Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschap (NIGMS) (5P20GM103427), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH)

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het microfluidic-systeem en imago-analyseprocedure besproken hier richt zich op de uitvoering van microfluidic biofilm experimenten om morfologische eigenschappen waarvoor de volledige driedimensionale informatie meestal gevonden in confocale niet te bepalen Microscoop onderzoeken. Deze omvatten microcolony substraat dekking (percentage dekking), oppervlakteruwheid gemeten door de ruwheid coëfficiënt en textuur entropie. Een methode voor het schatten van de totale relatieve biofilm cel accumulatie wordt ook gepresenteerd van welke groeipercentages in logboek fase kan worden berekend.
Er zijn verschillende kleine maar betekenisvolle stappen die moeten worden gemarkeerd in deze methode. Het afvegen van de interface met alcohol voorkomt besmetting van andere bacteriën in gaan van experiment aan experiment maar ook van goed tot goed in één experiment. Priming en zaaien zijn ook zeer belangrijk omdat priming de gebruiker om te bepalen welke kanalen zijn waardoor de media toestaat te stromen via de kanalen zonder verstoringen of verstopping. Kanalen mag ook niet gestoord (dat wil zeggen ze moeten voortdurend vol media) na priming te verhogen de kans op een succesvolle experiment met geen luchtbellen of verstopping. De seeding stap kan gevarieerd worden volgens het type van bacteriën en dus moet worden geoptimaliseerd voor bevestiging van de cel. Bijvoorbeeld, als cellen niet lijken te koppelen, kunnen oppervlakte wijzigingen optreden op de microfluidic plaat vóór het zaaien of langere incubations tijden nodig kunnen zijn. Het is ook cruciaal om ervoor te zorgen dat de Microscoop correct is ingesteld om een in-focus-beeld te krijgen en periodiek worden gedurende het gehele experiment om te verzekeren bekeken moet dat kwaliteitsbeelden worden verkregen. Als de focus uitgeschakeld is, wordt de microscoop kan en moet worden aangepast als het experiment blijft. Tijdens de beeld-Acquisitietijd, moet de laatste golflengte worden ingesteld op Alle gesloten om te voorkomen dat de blootstelling van filters en verlichting aan slechts één kanaal tijdens de wachttijd die tussen de overnames van de afbeelding optreedt. Ook werd de beeldanalyse die de % oppervlakte dekking bepaalt ontworpen in huis omdat de Montage softwarehandleiding de procedure niet expliciet beschrijven. Verder ingaan op de beeldanalyse te bepalen andere kenmerken zoals oppervlakteruwheid, enz., open bron Python gebaseerde code45 werd ontwikkeld in eigen huis en gedeelde op de gitHub repository. Er zijn ook beperkingen op hoeveel gegevens kan worden opgeslagen en beheerd op de lokale vaste schijf, zodat er een externe harde schijf of online gegevens delen zoals CyVerse46nodig is.
Conventionele bioreactoren, zoals de CDC reactor en de drip stroom reactor34, vereisen veel media bieden minder omvang van de steekproeven en eisen een hoog gehalte aan sterilisatie van apparatuur. In tegenstelling, de voordelen van deze hogere doorvoer platform omvatten de mogelijkheid om controle shear, debiet, en de veronderstelling dat de in vitro experimenten nauw lijken op in vivo voorwaarden. Nadelen van het systeem omvat de meerdere accessoires en software die vereisen een nauwgezette setup die moet worden uitgevoerd in de juiste volgorde van gebeurtenissen. Bovendien, de handleiding die beschikbaar is voor de apparatuur verklaart niet volledig elke stap van de experimenten, en de opdrachten van de software, en bijgevolg veel fouten optreden tijdens de experimenten, met inbegrip van verstopping van kanalen, gebrek aan groei of bijlage, of het gebrek aan hoge kwaliteit microscopie afbeeldingen of films. Het instrument zelf en verbruiksgoederen, zoals de microfluidic platen, zijn ook relatief duur met een prijskaartje van meer dan $200 per plaat en zijn niet herbruikbaar. Dus, terwijl de techniek krachtige resultaten leent, de technische expertise die nodig is voor het gebruik ervan is relatief hoog en vereist herhaalde opleiding door deskundigen op dit gebied. Dit verslag probeert dit probleem oplossen door het verstrekken van een gids voor nieuwe gebruikers van deze bioreactoren om te bestuderen van biofilms kenmerken.
Het microfluidic systeem, dat is het kundig voor cellulaire analyses uit te voeren, heeft opgedaan veel aandacht voor verschillende wetenschappelijke modaliteiten, zoals in de microbiologie, immunologie, hematologie, oncologie en stamcelonderzoek. Meer in het bijzonder, heeft de technologie geleid tot vele publicaties met een beschrijving van de onderwerpen die zeer relevant voor medische toepassingen37,47 zijn, met inbegrip van microbiële mondelinge hechting48, bepaling van de effecten van biosurfactants op Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus49,50, gastheer-pathogeen interacties in E. coli51, Streptococcus naleving van52, en behandeling cystic fibrosis53. Gezien het feit dat dit microfluidic systeem zeer veelzijdig is, verwacht wordt dat meer en meer systemen zal worden verdeeld over de hele wereld.
Enkele stappen specifiek protocol moeten zorgvuldig worden overwogen. Media kan worden verdund tot 50% met dH2O om te voorkomen dat bubbels en verstoppingen, maar in dit geval niet nodig was. De specifieke waarde van OD600 gebruikt voor het zaaien moet worden bepaald met behulp van proef runs van een groei-experiment om te zien wat het beste werkt voor de specifieke set van omstandigheden gebruikt. Bubbels in de putjes vóór de afdichting kunnen leiden tot de bubbels in de microfluidic-kanalen en moeten worden verwijderd door hetzij gezogen uit met een pipet tip of geknald. Het is belangrijk om te houden van de bacteriën uit de kleine serpentine kanalen. Doordat gelijke hoeveelheid media in de input en output tijdens het seeding, zal stroom als gevolg van druk van het vloeibare volume dus stroom alleen te wijten aan de toegepaste druk uit het systeem is worden gecontroleerd. De afstanden van de kalibratie moeten worden ingesteld tijdens de installatie door de vertegenwoordiger van het bedrijf. Deze instellingen zijn specifiek voor elke camera.
Er zijn verschillende uitdagingen die zich voordoen bij het vinden van de meest representatieve drempel voor een afbeelding. Instellen van de maximale drempelwaarden kunnen moeilijk als de intensiteit van de gemiddelde pixel in regio's van de achtergrond niet consistent veroorzaakt door ofwel het selecteren van een fase positie die niet in het midden van het kanaal of puin op de plaat. Klik op procesonder de MM standaard, en selecteer vervolgens achtergrond en Shading Correction tool correctie voor deze inconsistenties. Deze tool is echter meestal alleen nuttig zijn als de gebruiker heeft genomen beelden van de kanalen voor het zaaien die ze als referentie afbeeldingen gebruiken kunnen. Of, als referentie in-/ achtergrondarcering afbeeldingen niet beschikbaar zijn, de gebruiker zal moeten hun oordeel stelt u een drempelwaarde oppervlakte de meest cel zonder achtergrond voor de hele afbeelding. Als alternatief, selecteer representatieve gebieden voor het meten van die regio's van inconsistentie door Klik Rechthoekig gebied, Ellips regioof Trace regio een regio selecteren en selecteert u Actief gebied in plaats van gehele uitsluiten Afbeelding op de Toon regio statistiekvenster (onder Analysetools). Als een vertegenwoordiger regio wordt gebruikt voor drempelmethode het beeld helder veld, dezelfde regio moet worden gebruikt voor het meten van de overeenkomstige FITC-afbeelding. Het is nuttig om het opnemen van de specifieke ruimtelijke statistiek (links, boven, breedte, hoogte, gebied, Perimeter) die is gekoppeld aan die vertegenwoordiger regio dus dezelfde regio zal worden gevonden en gemeten op de overeenkomstige FITC-afbeelding.
Om te voorkomen dat een opeenhoping van gegevens op de harde schijf die leiden de computer tot zullen te vertragen, kan een externe harde schijf voor gegevensopslag worden gekocht. Een andere optie voor gegevensopslag en vergemakkelijken het delen van gegevens is de CyVerse bio-informatica platform. Maak een account op het CyVerse-systeem door naar http://www.cyverse.org/ te gaan. Eenmaal ingelogd, lanceren de ontdekking milieu en selecteer vervolgens "Log in CyVerse". Selecteer "gegevens" en ga naar je de map. Als de afbeeldingsstapel op de lokale computer is en selecteer vervolgens "uploaden" en vervolgens "Eenvoudig uploaden van Desktop". Zoek het afbeeldingsbestand voor de stapel en selecteer voor uploaden. Het bestand of een map kan worden gedeeld met medewerkers, als zij een CyVerse account hebt en gemachtigd zijn. Delen van de datamap aan het grote publiek, moet dat metagegevens worden toegevoegd voor elk bestand met CyVerse goedgekeurde normen. Deze procedure zal niet hier worden besproken omdat dit niet binnen de werkingssfeer van dit werk.

Hier zullen we laten zien van een methode voor het meten van het effect van shear stress op de vorming van TL Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilms met behulp van een geautomatiseerde hoger-throughput microfluidic systeem.
Biofilms zijn gemeenschappen van micro-organismen, zoals bacteriën, georganiseerd door een polymere extracellulaire stof die zijn aangesloten op een drager, en worden meestal gevonden op het raakvlak tussen een vloeistof en een vaste oppervlakte1. Deze biofilm gemeenschappen kunnen gunstig zijn voor het milieu, zoals verbetering waterkwaliteit in watervoorziening lijnen en bioremediatie van weerbarstige verbindingen2,3. Biofilms kunnen echter ook zeer schadelijk voor de gezondheid van de mens met ongewenste gevolgen worden. Bijvoorbeeld, zijn medische hulpmiddelen, zoals heup en knie implantaten, een soort oppervlak indien accumulatie van biofilm is een uitdaging geweest en veroorzaakt ernstige medische complicaties4,5. Biofilms kunnen ook natuurlijke watersystemen, zoals rivieren, meren, invoeren en watervoorziening pijpen leidt tot verontreiniging van de bacteriën in drinkwater als gevolg van infecties6,7,8te infiltreren. Biofilms gevormd in mariene milieus voldoen aan schepen en andere door de mens veroorzaakte substraten en presenteren van een grote economische en ecologische probleem zoals verhoogde wrijving leidt tot het brandstof verbruik9,10te verhogen. Antimicrobiële coatings, zoals Tributyltin, zijn ontwikkeld om deze problemen te voorkomen, maar zijn giftig voor het zeeleven11.
P. aeruginosa is een gramnegatieve bacterie met hoge bloeiende mogelijkheden in een verscheidenheid van omstandigheden op ecologisch en nutrimental12. P. aeruginosa is een veelvoorkomende oorzaak van de Gemeenschap - en ziekenhuisinfecties en gevonden worden nauw gekoppeld aan zijn verwondingen, zoals ernstige brandwonden en immuungecompromitteerde hosts, zoals in cystic fibrosis (CF)5,12, 13, AIDS en kanker patiënten5,13. De vorming van biofilms P. aeruginosa is zwaarst verbonden met CF, waar chronische Long infecties de belangrijkste doodsoorzaak voor deze ziekte5 zijn.
Een referentiestam van P. aeruginosa, PA01, in dit verslag wordt gebruikt en is genetisch gemodificeerd om uit te drukken een verbeterde groen fluorescent proteïne (PA-EGFP). EGFP vertegenwoordigt een gemuteerde vorm van GFP met grotere fluorescentie-eigenschappen waarmee in situ biofilm analyse met behulp van fluorescentie microscopie14,15,16. Dit type fluorescentie analyse is gunstig voor de studie van biofilms omdat GFP niet aanzienlijk met celgroei en functie17 interfereert. Bijvoorbeeld, groeide Escherichia coli cellen die waren gelabeld met GFP goed en continu zonder eventuele toxische effecten in vergelijking met de controle bacteriën17hebben geleden. Andere verslagen staving van deze bewering18,19,20. Bovendien, het gebruik van een fluorescerende verslaggever zoals EGFP is snel en eenvoudig, maar alleen levende cellen zal gemeten worden omdat dode cellen snel ophouden te lichten van21.
Biofilms kunnen groeien onder verschillende milieuomstandigheden, met inbegrip van die met een verschillende spuitsnelheid. Bijvoorbeeld kunnen films groeien in hoge shear stress, zoals in rivieren, waar de stroom van hoge waterstanden tot een grotere microbiële diversiteit22 leiden. Tegendraads, stilstaand water in vijvers of mondelinge biofilms ervaring een veel lagere schuintrekken kracht23. Naast debiet, zijn er andere factoren die van invloed zijn biofilm adhesie, met inbegrip van de oppervlakteruwheid en hydrophobicity, samenstelling van de media, en zelfs de bacteriële cel oppervlakte1,4,7, 24. voorwaarden ook variatie in de ruimtelijke structuur of de morfologie van een biofilm kunnen veroorzaken. Dit omvat omgevingscondities zoals schuifspanning uitgeoefend door een bewegende vloeistof of kleurovergangen in de beschikbaarheid van nutriënten en biologische factoren zoals de soorten presenteren in het systeem, beweeglijkheid van cellen en de specifieke eiwitten in de extracellulaire aanwezig polymere stof25,26,27. Onder bepaalde omstandigheden zullen de biofilm gazon-achtige (glad en plat), terwijl onder andere omstandigheden de biofilm zal worden ruwe, pluizig of zelfs paddestoel-achtige28. Terwijl de kwalitatieve verschil tussen biofilm gazons en paddestoel structuren duidelijk kan worden gezien in de microscopische beelden, vereist de relatie tussen film structuur en biologische processen binnen de film systematische en kwantitatieve methoden voor het beschrijven van de morfologie. Morfologische eigenschappen voorgesteld voor studie door onderzoekers behoren Fractale dimensie, diffusional lengte, porositeit, microcolony gebied op het substraat, microcolony volume, ruwheid coëfficiënt en textuur entropie29,30 .
Bioreactoren worden gebruikt in de studie van biofilms na te bootsen van echte leven voorwaarden31. Infuus stroom reactoren (DFR) vertegenwoordigen een lage-shear omgeving waar voedingsstoffen in media stromen langzaam over cellen die zijn verbonden aan een oppervlak na verloop van tijd om te vormen van een biofilm met een hoge cel dichtheid32. CDC reactoren zijn bioreactoren waarmee een hoge shear stress vloeistof omgeving door tegengaan van een opzwepende staaf die continu binnen de media draaien is tank33gevuld. Deze soorten bioreactoren zijn eenvoudig op te zetten, maar ze zijn beperkt in omvang vanwege de relatief lage steekproefgrootte, de hoge consumptie van media, grote hoeveelheden biohazardous afval geproduceerd uit media druppelen stromen variërend van 125 µL/minuut voor infuus stroom reactoren meer dan 1 mL/min voor CDC reactoren, en de noodzaak om de autoclaaf grote hoeveelheden afval-en glaswerk en media34. Biofilms groeien niet gelijkmatig over het oppervlak in een infuus stroom reactor omdat de lage schuintrekken van media veroorzaakt achterstand langs de grotere conglomeraten van P. aeruginosa bacteriën dus, de biofilm groei niet heel glad is en de ongelijke monsters mag gemakkelijk geanalyseerd met fluorescentie microscopie35,36 .
Enkele gemeenschappelijke bioreactor beperkingen worden overwonnen met behulp van een middellange-throughput microfluidic bioreactor, waar alleen milliliter van media nodig zijn, en de reactie-platen zijn klein en gemakkelijk wegwerp na autoclaaf37. Bovendien, afhankelijk van het aantal putten, vele replicaties kunnen worden uitgevoerd in slechts één reactor uitvoert, die voorziet in voldoende hoeveelheid gegevens zinvolle statistische analyse uit te voeren. In Figuur 1staan de verschillende onderdelen van het systeem van de microfluidic-microscopie voorzien in gecontroleerde omstandigheden, met inbegrip van temperatuur en tarief38,39,40, stromen. De bioreactor gaat gepaard met fluorescentie microscopie te visualiseren van de fluorescentie van de EGFP tag in PA01 onder laag toegepast door hoge shear voorwaarden die zal meer realistische scenario's die worden aangetroffen in de omgeving of op het gebied van biomedische na te bootsen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figuur 1 : Individuele componenten van het systeem Microfluidic. De afzonderlijke componenten staan van links naar rechts: 1. CCD Camera, 2. hoge resolutie Inverted Microscoop met geautomatiseerde toneel, geautomatiseerde fluorescentie Module en Autofocus Module, 3. plaat fase 4: Imaging system Interface, 5: handleiding Microscoop fase Controle, 6: Damp Trap, 7: Imaging systeem Controller (inclusief temperatuur Controller), 8: Hardware Controllers, 9: fluorescentie Controller, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: externe harde schijf voor de opslag van de beelden, 12: PC-werkstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Een uittreksel van de microfluidic plaat is afgebeeld in Figuur 2. De meest gebruikte platen bestaan uit 48 putten. Een experiment vereist een inlaat en een uitlaat wells, een totaal van 2 putten. Dit zorgt voor 24 gelijktijdige experimenten die kunnen worden uitgevoerd met verschillende experimentele omstandigheden, zoals bacteriestammen, antimicrobiële behandelingen en media varieerde van kanaal tot kanaal en schuintrekken stroom voor elke kolom van zes kanalen gecontroleerd. De experimentele temperatuur wordt ook geregeld met één temperatuur instelling in de plaat. De microfluidic kanalen tonen dat elk kanaal heeft een serpentine streek om te zorgen voor voldoende tegendruk en gecontroleerde schuintrekken.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figuur 2: visualisatie van de microfluidic kanalen en kijkvenster. Twee inlaat en uitlaat putten met de kanalen van de microfluidic verbinden worden gemarkeerd met rode en groene kleurstoffen. De kleurstof maakt een serpentine regio zichtbaar in elk kanaal die voldoende tegendruk en gecontroleerde schuintrekken tijdens vloeistofstromen worden gemaakt. Elke weergavekanaal (binnen de rode cirkel) kan worden beeld met gewenste golflengten. Weergegeven zijn helder veld (boven) en TL (onder) microscopie beelden van één kanaal met een PA01-EGFP biofilm met behulp van een 20 X doelstelling. Schaal bar = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Een stap voor stap handleiding vindt waarmee gebruikers van microfluidic bioreactoren die zijn gekoppeld aan fluorescentie microscopie te voeren roman biofilm experimenten met behulp van verschillende schuintrekken omgevingen. Deze methode zal toestaan voor de uitbreiding van experimenten met andere micro-organismen naast bacteriën, zoals schimmels en algen, die medische en milieu toepassingen41,42,43 hebben. De gedetailleerde aanpak wordt beschreven hoe PA01-EGFP cultuur, enten van een 48-well-plate opzetten van de microfluidic apparaat en de software, de fluorescente microscoop, en zetten demonstreren de software analyse om te verkrijgen van de biofilm dekking, het groeitempo op jaarbasis, en morfologische eigenschappen zoals oppervlakteruwheid.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Een hogere gegevensdoorvoer microfluidic in vitro bioreactor fluorescentie microscopie gekoppeld is gebruikt om te studeren bacteriële biofilm groei en morfologie, met inbegrip van Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Hier beschrijven we hoe het systeem kan worden gebruikt om te studeren de kinetiek van de groei en de morfologische eigenschappen zoals de oppervlakteruwheid en textuur entropie van P. aeruginosa stam PA01 die een verbeterde groen fluorescent proteïne (PA01-EGFP uitdrukt ). Een gedetailleerd protocol zal beschrijven hoe om te groeien en het zaaizaad PA01-EGFP culturen, hoe u omhoog de Microscoop en de autorun, en voeren de beeldanalyse om te bepalen van groei en morfologische eigenschappen met behulp van een verscheidenheid van shear krachten die worden gecontroleerd door de microfluidic apparaat. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van een techniek ter verbetering van de studie van PA01-EGFP biofilms die uiteindelijk kan worden toegepast jegens andere stammen van bacteriën, schimmels of algen biofilms met behulp van de microfluidic platform.

Figuur 4 een toont het percentage thresholded gebied na verloop van tijd van een 24u op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2uitgevoerd. De biofilm dekking of procent drempel oppervlakte (C [%]) is verschillend voor alle instellingen van de drie schuintrekken. De biofilm dekking was snelste op 1.0 dyne/cm2 shear, waar de drempel gebied steeg van 2-5% tot 100% na 200 min van groei en een stationaire fase na 400 min te bereiken. Op 0.5 dyne/cm2, de biofilm dekking werd uitgesteld en begon te verhogen op 400 min 100% dekking na 800 min te bereiken. De laagste schuintrekken op 0.2 dyne/cm2 duidelijk de langzaamste toename van de dekking van de biofilm, waar procent dekking beginnen te stijgen op 500 min maar nooit buiten het gebied van 65% drempel bereikt. Deze resultaten aangegeven Schuintrekken een directe invloed gehad in de dekking van de oppervlakte van de biofilm. De hogere schuintrekken leek te zijn een meer optimale voorwaarde voor groei van de biofilm, eventueel wijten aan het feit dat de media de bacteriën met meer voedingsstoffen, verstrekt zodat de biofilm sneller kan vermenigvuldigen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figuur 4: procentuele drempel gebied, totale biofilm accumulatie, ruwheid coëfficiënt, en textuur entropie. a) percentage drempel gebied (C [%]) na verloop van tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. b) total biofilm accumulatie (relatieve maatregel) als een functie van de tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode. De zwarte lijnen zijn kleinste kwadraten past op een exponentiële model. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. c) ruwheid coëfficiënt van PA01-EGFP met behulp van shear stress waarden van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 gecontroleerd van meer dan 24 h. gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken. d) textuur entropie van PA01-EGFP met behulp van shear stress waarden van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. Gegevens is afkomstig van één kanaal voor elke voorwaarde schuintrekken (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Figuur 4 b komt overeen met de bevindingen die zijn weergegeven in Figuur 4een. De biofilm accumulatie (N[rel]) werd gemeten op basis van de veronderstelling dat het GFP-signaal op een punt in een afbeelding evenredig met de dichtheid van de levende cellen op die positie is. Het blijkt dat de totale relatieve meting biofilm accumulatie verhoogd als een functie van de tijd met behulp van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2 over een 24-uurs periode, en het groeitempo van hoogste schuifspanning naar laagste schuifspanning daalde. Er is een duidelijke periode geven van exponentiële groei waaruit een kwantitatieve groei kan worden berekend.
Figuur 4 c toont de ruwheid coëfficiënt (Reen) op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. Oppervlakte ruwheid, gekwantificeerd door de ruwheid-coëfficiënt, meet de variantie in het profiel van de dikte van de film. De formele definitie is
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
waar Tik het ik-th Laagdiktemeting, Teen is de gemiddelde dikte, en N is het aantal dikte meting30. De procedure die wordt beschreven in dit onderzoek meet de dikte levende cellen zijn gekoppeld. Een platte rangschikking van cellen zal opleveren een coëfficiënt van de ruwheid van nul, terwijl aanzienlijke verschillen van dikte van het gemiddelde een ruwheid coëfficiënt groter dan 1 opleveren zal. Gelijkaardig aan de shear invloed op de groei en de dekking van de procentuele drempel van de film, de biofilms tentoongesteld verschillende topografieën na verloop van tijd. Over het geheel genomen Reen daalde na verloop van tijd voor alle schuintrekken omstandigheden die aangeeft dat alle oppervlakken zachter werd. Echter, in vergelijking met de laagste shear van 0.2 dyne/cm, de hogere schuintrekken instellingen van 0.5 en 1.0 dyne/cm2 resulteerde in een gladder oppervlak na verloop van tijd die aangeeft dat een snellere schuintrekken stroom tot soepeler en gelijkmatiger oppervlak, en de hoogste schuintrekken van bijgedragen 1.0 dyne/cm2 bereiken onder 0.2 Reen.
De gladheid, regelmaat of ruwheid van een oppervlak kan ook worden uitgedrukt in textuur entropie (TE). TE is een eigenschap die in de beeldanalyse wordt gebruikt voor het meten van de mate van willekeur, in een tweedimensionaal beeld. De berekening is gebaseerd op de grijze niveau co voorval matrix, gedefinieerd door Haralick et al.., die kijkt of de pixelwaarden op één locatie zijn gecorreleerd met pixelwaarden op een andere locatie44. Een hoge mate van correlatie zal leiden tot lage entropie. Figuur 4 d toont de TE op schuintrekken stromen van 0.2, 0.5 en 1.0 dyne/cm2. De TE verhoogd na verloop van tijd voor alle schuintrekken voorwaarden maar de hoogste schuifspanning 1.0 dyne/cm bereikt de maximale TE (1.0) eerder dan de lagere schuifspanningen op 900 min. De laagste schuintrekken van 0.2 dyne/cm2 had de laagste TE (0.8) bereikt zijn maximum na 1000 min. Echter bereikt de tussenliggende schuifspanning van 0.5 dyne/cm2 zijn maximale TE (1.2) veel later dan de hoge of lage shear stress voorwaarden.
De coëfficiënt van de ruwheid en de TE meten verschillende functies. Terwijl een vlakke film, een lage ruwheid coëfficiënt en lage entropie hebben zou, kan een film met aanzienlijke variatie in dikte zou hebben een hoge ruwheid coëfficiënt maar nog steeds lage entropie als de variatie sinusvormige in plaats van willekeurige is. In dit geval Reen daalde met verhoogde shear stress en tijd terwijl de trends TE kunnen niet rechtstreeks verband houden met de shear stress toegepast op biofilm vorming na verloop van tijd.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figuur S1 : Afbeelding van de verovering van de controle software windows. Software venster met Multi-dimensionale overname menu openen (boven). Controlemodule instellen voor een AutoRun (onder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figuur S2 Beeld vastleggen van de software voor de herziening van de gegevens. Toepassingsvenster na het selecteren van de gegevensset van belang met behulp van de Review Multi Dimensional Data tool in het menu Extra van de analyse . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Hier beschrijven we het gebruik van een hogere gegevensdoorvoer microfluidic bioreactor in combinatie met een fluorescente microscoop voor de analyse van shear stress effecten op Pseudomonas aeruginosa biofilms uiting van groen fluorescent eiwitten, met inbegrip van instrument instellen, de bepaling van biofilm dekking, groei en morfologische eigenschappen.

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, over biofilmontwikkeling, zoals het identificeren van belangrijke omgevingsomstandigheden, die de biofilmgroei en gedragskenmerken beïnvloeden tijdens de ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de multi-channeled, micro-fluidic platen, zorgen voor de snelle verwerving van statistisch significante resultaten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de biofilmstructuur, kan deze ook worden toegepast op de studie van antibioticabehandelingen en bioremediatie.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben, omdat zorgvuldige aandacht voor de details van het protocol en nauwgezette vaardigheden nodig zijn. Om een fout van de verbinding van het instrument op de software te voorkomen, schakelt u eerst het werkstation van de pc in, gevolgd door de fluorescentiemodule. Zorg ervoor dat de fluorescentie sluiter is ingeschakeld, en zet de hardware controllers.Schakel vervolgens de imaging-systeemcontroller en de CCD-camera in. Zet dan het beeldstation aan. Wanneer alle apparatuur klaar is, start u de controletoepassing en voert u het kenteken in op het etiket aan de zijkant van de plaat.Voor priming, eerst verwijderen van de 48 goed micro-fluidic plaat uit de verpakking, zonder het aanraken van het glas oppervlak aan de onderkant van de plaat, en maak de glazen schuif aan de plaat bodem, met een lensweefsel. Om de micro-fluidic kanalen prime, pipet 200 microliters van 37 graden celsius minimaal medium in de output goed, het verzorgen van bellen te voorkomen. Plaats vervolgens de plaat op het plaatpodium.Veeg de interface met ethanol, afdichting op de plaat stadium zodra de ethanol is gedroogd. In de handmatige modus op de controlemodule, stel de vloeistof als Luria-Bertani bouillon op 37 graden Celsius, en max pure als vijf dym per vierkante centimeter. Klik op de uitgangsputten om de stroom van de uitvoer naar de invoer goed te activeren, om de kanalen te primen.Na vijf minuten, pauzeer de stroom voor te bereiden op zaaien, en voorzichtig verwijderen van de plaat van het podium. Vervolgens, aspirate een resterende medium uit de uitgang goed zonder het verwijderen van een medium uit de binnenste cirkel die leidt naar de micro-fluidic kanalen. Om de experimentele kanalen te zaaien, voeg 300 microliter van minimaal medium toe aan de inputput, gevolgd door de toevoeging van 300 microliter van bacteriële cultuur, in de outputput.Breng de plaat terug naar het beeldvormingsstadium om de interface met ethanol af te vegen voordat u deze op de plaat plaatst en gebruik de live camerafeed om zich op één kanaal te concentreren. Terwijl visueel toezicht op de live feed, hervat de stroom op 1 tot 2 dym per vierkante centimeter voor ongeveer 2 tot 4 seconden, Om de cellen in staat te stellen het experimentele kanaal, maar niet de serpentine kanalen in te voeren, en laat de plaat op de temperatuur gecontroleerde fase voor een uur, zodat de cellen te hechten. Verwijder aan het einde van de bevestigingsperiode de plaat voorzichtig uit het stadium en haal de bacteriën goed uit de uitgang zonder het kanaal te storen.Gebruik vervolgens een nieuwe pipettip om het medium uit de invoerputten te verwijderen. Open in de software een meerdimensionale acquisitie om de aankoop van het microscoopbeeld te controleren en selecteer time lapse, meerdere trapposities en meerdere golflengten. Maak op het tabblad opslaan een eenvoudige basisnaam, waarbij u ervoor zorgt dat de basisnaam incroments als het bestand bestaat, wordt gecontroleerd.Neem alle essentiële details van het experiment op in de beschrijving. Klik op map selecteren om de map te selecteren waarin alle bestanden worden opgeslagen onder het tabblad timelapse, de duur van de experimentele tijd aan te passen tot 24 uur en het tijdsinterval in te stellen om beelden om de vijf minuten in het hele experiment te verkrijgen. Gebruik de live camera feed en de 10x doelstelling om de podiumposities in te stellen, gericht op het midden van het kanaal, gelegen boven of onder de kanaalnummers gegraveerd op de plaat.Schakel over naar de 20x-doelstelling en zoek het optimale weergavegebied en het brandpuntsvlak binnen het kanaal. Voeg vervolgens de podiumpositie toe aan de lijst met de nieuwe instellingen. Onder de golflengten menu, stel het aantal golflengten op 3, en stel de eerste golflengte fitc 100%-camera, met een tien milliseconden belichtingstijd, de tweede golflengte op brightfield 50%camera 50%zichtbaar, met een minimale belichtingstijd van 3 milliseconden en de derde golflengte voor alle gesloten, zodat er geen licht blijft op het laatste kanaal tussen de overname tijden.Open in het menu AutoRun bewerken het tabblad Protocolinstellingen en stel een nieuw protocol in met een duur van 24 uur met de stroom die in de voorwaartse richting is ingesteld op de juiste experimentele schuifsnelheid. Klik op Toevoegen en opslaan om het protocol op te slaan en open het tabblad volgorde-instelling. Als u een nieuwe reeks wilt instellen, selecteert u Luria-Bertani bouillon op 37 graden, als de standaardvloeistof voor alle kanalen.Selecteer onder stap iteratie 1 voor kanalen 1 tot en met 12 het protocol met de eerste experimentele schuifsnelheid en schakel alle kanalen in. Voor kanalen 13 tot en met 24 selecteert u het protocol met de tweede experimentele afschuifsnelheid en schakel u alle kanalen in. Selecteer vervolgens Toepassen en Opslaan als om de reeks op te slaan en het menu AutoRun te openen om de opgeslagen reeks te selecteren die moet worden gebruikt voor de AutoRun.Om het getimede biofilmexperiment te instellen, voeg je tot 1300 microliters steriel minimaal medium toe in de inputput van de micro-fluidic plaat en breng je de plaat terug naar het beeldvormingsstadium. Veeg vervolgens de interface met ethanol af en verzegel de plaat. Controleer of de protocollen en sequenties correct zijn ingesteld.Selecteer start, om de AutoRun te starten en klik onmiddellijk op acquire om de microscoopafbeeldingsverzameling te starten. Klik aan het einde van de eerste afbeeldingsverwerving op Pauzeren en selecteer de live beeldmodus in de golflengte van brightfield. Selecteer ga naar elke fasepositie en selecteer ingesteld op stroom om de nieuwe instellingen in te stellen.Klik vervolgens op hervatten voordat u de volgende geplande acquisitie start. In dit representatieve getimede biofilmgroeiexperiment was de biofilmdekking, of procentuele drempeloppervlak, voor alle drie de afschuifinstellingen anders, wat aangeeft dat de schaar een directe invloed had op de dekking van het biofilmoppervlak. De totale relatieve meting van de biofilmaccumulatie, steeg als functie van de tijd, waarbij het groeitempo afnam van de hoogste afschuifspanning tot de laagste afschuifspanning.Onder elke voorwaarde was er ook een duidelijke periode van exponentiële groei waaruit een kwantitatief groeipercentage kon worden berekend. Over het geheel genomen daalde de ruwheidscoëfficiënt in de loop van de tijd onder alle afschuifomstandigheden, wat erop wijst dat alle biofilmoppervlakken gladder werden. Echter, in vergelijking met de laagste afschuif, de hogere afschuifinstellingen resulteerde in een gladder oppervlak na verloop van tijd, wat aangeeft dat een snellere schuifstroom bijdraagt aan een gladder en gelijkmatiger oppervlak.Verder, de textuur entropie, of de willekeur in de morfologie, toegenomen na verloop van tijd voor alle van de schuifomstandigheden. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de opgegeven volgorde te volgen en de tijd te nemen om elke stap nauwkeurig uit te voeren. De benodigde vaardigheden kunnen een paar runs te beheersen.Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals HBLC of GCMS, om aanvullende vragen te beantwoorden over de concentraties van substraights, zoals glucose, die worden verbruikt. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biofilms om algemene stroomomgevingen in realtime te verkennen met gecontroleerde experimentele omstandigheden en hydrotherapiebemonstering. Vergeet niet, dat het werken met BSL2 bacteriële stammen kan zeer gevaarlijk zijn, en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermende apparatuur en het gebruik van de juiste afvalprotocollen moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematische analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Met behulp van Adhesive gestructureerd om Construct 3D Paper microfluïdische apparaten

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...