter så ingen lys forbliver på den sidste kanal mellem erhvervelse gange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når du opretter kontrolmodulet, skal sikre, at manualen køre er blevet stoppet.<ol>
<li>Angiv en ny protokol for 24 timer af tid, varighed, flyder i de fremadgående retning på den ønskede shear rate i menuen Rediger Autorun under fanen Protokol opsætning . Shear rate er varieret for at studere effekten af biofilm vækst med shear rate. Klik på Tilføj og Gem som protokol.</li>
		<li>Opret en ny sekvens ved at vælge LB@37degrees som standard væsken for alle kanaler under fanen Rækkefølge Setup . Under Trin Iteration 1, for kanalerne 1-12, Vælg protokol med de ønskede shear sats og aktiverer alle kanaler. For kanaler 13-24, Vælg protokol med den anden ønskede shear sats og aktiverer alle kanaler. Vælg Anvend og Gem som sekvensen.</li>
		<li>Vælg den gemte sekvens skal bruges til autorun i menuen Autorun .</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. timet Biofilm vækst eksperiment Setup
<ol><li>Der afpipetteres højst 1.300 µL sterilt mm i input godt af mikrofluid pladen. Placere plade tilbage på pladen scenen og tørre interface med ethanol, giver ethanol til at tørre helt, før forsegling pladen.</li>
	<li>Placere pladen fase på mikroskop-scenen, og vær sikker på at netværksprotokoller og sekvens(er) er indstillet korrekt. Vælg Start at starte autorun hurtigt efterfulgt af at klikke erhverve for at starte mikroskop billedsamling.</li>
	<li>Justere fokus og placering af fase positioner mellem billede kundskaber. Vælg Pause , og bruge tilstanden live billede i lysfelt bølgelængde, Vælg Gå til at se hver fase positioner. Angiv nye indstillinger ved at vælge Indstil til aktuel. Klik på Genoptag før den næste planlagte erhvervelse.</li>
</ol>7. gennemgå og analysere billedsekvenser efter timet Biofilm vækst eksperiment
<ol><li>For at gennemse hver kanal efter 24 h autorun, i software, åbne Anmeld flerdimensionelle Data, placeret under Analyseværktøjer. Klik på Vælg Base fil | Vælg bibliotek til at navigere til mappen med billedsekvenser til eksperiment af interesse. Listen over datasæt i den mappe, der vises, skal du vælge navnet base af data af interesse.</li>
	<li>Når data af interesse er valgt, skal du klikke på Vis for at gennemse disse data. Vælg en bølgelængde at gennemgå dataene under bølgelængde vindue (Figur S2).</li>
	<li>Anmeldelse billedsekvens for hver kanal ved at vælge kanalnummeret under Scenen holdning og ved hjælp af video kontroller til at analysere data for 289 tiden point (antages det, at billeder opnås hvert 5 min over en 24 h tidsramme). Læg mærke til brugbar vækstdata. Bemærk: I hver kanal, holde øje med udviklingen af luftbobler og træsko, der vil forstyrre biofilm væksten inden for den kanal, der påvirker dataene. Men hvis disse opstå senere i Kør, data, før disse omstændigheder kan være fundet nyttige.</li>
	<li>Efter gennemgang og vælge de ønskede data til analyse, Opret stakke af billeder for hver kanal. Under menuen fil , Vælg åbne særlige | Bygge Stack | Nummererede navne. I vinduet Bygge stak Vælg knappen Vælg første billede og vælge det første billede for stakken i mappe; Vælg knappen Vælg sidste billede og derefter vælge filen svarende til det sidste billede i stakken. Klik på OK for at åbne stakken med alle billederne af kanalen i kronologisk rækkefølge. Stakke kan gemmes under menuen filer Gem som som tiff-filer. Bemærk: Undlad at oprette stakke med tommelfinger billeder. Disse filer er ikke meget nyttigt og kan blive slettet for at spare plads på harddisken. Også, billedfiler er gemt som følgende: BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #. For eksempel, er 07062018_W1FITC 100_s12_t112 for kanal 12, tidspunkt 112, billedet i første bølgelængde-FITC 100% Kameradata med navn "07062018".</li>
	<li>Endelig, Vælg Gem som fil henlægge-nede menu hen til opspare sekvensen som en tiff stak. Stakke kan også belagt og gemmes som en film. Dette er behandlet i trin 9.</li>
	<li>Før kvantificere % overfladedækning, kalibrere billede afstande. Under Analyseværktøjer, klik på Kalibrer afstande. Vælg den passende kalibrering måling og klik på Anvend på alle åbne billeder.</li>
	<li>Mens stakken er på det første billede af sekvensen, skal du klikke på knappen tærskel . Bruge Auto tærskel for lys objekter til tærskel for fluorescerende signal (FITC bølgelængde) og Auto tærskel for mørke objekter til tærskel i lysfelt. Justere tærsklen til den dækning, der repræsenterer dækning af billedet.<ol>
<li>For fluorescerende tærskler, udnytte en kanal med ikke-fluorescerende celler at etablere nogen baggrund signal og sæt værdien minimumstærskel for at udelukke signal opdaget i kanaler indeholdende disse ikke-fluorescerende celler at sikre signal måling gør ikke overvurdere området af fluorescens. Dette kan være forskellige fra køre til at køre så er det en god idé at bruge mindst én, hvis ikke mere, kanal (er) for ikke-fluorescerende objekter.</li>
		<li>Lysfelt tærskler, hvis alle celler ikke er omfattet af orange tærskel signaturen, justere den maksimale grænseværdi enten via værktøjslinjen glidende eller ved hjælp af Tærskel billede (findes under Analyseværktøjer), så alle celler er dækket men nogen baggrund er udelukket. Bemærk: Mens disse tærskelværdier ideelt ville blive brugt til alle billeder i en stak og for alle kanaler, tærskelværdier, der vælges for ét billede/kanal ikke være relevant for andre billeder eller kanaler, derfor brugeren muligvis justere området tærskel med jævne mellemrum. Derfor er det en god idé at altid optage maksimalt og minimumstærskel værdier bruges bør data skal revideres senere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For at kvantificere dækning under Analyseværktøjer, skal du klikke på Vis Region statistik. Sørg for at Bruge tærskel er markeret, Hele billedet er valgt, og kontroller under Indhentet Data, de ønskede målinger/indstillinger er markeret (tærskel område, gennemsnit, standardafvigelse, min, max og %-tærsklen område). Klik på Åbn Log og sørg for DDE-fil er valgt før du klikker på OK. Vælg Microsoft Excel , og klik på OK. I det regneark, der vil åbne, klik på Log Data til automatisk at registrere målinger af billedet ved at blive analyseret.</li>
	<li>Forlader dette regneark åben, bruge det samme ark til at indsamle alle billede analyse data i en enkelt stak. I stakken, gå til den fjerde billede og tærsklen til de optimale indstillinger. Klik på Log Data i skærmbilledet Vis Region statistikker og værdierne, der er logget ind i regnearket. Gentag dette for analyse af billeder hvert 15 min.</li>
</ol>8. andre analyse herunder morfologi og overfladen dækning foranstaltning ved hjælp af Python scripts fra Biofilm morfologi Suite
<ol><li>Installere en fordeling af Python 3.6, der omfatter videnskabelige standardmoduler ved hjælp af en standard videnskabelige Python distribution som Anaconda, tilgængelig på https://www.anaconda.com/download.</li>
	<li>Få Biofilm morfologi Suite fra GitHub i en browser ved at navigere til https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, så vælg klon eller download (grøn knap) og vælg Download Zip. Unzip fil og flytte mapperne kode til en arbejdsmappe.</li>
	<li>Måle procent thresholded dækning ved at kopiere billedstak til mappen "dækning". Bruge et terminalvindue til at navigere til denne mappe og derefter køre scriptet med kommandoen python bfCoverage.py tiffStackName.tif fra kommandolinjen interface, hvor tiffStackName.tif er navnet på den fil, der indeholder tiff stakken af billeder. En tekstfil, der indeholder dækning målinger på hvert tidspunkt bliver lavet med navn tiffStackName.txt og en grafikfil med et plot af dækning, som en funktion af tiden vil blive oprettet med navnet tiffStackName.png.
</li>
	<li>Brug samme fremgangsmåde har angivet i trin 8.3 for at måle de andre morfologiske karakteristika: biofilm ophobning, ruhed koefficient og tekstur entropi. Bruge scriptet bfAcc.py for ophobning måling, scriptet roughCoef.py for ruhed koefficient måling og scriptet TEvsTime.py for tekstur entropi måling.</li>
</ol>9. andre Software-applikationer - overlejringer og film
<ol><li>Hvis der bruges flere bølgelængder, oprette overlay stakke herunder disse bølgelængder. Åbne alle stakke af interesse og kalibrere afstanden, som gjort i skridt 7,6.<ol>
<li>Under Analyseværktøjer, skal du vælge Overlay billeder. Angive kilder som stakke af interesse. Klik på regnbue cirkel i FITC stakken, og vælg grønne farve filter skal tilføjes for at fremhæve denne bølgelængde.</li>
		<li>Bruge bal justere overlejringen, så FITC stakken fremgår i billederne. Efter at have foretaget alle justeringer, Vælg Alle fly for begge stakke og klik på Anvend. Gem overlejringer på samme måde som stakke beskrevet taktfast 7.5 eller en film, der er beskrevet i trin 9.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis du vil gemme stakke eller overlejringer som en timelapse film under MM Standard og stak, skal du klikke på Gøre filmen. Vælg kilden som stakken eller overlay, der ønskes. Klik på Gem og gemme som en Microsoft Video 1 med en kvalitet, der ligger mellem 70-80.</li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Proceduren mikrofluid system og image analysis drøftet her fokuserer på udførelsen af mikrofluid biofilm eksperimenter til at bestemme morfologiske egenskaber, der ikke kræver det fuldt tre-dimensionelle oplysninger typisk findes fra Konfokal mikroskop undersøgelser. Disse omfattede microcolony undergrundens dækning (procent dækning), overfladeruhed målt ved ruhed koefficient og tekstur entropi. En metode til at anslå samlede relative biofilm celle ophobning præsenteres også fra hvilke vækstrater i log fase kan beregnes.
Der er flere små men vigtige skridt, der bør fremhæves i denne metode. Aftørring interface med alkohol hjælper med at undgå forurening af andre bakterier i at gå fra forsøg til eksperiment, men også fra godt til godt i et eksperiment. Priming og såning er også meget vigtigt, fordi priming tillader bruger hen til afgøre hvilke kanaler er at lade medierne til at flyde gennem kanaler uden nogen forstyrrelser eller tilstopning. Kanaler bør heller ikke være forstyrret (dvs. de skal være konstant fuld af medier) efter grunding for at øge chancerne for en vellykket eksperiment med ingen luftbobler eller tilstopning. Trinnet seeding kan varieres efter typen af bakterier og så skal optimeres for celle vedhæftet fil. For eksempel, hvis celler ikke synes at vedhæfte, overflade ændringer kan have at forekomme på mikrofluid pladen inden såning eller længere inkubationer gange kan være nødvendigt. Det er også afgørende for at sikre at mikroskopet er korrekt sat op til at få en i-fokus billede og bør overvåges periodisk under hele forsøget at forsikre, at kvalitetsbilleder er opnået. Hvis fokus er slukket, mikroskopet kan og bør reguleres som forsøget fortsætter. Under image erhvervelse tid, skal den sidste bølgelængde indstilles til Alle lukket for at undgå eksponering af filtre og belysning til kun én kanal under den ventetid, der opstår mellem billede erhvervelser. Også, billedanalyse, der bestemmer % overfladedækning blev designet i huset fordi Montage software manual ikke udtrykkeligt beskriver proceduren. Desuden, for at udvide billedanalyse og andre karakteristiske træk som overfladeruhed osv., åben kilde Python-baseret kode45 blev udviklet i hus og delt på gitHub opbevaringssted. Der er også begrænsninger på hvor meget data kan lagres og styres på den lokale harddisk, så en ekstern skrap drive eller online datadeling er nødvendig som CyVerse46.
Konventionelle bioreaktorer, såsom CDC reaktor og drop flow reaktor34kræver en masse medier, giver færre stikprøvestørrelser og kræver en stor mængde af sterilisering af udstyr. I modsætning, fordelene ved denne højere overførselshastighed platform omfatte evne hen til kontrol shear, strømningshastigheder, og den antagelse, at in vitro forsøg tæt ligner i vivo betingelser. Ulemper ved systemet omfatter flere tilbehør og software, der kræver en omhyggelig opsætning, der skal udføres i den korrekte rækkefølge af begivenheder. Desuden, den håndbog, der er fastsat for udstyret, der forklarer ikke fuldt hvert trin af eksperimenterne, og kommandoerne software, og dermed mange fejl opstår under eksperimenter, herunder tilstopning af kanaler, manglende vækst eller vedhæftet fil, eller den manglende høj kvalitet mikroskopi billeder eller film. Apparatet og hjælpematerialer, som mikrofluid pladerne, er også forholdsvis dyrt med en pris på over $200 per plade og kan ikke genbruges. Således, mens teknikken giver stærke resultater, den tekniske ekspertise, der kræves for dens anvendelse er forholdsvis høj og kræver gentagne uddannelse af eksperter på området. Denne betænkning forsøger at løse dette problem ved at give en guide til nye brugere af disse bioreaktorer for at studere biofilm karakteristika.
Mikrofluid system, som er i stand til at udføre cellulære analyse, har fået betydelig opmærksomhed til forskellige videnskabelige retningslinjer, som i mikrobiologi, immunologi, hæmatologi, onkologi og stamcelleforskning. Mere specifikt har teknologien resulteret i mange publikationer beskriver emner, der er særdeles relevante for medicinske anvendelser37,47, herunder mikrobielle mundtlige vedhæftning48, bestemmelse af virkningerne af biosurfactants på Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus49,50, vært patogen interaktioner i E. coli51, Streptococcus overholdelse52og behandling af cystisk fibrose53. I betragtning af at dette mikrofluid system er meget alsidig, forventes det, at flere og flere systemer bliver fordelt i hele verden.
Nogle specifikke protokol skridt bør overvejes nøje. Medierne kan blive udvandet til 50% med dH2O for at forhindre bobler og tilstopning men var ikke påkrævet i dette tilfælde. Den specifikke værdi af OD600 bruges til såning skal bestemmes ved hjælp af trial kørsler af en vækst eksperiment for at se, hvad der fungerer bedst for den bestemt sæt betingelser anvendes. Bobler i brøndene inden forsegling kan føre til bobler i mikrofluid kanalerne og bør fjernes ved enten affyret eller suget ud med en pipette spids. Det er vigtigt at holde bakterier ud af de lille serpentine kanaler. Ved at have lige store mængder af medier i input og output under seeding-processen, vil flow på grund af pres fra den flydende volumen blive kontrolleret så flow er kun på grund af den anvendte pres fra systemet. Kalibrering afstande bør oprettes under installationen af Virksomhedsrepræsentant. Disse indstillinger er specifikke for hvert kamera.
Der er flere udfordringer, der opstår, når at finde de mest repræsentative tærskel for et billede. Indstilling af maksimale grænseværdier kan være vanskeligt, hvis den gennemsnitlige pixel intensitet på tværs af regioner af baggrunden ikke er konsistente forårsaget ved enten at vælge en fase holdning, som ikke er på midten af kanalen eller fra snavs på pladen. Under MM Standard, klik på procesog derefter vælge baggrund og skygge korrektion værktøj til korrektion for disse uoverensstemmelser. Dette værktøj er dog generelt kun nyttigt, hvis brugeren har taget billeder af kanaler før såning, som de kan bruge som reference billeder. Eller hvis baggrundsskyggen reference billeder er ikke tilgængelige, brugeren skal bruge deres dom for at fastsætte en grænseværdi, der dækker de mest celle område uden herunder baggrunden for hele billedet. Alternativt, Vælg repræsentative områder til at måle, at udelukker regioner af inkonsekvens ved at klikke på Rektangulær Region, Ellipse Regioneller Spore Region at vælge et område og vælg Aktive Region snarere end hele Billede i vinduet Vis Region statistik (under Analyseværktøjer). Hvis en repræsentativ region er udnyttet for tærskel lysfelt billedet, samme region bør anvendes til måling af den tilsvarende FITC billede. Det er nyttigt at optage den specifikke rumlig statistik (venstre, Top, bredde, højde, område, afskærmet) forbundet med repræsentative området så samme region vil blive fundet og målt på tilsvarende FITC billedet.
For at forhindre en ophobning af data på harddisken, vil forårsage, at computeren til at bremse, kan en ekstern harddisk købes til lagring af data. En anden indstilling for lagring af data og lette datadeling er CyVerse Bioinformatik platform. Opret en konto på CyVerse systemet ved at gå til http://www.cyverse.org/. Når du er logget, lancere Discovery miljø og derefter vælge "Log i CyVerse". Vælg "Data" og Naviger til mappen er du. Hvis en billedstak er på den lokale computer skal du vælge "Upload" og derefter "Enkel Upload fra skrivebordet". Find filen billede stak og vælge for upload. Fil eller en mappe kan deles med samarbejdspartnere, hvis de har en CyVerse konto og gives tilladelse. Deling af mappen data til den brede offentlighed kræver, at metadata blive tilføjet for hver fil ved hjælp af CyVerse godkendte standarder. Denne procedure vil ikke blive diskuteret her fordi det ikke er omfattet af dette arbejde.

Her vil vi vise en metode til at måle effekten af shear stress på dannelsen af fluorescerende Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilm ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid system.
Biofilm er Fællesskaber af mikroorganismer, såsom bakterier, arrangeret af en ekstracellulære polymert stof, der er knyttet til en støtte, og findes typisk på grænsefladen mellem en væske og en solid overflade1. Disse biofilm samfund kan være gavnligt for miljøet, såsom forbedre vandkvaliteten i vandforsyning linjer og bioremediering af genstridige forbindelser2,3. Biofilm kan dog også være yderst skadelige for menneskers sundhed med uønskede konsekvenser. For eksempel, er medicinsk udstyr, såsom hofte og knæ implantater, en type af overfladen hvor biofilm ophobning har været en udfordring og forårsager alvorlige medicinske komplikationer4,5. Biofilm kan også indtaste naturlige vandsystemer, floder og søer, og infiltrere vandforsyning rør fører til bakterier forurening i drikkevand resulterer i infektioner6,7,8. Biofilm dannet i marine miljøer overholder skibe og andre menneskeskabte substrater og præsentere store økonomiske og miljømæssige problemer som øget friktion fører til at øge brændstof forbrug9,10. Antimikrobiel belægninger, såsom Tributyltin, er blevet udviklet for at forebygge disse problemer men er giftigt for marine liv11.
P. aeruginosa er en Gram-negative bakterien med høje blomstrende kapaciteter i en lang række miljø-og nutrimental12. P. aeruginosa er en almindelig årsag til Fællesskabet og hospitalserhvervede infektioner og fundet at være nært knyttet til skader, såsom alvorlige forbrændinger og immunkompromitterede værter, som i cystisk fibrose (CF)5,12, 13, AIDS og kræft patienter5,13. Dannelsen af P. aeruginosa biofilm har været mest alvorligt tilsluttet CF, hvor kroniske lungeinfektioner er den førende dødsårsag for denne sygdom5.
En referencestamme af P. aeruginosa, PA01, der bruges i denne rapport og er genetisk modificeret til at udtrykke en forbedret grøn fluorescerende proteiner (PA-EGFP). EGFP repræsenterer en mutant form for normal god landbrugspraksis med større fluorescens-egenskaber, som giver mulighed for i situ biofilm analyse ved hjælp af Fluorescens mikroskopi14,15,16. Denne type af fluorescens analyse er en fordel for studier af biofilm fordi normal god landbrugspraksis ikke griber væsentligt ind i cellevækst og funktion17. For eksempel, voksede Escherichia coli celler, der var mærket med normal god landbrugspraksis godt og løbende uden at have lidt nogen toksiske virkninger i forhold til kontrol bakterier17. Andre rapporter underbygge denne påstand18,19,20. Desuden brug af en fluorescerende reporter som EGFP er hurtig og enkel, men kun levende celler vil blive målt, fordi døde celler hurtigt ophører med at fluorescerer21.
Biofilm kan vokse under forskellige miljøforhold, herunder dem med forskellige strømningshastigheder. For eksempel, kan film vokse i høj shear stress, såsom i floder, hvor høj vand flow betingelser føre til en større mikrobiel diversitet22. Contrarily, stillestående vand i damme eller orale biofilm opleve en meget lavere shear kraft23. Ud over strømningshastighed, der er andre faktorer, der påvirker biofilm vedhæftning, herunder overfladeruhed og hydrophobicity, media sammensætning, og selv bakterielle cellens overflade1,4,7, 24. betingelser kan også forårsage variation i den rumlige struktur eller morfologi af en biofilm. Dette omfatter miljøforhold som shear stress udøves af en bevægende væske eller forløb i næringsstoftilgængelighed og biologiske faktorer som arterne, der findes i systemet, motilitet af celler og de særlige proteiner til stede i den ekstracellulære polymert stof25,26,27. På nogle vilkår, bliver biofilm græsplæne-lignende (glat og flad), mens andre betingelser biofilm vil være ru, bløde, eller endda svamp-lignende28. Mens den kvalitative forskel mellem biofilm græsplæner og champignon strukturer kan ses tydeligt i mikroskopiske billeder, kræver forstå forholdet mellem film struktur og biologiske processer inden for filmen en systematisk og kvantitative metoder til at beskrive morfologi. Morfologiske egenskaber foreslår undersøgelse af forskere omfatter porøsitet, fraktal dimension, diffusional længde, microcolony område på undergrundens, microcolony volumen, ruhed koefficient og tekstur entropi29,30 .
Bioreaktorer bruges i studier af biofilm for at efterligne virkelige liv betingelser31. Drop flow reaktorer (DFR) repræsenterer en lav-shear miljø hvor næringsstoffer i medier løber langsomt på tværs af celler, der knyttet til en overflade over tid til at danne en biofilm med en høj celle tæthed32. CDC reaktorer er bioreaktorer, at skaber en høj shear stress væske miljø ved kontrol af en omrøring stang, der er konstant roterer inden for medierne fyldt tank33. Disse typer af bioreaktorer er enkel at sætte op, men de er begrænset på grund af den relativt lave stikprøvestørrelse, det store forbrug af medier, store mængder af biologisk affald fra media drop strømme spænder fra 125 µL/minut for drop flow reaktorer til mere end 1 mL/min. til CDC reaktorer, og nødvendigheden af at autoklave store mængder af glasvarer og affald media34. Biofilm dyrker ikke jævnt over hele overfladen i et drop flow reaktoren fordi den lave vrid af medier forårsager trailing langs de større konglomerater af P. aeruginosa bakterier derfor, biofilm vækst er ikke meget glat og ujævn prøverne må ikke være let analyseres med Fluorescens mikroskopi35,36 .
Nogle fælles bioreaktor begrænsninger er overvundet ved hjælp af en medium-overførselshastighed mikrofluid bioreaktor, hvor kun milliliter af medier er påkrævet, og reaktionen pladerne er små og let engangs efter autoklavering37. Desuden, afhængigt af antallet af brønde, mange replications kan udføres i bare én reaktor køre, som giver tilstrækkelig mængde af data til meningsfulde statistisk analyse. I figur 1, er de forskellige komponenter i mikrofluid-mikroskopi system, der giver mulighed for kontrollerede forhold, herunder temperatur og flow sats38,39,40, vist. Bioreaktor er kombineret med Fluorescens mikroskopi til at visualisere fluorescens af koden EGFP i PA01 under anvendes lavt gennem høj shear forhold, der vil efterligne mere realistiske scenarier, der er stødt på i miljøet eller på det biomedicinske område.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figur 1 : Individuelle komponenter af ordningen med mikrofluid. De enkelte komponenter er listet fra venstre mod højre: 1. CCD kamera, 2. høje opløsning inverteret mikroskop med automatiserede fase, automatiseret fluorescens-modulet og autofokus modulet, 3. plade fase, 4: Imaging system Interface, 5: manuel mikroskop fase Kontrol, 6: Vapor fælde, 7: Imaging system Controller (herunder temperatur Controller), 8: Hardware controllere, 9: fluorescens Controller, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: ekstern Skrap Drive nemlig billede opbevaring, 12: PC arbejdsstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Et uddrag af mikrofluid pladen er vist i figur 2. De mest almindeligt anvendte plader består af 48 brønde. Et eksperiment kræver én indgang og én outlet brønde, ialt 2 brønde. Dette giver mulighed for 24 samtidige eksperimenter, der kan udføres med forskellige eksperimentelle betingelser, såsom bakteriestammer, antimikrobiel behandlinger og medier varierede fra kanal til kanal og kontrolleret shear flow for hver kolonne i seks kanaler. Den eksperimentelle temperatur styres også med én temperaturindstilling i hele pladen. Mikrofluid kanalerne viser, at hver kanal har en serpentine region at give tilstrækkelig modtryk og kontrolleret shear.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figur 2: visualisering af de mikrofluid kanaler og visningsvinduet. To indsugnings- og udstødningsporte brønde med de mikrofluid kanaler forbinder dem er fremhævet med rødt og grønt farvestoffer. Farvestoffet synliggør en serpentine region i hver kanal, der skaber tilstrækkeligt modtryk og kontrolleret shear under flydende flow. Hver visning kanal (i den røde cirkel) kan være afbildet med ønskede bølgelængder. Vist er lysfelt (øverst) og fluorescerende (nederst) mikroskopi billeder af en enkelt kanal med en PA01-EGFP biofilm ved hjælp af en 20 X mål. Skalalinjen = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
En trin for trin guide er forudsat at brugerne af mikrofluid bioreaktorer, der er kombineret med Fluorescens mikroskopi til at udføre roman biofilm eksperimenter ved hjælp af forskellige shear miljøer. Denne metode vil give mulighed for udvidelse af eksperimenter, der involverer andre mikroorganismer end bakterier, svampe og alger, der har medicinsk og miljømæssige programmer41,42,43. Den detaljerede fremgangsmåde beskriver, hvordan kultur PA01-EGFP, podes en 48-godt plade og konfigurere mikrofluid enheden og softwaren, oprette fluorescerende mikroskop og demonstrere software analyse for at få biofilm dækning, vækst, og morfologiske egenskaber såsom overfladeruhed.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

En højere overførselshastighed mikrofluid i vitro bioreaktor kombineret med Fluorescens mikroskopi er blevet brugt til at studere bakterielle biofilm vækst og morfologi, herunder Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Her vil vi beskrive, hvordan systemet kan bruges til at studere vækst kinetik og de morfologiske egenskaber, såsom overfladeruhed og tekstur entropi af P. aeruginosa stamme PA01, der udtrykker en forbedret grøn fluorescerende proteiner (PA01-EGFP ). En detaljeret protokol vil beskrive, hvordan at dyrke og frø PA01-EGFP kulturer, hvordan du indstiller op mikroskop og autorun, og udføre billedanalyse Bestem vækstrate og morfologiske egenskaber ved hjælp af en række shear kræfter, der er kontrolleret af den mikrofluid enhed. Denne artikel vil give en detaljeret beskrivelse af en teknik til at forbedre undersøgelse af PA01-EGFP biofilm, der i sidste ende kan anvendes mod andre stammer af bakterier, svampe eller alger biofilm ved hjælp af mikrofluid platform.

Figur 4 en viser den procentvise thresholded område over tid fra en 24 h køre på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Biofilm dækning eller procent tærskel areal (C [%]) var anderledes for alle tre shear indstillinger. Biofilm dækning var hurtigst på 1,0 dyne/cm2 shear, hvor området tærskel steg fra 2-5% til 100% efter 200 min vækst og nåede en stationær fase efter 400 min. På 0,5 dyne/cm2, biofilm dækning var forsinket og begyndte at stige på 400 min. at nå 100% dækning efter 800 min. Den laveste shear på 0,2 dyne/cm2 tydeligt den langsomste stigning i biofilm dækning, hvor procent dækning begyndte at stige på 500 min men aldrig nået ud over området 65%-tærsklen. Disse resultater viste shear havde en direkte indflydelse i biofilm overfladedækning. Den højere shear syntes at være en mere optimal tilstand for biofilm vækst, muligvis skyldes, at medierne leveret bakterier med flere næringsstoffer, så biofilm kan formere sig hurtigere.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figur 4: procent tærskel område, samlede biofilm ophobning, ruhed koefficient, og tekstur entropi. a) procent tærskel område (C [%]) over tid ved hjælp af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. b) samlet biofilm ophobning (relative foranstaltning) som en funktion af tid ved hjælp af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode. De sorte streger er mindste kvadraters passer til en eksponentiel model. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. c) ruhed koefficient på PA01-EGFP ved hjælp af shear stress værdier af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 overvåges over 24 h. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse. d) tekstur entropi af PA01-EGFP ved hjælp af shear stress værdier af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Data blev indhentet fra en kanal for hver shear betingelse (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Figur 4 b er i overensstemmelse med resultaterne vist i fig. 4en. Biofilm ophobning (N[rel]) blev målt baseret på den antagelse, normal god landbrugspraksis signal på et punkt i et billede er proportional med den levende celle tæthed på denne holdning. Det viser at samlede relative måling biofilm akkumulering øges som funktion af tiden bruger 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2 over en 24 timers periode, og væksten faldt fra højeste shear stress til laveste shear stress. Der er en klar periode giver eksponentiel vækst som en kvantitativ vækst kan beregnes.
Figur 4 c viser ruhed koefficienten (Ren) på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. Overfladeruhed, kvantificeres ved ruhed koefficient, måler variansen i profilen tykkelse af filmen. Den formelle definition er
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
hvor T,jeg er den jeg-th tykkelse måling, Tet er den gennemsnitlige tykkelse, og N er antallet af tykkelse måling30. FremgangsmÃ ¥ den i denne undersøgelse måler tykkelsen forbundet med levende celler. En flad arrangement af celler vil give en ruhed koefficient på nul, mens betydelige variationer i tykkelse fra gennemsnittet vil give en ruhed koefficient større end 1. Svarende til shear indflydelsen på væksten og procent tærskel dækning af filmen, biofilm udstillet forskellige topografi over tid. Samlet set Ren faldt over tid for alle shear betingelser angiver, at alle overflader blev glattere. Men i forhold til den laveste shear 0.2 dyne/cm, højere shear indstillingerne for 0,5 og 1,0 dyne/cm2 resulterede i en glattere overflade over tid viser, at en hurtigere shear flow bidraget til glattere og mere jævn overflade, og den højeste shear af 1,0 dyne/cm2 til under 0,2 Ren.
Glathed, regelmæssighed eller råhed af en overflade kan også udtrykkes i tekstur entropi (TE). TE er en egenskab, der bruges i billedanalyse til at måle graden af tilfældighed i en to-dimensionelle billede. Beregningen er baseret på matrixen grå niveau samtidig forekomst defineret af Haralick mfl., som ser på om pixelværdier på ét sted er korreleret med pixelværdier på en anden placering44. En høj grad af korrelation vil føre til lav entropi. Figur 4 d skildrer TE på shear strømme af 0,2, 0,5 og 1,0 dyne/cm2. VÆVSCENTRET steget over tid for alle shear betingelser, men den højeste shear stress på 1,0 dyne/cm nåede den maksimale TE (1,0) tidligere end de lavere shear understreger på 900 min. Den laveste shear 0.2 dyne/cm2 havde den laveste TE (0,8) at nå sin maksimale efter 1.000 min. Men den mellemliggende shear stress af 0,5 dyne/cm2 nåede sin maksimale TE (1,2) meget senere end højt eller lavt shear stress betingelserne.
Ruhed koefficient og TE måle forskellige funktioner. Mens en flad film ville have en lav ruhed koefficient og lav entropi, en film med betydelig variation i tykkelse ville have en høj ruhed koefficient men kunne stadig lav entropi, hvis variationen er sinusformet snarere end tilfældige. I dette tilfælde Ren faldt med øget shear stress og tid mens TE tendenser ikke kan være direkte relateret til shear stress påføres Biofilmdannelse over tid.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figur S1 : Image capture control software Windows. Software vindue med Multi Dimensional erhvervelse menuen Åbn (øverst). Kontrolmodul til en AutoRun (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figur S2 Image capture software til at revidere data. Programvinduet efter at vælge Data, der af interesse ved hjælp af værktøjet Anmeldelse Multi Dimensional Data fra menuen Værktøjer til analyse . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Her, beskriver vi brugen af en højere overførselshastighed mikrofluid bioreaktor kombineret med en fluorescerende mikroskop til analyse af shear stresspåvirkninger på Pseudomonas aeruginosa biofilm udtrykker grøn fluorescerende proteiner, herunder instrument oprette, bestemmelse af biofilm dækning, vækstrate og morfologiske egenskaber.

Live celle analyse af Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål, om biofilm udvikling, såsom hvordan man identificerer centrale miljøforhold, der påvirker biofilm vækst og adfærdsmæssige egenskaber under udviklingen. Den største fordel ved denne teknik, er, at de multi-kanaliserede, mikro-fluidic plader, giver mulighed for hurtig erhvervelse af statistisk signifikante resultater. Selv om denne metode kan give indsigt i biofilm struktur, det kan også anvendes til undersøgelse af antibiotikabehandlinger, og bioremediation.Generelt vil personer nye til denne metode kæmpe, fordi omhyggelig opmærksomhed på detaljerne i protokollen og omhyggelige færdigheder, er nødvendige. Hvis du vil undgå en fejl i instrumentets tilslutning til softwaren, skal du først tænde pc-arbejdsstationen efterfulgt af fluorescensmodulet. Sørg for, at fluorescenslukkeren er tændt, og tænd hardwarecontrollerne.Tænd derefter for billedsystemcontrolleren og CCD-kameraet. Tænd derefter for billedstationen. Når alt udstyret er klar, skal du starte kontrolapplikationen og indtaste nummerpladen, der er placeret på etiketten på siden af pladen.Til priming skal du først fjerne den 48 brøndmikrosekspliniske plade fra emballagen uden at røre ved glasoverfladen i bunden af pladen og rengøre glasrutsjebanen i pladebunden med et linsevæv. For at prime de mikro-fluidiske kanaler, pipette 200 mikroliter på 37 grader celsius minimalt medium i output godt, idet du skal passe på at undgå bobler. Placer derefter pladen på pladens stadie.Tør grænsefladen med ethanol, forsegle det på pladen fase, når ethanol er tørret. I manuel tilstand på kontrolmodulet skal du indstille væsken som Luria-Bertani bouillon ved 37 grader celsius og max ren og skær som fem dym pr. kvadratcentimeter. Klik på output brønde for at aktivere strømmen fra output til input godt, at prime kanalerne.Efter fem minutter, pause strømmen for at forberede såning, og forsigtigt fjerne pladen fra scenen. Derefter aspirere eventuelle resterende medium fra output godt uden at fjerne noget medium fra den inderste cirkel, der fører til mikro-fluidic kanaler. For at frø de eksperimentelle kanaler, tilføje 300 mikroliter af minimalt medium i input godt, efterfulgt af tilsætning af 300 mikroliter af bakteriekultur, i output godt.Returner pladen til billeddannelsesfasen og sørg for at tørre grænsefladen med ethanol, før du placerer den på pladen, og brug livekamerafeedet til at fokusere på en enkelt kanal. Mens visuelt overvågning af levende foder, genoptage strømmen på 1 til 2 dym per kvadratcentimeter i ca 2 til 4 sekunder, At tillade cellerne at komme ind i den eksperimentelle kanal, men ikke serpentin kanaler, og lad pladen på temperaturkontrolleret fase i en time, at tillade cellerne at vedhæfte. I slutningen af fastgørelsesperioden fjernes pladen forsigtigt fra scenen, og bakterierne aspirere fra outputtet godt uden at forstyrre kanalen.Brug derefter en ny pipettespids til at fjerne mediet fra indgangstingerne. I softwaren skal du åbne fleredimensionelle anskaffelser for at styre anskaffelsen af mikroskopbilledet og vælge tidsforfald, flere scenepositioner og flere bølgelængder. Opret et simpelt basisnavn under fanen Lagring, hvor du sikrer dig, at basisnavnet for incroments, hvis filen findes, er markeret.Medtag alle væsentlige detaljer i eksperimentet i beskrivelsen. Klik på Vælg mappe, for at vælge den mappe, hvor alle filerne skal gemmes under fanen tidsforfald, juster varigheden af forsøgstiden til 24 timer, og angiv tidsintervallet for at hente billeder hvert femte minut i hele eksperimentet. Brug live kamera feed og 10x målsætningen til at indstille scenen positioner, der fokuserer på midten af kanalen, placeret over eller under kanalen numre indgraveret på pladen.Skift til 20x målet, og find det optimale visningsområde og brændplan i kanalen. Føj derefter sceneplaceringen til listen med de nye indstillinger. Under bølgelængdemenuen skal du indstille antallet af bølgelængder til 3 og indstille den første bølgelængde til FITC 100%-kamera med en eksponeringstid på ti millisekunder, den anden bølgelængde til Brightfield 50% kamera 50% synlig, med en minimal eksponeringstid på 3 millisekunder og den tredje bølgelængde til alle lukkede, så intet lys forbliver på den sidste kanal mellem kanaltiderne.Åbn fanen Automatisk redigering i menuen Rediger automatisk kørsel, og angiv en ny protokol med en varighed på 24 timer med flowet indstillet i fremadretningen med den relevante eksperimentelle forskydningshastighed. Klik på Tilføj og gem som for at gemme protokollen og åbne fanen sekvensopsætning. For at oprette en ny sekvens skal du vælge Luria-Bertani bouillon ved 37 grader som standardvæske for alle kanaler.Under trin iteration 1 for kanal 1 til 12 skal du vælge protokollen med den første eksperimentelle forskydningshastighed og aktivere alle kanalerne. For kanal 13 til 24 skal du vælge protokollen med den anden eksperimentelle forskydningshastighed og aktivere alle kanalerne. Vælg derefter Anvend og Gem som for at gemme sekvensen, og åbn menuen Autorun for at vælge den gemte sekvens, der skal bruges til Autorun.For at opsætte det tidst tidsrede biofilmeksperiment tilsættes op til 1300 mikroliter sterilt minimalt medium i mikrovæskepladens inputting, og pladen returneres til billeddiagnostisk fase. Tør derefter grænsefladen med ethanol, og forsegle pladen. Bekræft, at protokollerne og sekvenserne er konfigureret korrekt.Vælg start for at starte AutoRun, og klik straks på hent for at starte mikroskopbilledets samling. I slutningen af den første billedopkøb skal du klikke på pause og vælge livebilledtilstanden i bølgelængden med brightfield. Vælg Gå til for at få vist hver faseposition, og vælg sæt til aktuel for at angive de nye indstillinger.Klik derefter på FORTSÆT, før du begynder den næste planlagte anskaffelse. I dette repræsentative timede biofilmvæksteksperiment var biofilmdækningen eller procenttærskeloverfladearealet anderledes for alle tre forskydningsindstillinger, hvilket indikerer, at forskydningen havde en direkte indflydelse på biofilmoverfladedækningen. Den samlede relative måling af biofilmakkumulering, steg som funktion af tiden, med vækstraten faldende fra den højeste forskydning stress til den laveste forskydning stress.Under hver betingelse var der også en klar periode med eksponentiel vækst, hvorfra der kunne beregnes en kvantitativ vækstrate. Samlet set faldt ruhedskoefficienten over tid under alle forskydningsforhold, hvilket indikerer, at alle biofilmoverfladerne blev glattere. Men sammenlignet med den laveste forskydning resulterede de højere forskydningsindstillinger i en glattere overflade over tid, hvilket indikerer, at et hurtigere forskydningsflow bidrager til en glattere og mere jævn overflade.Endvidere, den stoflige entropi, eller tilfældighed i morfologi, steget over tid for alle de forskydning betingelser. Under udførelsen af denne procedure er det vigtigt at huske at følge den angivne sekvens og tage sig tid til at udføre hvert trin præcist. De nødvendige færdigheder kan tage et par kørsler til at mestre.Efter denne procedure kan andre metoder såsom HBLC eller GCMS udføres for at besvare yderligere spørgsmål om koncentrationerne af substraights, såsom glukose, der forbruges. Efter det udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for biofilm til at udforske generelle flow miljøer i realtid med kontrollerede eksperimentelle forhold og hydroterapi prøveudtagning. Glem ikke, at arbejde med BSL2 bakteriestammer kan være yderst farligt, og at forholdsregler såsom at bære ordentlig beskyttelsesudstyr og ved hjælp af passende affald protokoller bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Mikrofluid-baserede Electrotaxis for On-demand kvantitativ analyse af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analyse af<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Ved hjælp af en multi-brønds plade Mikrofluid System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Brug Adhesive mønstret Konstruér 3D Paper mikrofluidenheder

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Design mikrofluidenheder for at studere cellulære reaktioner under ét eller samtidig eksisterende Chemical / El / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatiseret dias Scanning og segmentering i Fluorescently mærket væv ved hjælp af en Widefield høj-indhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...