Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Ce travail a été rendu possible grâce à des subventions de l’Institut National pour générales Medical Sciences (NIGM) (5P20GM103427), une composante de la National Institutes of Health (NIH)

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La procédure d’analyse de système et image microfluidique discuté ici met l’accent sur l’exécution d’expériences biofilm microfluidiques pour déterminer les propriétés morphologiques qui ne nécessitent pas l’information complète en trois dimensions que se trouve généralement du confocal études microscopiques. Il s’agissait de microcolonie couverture de substrat (pourcentage de couverture), rugosité de la surface mesurée par le coefficient de rugosité et textural entropie. Une méthode pour estimer l’accumulation de cellules de biofilm relatif total est également présentée de quel taux de croissance dans le journal de phase peut être calculée.
Il y a plusieurs étapes faible mais significatives qui devraient être mis en évidence dans cette méthode. Essuyer l’interface avec l’alcool permet d’éviter la contamination d’autres bactéries en allant de l’expérience à l’expérience, mais aussi de bien de bien dans une expérience. D’amorçage et d’amorçage sont aussi très important parce que l’amorçage permet à l’utilisateur de déterminer quels sont les canaux permettent aux médias de circuler à travers les canaux sans aucune perturbation ou colmatage. Canaux ne devrait également pas être dérangé (c.-à-d. , ils devraient être constamment pleins de médias) Après amorçage pour augmenter les chances d’une expérience réussie avec aucune bulle d’air ou l’obstruction. L’étape de semis peut varier selon le type de bactéries et doit donc être optimisée pour la fixation des cellules. Par exemple, si les cellules ne semblent pas attacher, modifications de surface peuvent avoir à se produire sur la plaque de microfluidique avant l’ensemencement ou temps d’incubation plus longs peuvent être nécessaires. Il est également essentiel pour s’assurer que le microscope est correctement configuré pour obtenir une image de mise au point et devrait être surveillé périodiquement tout au long de l’expérience pour s’assurer que les images de qualité sont obtenues. Si le focus est désactivé, le microscope peut et doit être ajusté comme l’expérience continue. Au cours de la durée d’acquisition d’image, la dernière longueur d’onde doit être défini sur Tous fermés afin d’éviter l’exposition des filtres et l’éclairage au seul canal pendant le temps d’attente qui se produit entre les acquisitions de l’image. En outre, l’analyse d’image qui détermine la couverture de surface % a été conçu dans la maison parce que le manuel de logiciel de Montage n’a pas explicitement décrit la procédure. En outre, afin d’élargir l’analyse d’image et de déterminer d’autres caractéristiques telles que la rugosité de surface, etc.., open source code basé sur Python45 a été développé en interne et partagé sur le dépôt gitHub. Il y a aussi des limites sur la quantité de données peut être stockée et gérée sur le disque dur local, donc un disque dur externe ou le partage de données en ligne est nécessaire comme CyVerse46.
Bioréacteurs conventionnels, tels que le réacteur de la CDC et le goutte à goutte flux reactor34, nécessitent beaucoup de médias, fournissent moins la taille des échantillons et exigent une grande quantité de stérilisation de l’équipement. En revanche, les avantages de cette plateforme de débit supérieur incluent la capacité de contrôle shear, débits, et l’hypothèse que l' in vitro les expériences étroitement ressemblent à des conditions in vivo . Les inconvénients du système incluent les multiples accessoires et logiciels nécessitant une méticuleuse de configuration qui doivent être exécutées dans l’ordre correct des événements. En outre, le manuel fourni pour l’équipement n’explique pas entièrement chaque étape des expériences et les commandes de logiciels, et en conséquence, beaucoup d’erreurs se produire au cours des expériences, y compris l’obstruction des canaux, manque de croissance ou de la saisie, images de microscopie haute qualité manque ou de films. L’instrument lui-même et consommables, tels que les plaques de la microfluidique, sont aussi relativement coûteux avec un prix de plus de 200 $ par assiette et ne sont pas réutilisables. Ainsi, alors que la technique donne des résultats puissants, l’expertise technique nécessaire à son utilisation est relativement élevée et nécessite une formation répétée par des experts dans le domaine. Ce rapport tente de résoudre ce problème en fournissant un guide pour les nouveaux utilisateurs de ces bioréacteurs afin d’étudier les caractéristiques de biofilms.
Le système microfluidique, qui est en mesure d’effectuer l’analyse cellulaire, a gagné une attention considérable pour diverses modalités scientifiques, comme en microbiologie, immunologie, hématologie, oncologie et recherche sur les cellules souches. Plus précisément, la technologie a donné lieu à plusieurs publications décrivant les sujets qui sont très pertinents pour applications médicales37,47, y compris microbienne buccale adhérence48, détermination des effets des biosurfactants sur Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus49,50, héberger pathogène dans51 d’e. coli, Streptococcus de respect52et le traitement de la fibrose kystique53. Compte tenu du fait que ce système microfluidique est très polyvalent, il est prévu que des systèmes de plus en plus seront distribuées dans le monde entier.
Certaines étapes de protocole spécifique doivent être examinées attentivement. Médias peut être dilué à 50 % avec dH2O afin d’éviter les bulles et colmatage, mais n’était pas nécessaire en l’espèce. La valeur spécifique OD600 utilisée pour l’ensemencement doit être déterminée en utilisant les essais préliminaires d’une expérience de croissance pour voir ce qui fonctionne le mieux pour l’ensemble particulier de conditions d’utilisation. Bulles dans les puits avant le scellage peuvent conduire à des bulles d’air dans les canaux microfluidiques et doivent être retirés par sauté ou sucée dehors avec un embout de la pipette. Il est important de garder des bactéries sur les petits canaux de serpentines. En ayant des volumes égaux des médias dans l’entrée et la sortie au cours du processus d’amorçage, débit en raison de pressions exercées par le volume de liquide sera contrôlée donc flux est uniquement en raison de la pression appliquée par le système. Les distances d’étalonnage doivent être configurés lors de l’installation par le représentant de la compagnie. Ces paramètres sont spécifiques pour chaque caméra.
Il y a plusieurs problèmes qui se produisent lors de la recherche le seuil plus représentatif d’une image. Définir les valeurs de seuil maximal peut être difficile si l’intensité du pixel moyenne dans toutes les régions de l’arrière-plan ne concordent pas causé en sélectionnant une position d’allure qui n’est pas au centre du chenal ou de débris sur la plaque. Sous la MM Standard, cliquez sur processuset puis sélectionnez arrière-plan et Correction d’ombrage outil de correction pour ces incohérences. Toutefois, cet outil n’est généralement utile si l’utilisateur a pris des images des canaux avant d’ensemencer qu’ils peuvent utiliser comme images de référence. Ou, si l’arrière-plan/ombrage référence images ne sont pas disponibles, l’utilisateur devra exercer son jugement pour définir une valeur seuil qui couvre la zone la plus cellule sans inclure l’arrière-plan de l’image entière. En sélectionnant des zones représentatives de mesurer qui excluent les régions d’incohérence par clic Région rectangulaire, Région de l’Ellipseou Trace région pour sélectionner une région et sélectionnez Région Active plutôt que ensemble Image sur la fenêtre Afficher les statistiques de région (sous Outils d’analyse). Si vous utilisez une région représentative de seuillage de l’image du champ lumineux, la même région doit être utilisée pour la mesure de l’image correspondante de la FITC. Il est utile d’enregistrer les statistiques spatiales spécifiques (gauche, haut, largeur, hauteur, aire, périmètre) associés à cette région représentante donc on trouvera la même région et mesurée sur l’image correspondante de la FITC.
Pour éviter une accumulation de données sur le disque dur qui permettra de ralentir l’ordinateur, un disque dur externe peut être acheté pour le stockage de données. Une autre option pour le stockage des données et de faciliter le partage de données est la plate-forme de bioinformatique de CyVerse. Créer un compte sur le système de CyVerse en allant sur http://www.cyverse.org/. Une fois connecté, lancer l’environnement de découverte puis sélectionnez « Log in CyVerse ». Sélectionnez «données» et naviguez jusqu'à vous êtes le dossier. Si la pile de l’image se trouve sur l’ordinateur local, puis sélectionnez «télécharger» puis «Upload Simple de bureau». Trouver le fichier d’image pile et sélectionnez pour le téléchargement. Le fichier ou un dossier peut être partagé avec des collaborateurs s’ils ont un compte CyVerse et disposent d’autorisations. Partage du dossier data auprès du grand public exige que les métadonnées ajoutés pour chaque fichier à l’aide CyVerse normes approuvées. Cette procédure n’est pas discutée ici parce que ce n’est pas dans le cadre de ce travail.

Ici, nous allons démontrer une méthode pour mesurer l’effet de la contrainte de cisaillement sur la formation de fluorescent biofilms Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 à l’aide d’un système automatisé de microfluidique un débit plus élevé.
Les biofilms sont des communautés de microorganismes, tels les bactéries, organisés par une substance polymérique extracellulaire qui sont attachés à un support et se trouvent généralement à l’interface entre un liquide et une surface solide1. Ces communautés de biofilm peuvent être bénéfiques pour l’environnement, tels que l’amélioration de qualité de l’eau dans les conduites d’eau et dans la biorestauration des récalcitrants composés de2,3. Toutefois, les biofilms peuvent également être très nocifs pour la santé humaine avec des conséquences fâcheuses. Par exemple, des dispositifs médicaux, tels que les implants de la hanche et du genou, sont un type de surface où l’accumulation de biofilm a été un défi et provoque des complications médicales graves4,5. Les biofilms peuvent également entrer dans les systèmes naturels de l’eau, comme les rivières et lacs et s’infiltrer dans les conduites d’eau menant à la contamination de bactéries dans l’eau potable entraînant infections6,7,8. Les biofilms formées en milieu marin adhèrent aux navires et autres substrats artificiels et présenter un problème économique et environnemental majeur comme la friction accrue conduit à augmenter la consommation de carburant9,10. Des revêtements antimicrobiens, tels que de tributylétain, ont été développés pour prévenir ces problèmes, mais sont toxiques pour les animaux marins,11.
P. aeruginosa est une bactérie Gram-négative avec hautes capacités prospères dans une variété de conditions environnementales et éducationnels12. P. aeruginosa est une cause fréquente d’infections contractées à l’hôpital et à la communauté et trouvé pour être étroitement associés aux blessures, tels que des brûlures graves et les immunodéprimés, comme dans la mucoviscidose (CF)5,12, 13, sida et cancer patients5,13. La formation de biofilms P. aeruginosa a été plus gravement connectée au CF, où les infections pulmonaires chroniques sont la principale cause de mortalité pour cette maladie5.
Une souche P. aeruginosa, PA01, référence est utilisée dans le présent rapport et est génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente verte améliorée (PA-EGFP). EGFP représente une forme mutante de GFP avec une plus grande propriétés de fluorescence qui permet l’analyse in situ biofilm à l’aide de la microscopie de fluorescence14,15,16. Ce type d’analyse de fluorescence est avantageux pour l’étude des biofilms car GFP ne gêne pas significativement la croissance cellulaire et la fonction17. Par exemple, des cellules d’Escherichia coli qui ont été marqués avec GFP a grandi bien et en permanence sans avoir subi aucun effet toxique en comparaison avec les bactéries de contrôle17. Autres rapports de justifier cette revendication18,19,20. En outre, l’utilisation d’un reporter fluorescente comme EGFP est rapide et simple, pourtant on mesurera des cellules vivantes uniquement parce que les cellules mortes cessent rapidement de réagissent en21.
Les biofilms peuvent se développer dans des conditions environnementales différentes, y compris ceux avec des débits différents. Par exemple, films peuvent croître dans des contraintes de cisaillement élevées, comme dans les rivières, où les conditions d’écoulement de l’eau mènent à une plus grande diversité microbienne22. Au contraire, l’eau stagnante dans les étangs ou les biofilms orale expérience une beaucoup plus faible cisaillement force23. En plus de la vitesse d’écoulement, d’autres facteurs qui influencent l’adhérence du biofilm, y compris la rugosité de la surface et l’hydrophobicité, composition de médias, et même le bacterial cell surface1,4,7, 24. conditions peuvent aussi causer des variations dans la structure spatiale ou la morphologie d’un biofilm. Cela comprend les facteurs environnementaux tels que la contrainte de cisaillement exercée par un fluide en mouvement ou dégradés dans la disponibilité des nutriments et de facteurs biologiques, tels que les espèces présentent dans le système, la motilité des cellules et les protéines spécifiques présentes dans l’extracellulaire substance polymérique25,26,27. Sous certaines conditions, le biofilm sera pelouse ressemblant (lisse et plat), alors que dans d’autres conditions le biofilm vont être rugueuse, moelleux, ou même champignon28. Alors que la différence qualitative entre les pelouses de biofilm et structures aux champignons peut être clairement vus dans des images microscopiques, comprendre la relation entre structure cinématographique et des processus biologiques dans le film il faut systématique et quantitative méthodes de description de la morphologie. Propriétés morphologiques suggérées pour étude par les chercheurs incluent porosité, dimension fractale, longueur de diffusion, zone microcolonie au substrat, microcolonie volume, coefficient de rugosité et entropie texturales29,30 .
Bioréacteurs sont utilisés dans l’étude de biofilms pour imiter la vie réelle des conditions31. Réacteurs d’écoulement goutte à goutte (DFR) constituent un environnement de faible cisaillement où les éléments nutritifs dans les médias passent lentement dans l’ensemble de cellules qui sont attachés à une surface au fil du temps pour former un biofilm avec une cellule haute densité32. Les réacteurs de CDC sont des bioréacteurs qui créent un environnement fluide haute contrainte de cisaillement en contrôlant un agitateur qui tourne en permanence au sein des médias remplis le réservoir33. Ces types de bioréacteurs sont simples à mettre en place, mais elles sont limitées dans le champ d’application en raison de la taille de l’échantillon relativement faible, la forte consommation des médias, de grandes quantités de déchets danger biologique produit à partir de flux de goutte à goutte de médias allant de 125 µL/min pour les réacteurs d’écoulement goutte à goutte à plus de 1 mL/min pour les réacteurs de la CDC et la nécessité d’autoclave grandes quantités de déchets et verrerie médias34. Biofilms ne poussent pas uniformément sur toute la surface dans un réacteur à flux goutte à goutte parce que la faible cisaillement des médias provoque la fuite le long des plus grands conglomérats de P. aeruginosa bactéries donc, la croissance de biofilm n’est pas très lisse et les échantillons inégales ne peut pas être facilement analysés par microscopie de fluorescence35,36 .
Certains problèmes de bioréacteur habituels sont surmontés à l’aide d’un bioréacteur à moyen débit microfluidique, où seulement les millilitres de médias sont nécessaires, et les plaques de réaction sont petites et facilement jetable après autoclavage37. En outre, selon le nombre de puits, nombre de reproductions peut être effectuée dans un seul réacteur exécuter, qui fournit une quantité suffisante de données pour effectuer une analyse statistique significative. Dans la Figure 1, les différentes composantes du système microfluidique-microscopie qui permettent des conditions contrôlées, y compris la température et débit taux38,39,40, sont affichées. Le bioréacteur est couplé avec la microscopie de fluorescence pour visualiser la fluorescence de la balise EGFP dans PA01 sous appliqué en bas par le biais de conditions de cisaillement élevé qui imitent des scénarios plus réalistes qui sont rencontrés dans l’environnement ou dans le domaine biomédical.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figure 1 : Les composants individuels du système microfluidique. Les composants individuels sont répertoriés de gauche à droite : 1. caméra CCD, 2. haute résolution des Microscope inversé avec scène automatisé, Module de Fluorescence automatisé et Autofocus Module, 3. scène de plaque, 4 : Imaging system Interface, 5 : manuel platine du Microscope Contrôle, 6 : Piège à vapeur, 7 : Imaging system Controller (contrôleur de température y compris), 8 : contrôleurs, 9 : contrôleur de Fluorescence, 10 : Uninterruptible Power Supply, 11 : disque dur externe de stockage de l’Image, 12 : station de travail PC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Un extrait de la plaque de la microfluidique est illustré à la Figure 2. Les plaques plus couramment utilisés sont constitués de 48 puits. Une expérience nécessite une admission et puits d’une sortie, un total de 2 puits. Cela permet pour 24 expériences simultanées qui peuvent être effectuées avec des conditions expérimentales différentes, telles que les souches bactériennes, traitements antimicrobiens et les médias varie d’un canal à l’autre et contrôlée des flux de cisaillement pour chaque colonne de six canaux. La température expérimentale est également contrôlée avec un réglage de la température tout au long de la plaque. Les canaux microfluidiques montrent que chaque canal a une région serpentine pour fournir une pression suffisante et cisaillement contrôlé.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figure 2: visualisation des canaux microfluidiques et fenêtre de visualisation. Deux puits d’entrée et de sortie avec les canaux microfluidiques qui les relient sont mises en évidence avec les colorants rouges et verts. Le colorant rend visible une région serpentine dans chaque canal qui crée une pression suffisante et cisaillement contrôlé au cours de l’écoulement du fluide. Chaque canal regarde un (dans le cercle rouge) peut être photographiée avec des longueurs d’onde désirées. Sont champ lumineux (en haut) et fluorescentes (en bas) des images de microscopie d’un canal unique avec un biofilm PA01-EGFP en utilisant un objectif 20 X. Echelle = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Un guide étape par étape est fourni pour permettre aux utilisateurs de bioréacteurs de microfluidique qui sont couplés avec la microscopie de fluorescence à mener des expériences de biofilm roman à l’aide de cisaillement différents environnements. Cette méthode permettra l’expansion des expériences impliquant d’autres microorganismes en plus de bactéries, telles que les champignons et les algues, qui ont des applications médicales et environnementales41,42,43. L’approche détaillée décrit la culture PA01-EGFP, inoculer une plaque 48 puits mis en place le dispositif microfluidique et le logiciel, mis en place le microscope à fluorescence et démontrer l’analyse du logiciel pour obtenir la couverture de biofilm, le taux de croissance, et propriétés morphologiques comme la rugosité de surface.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Un débit plus élevé microfluidique in vitro bioréacteur couplé avec la microscopie de fluorescence a été utilisé pour étudier la croissance de biofilm bactérien et la morphologie, notamment Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ici, nous allons décrire comment le système peut être utilisé pour étudier la cinétique de croissance et les propriétés morphologiques tels que la rugosité de la surface et l’entropie textural de souche P. aeruginosa PA01 qui exprime une protéine fluorescente verte améliorée (PA01-EGFP ). Un protocole détaillé décrira comment faire pousser et de semences de cultures PA01-EGFP, comment définir le microscope et autorun et procéder à l’analyse d’image pour déterminer le taux de croissance et propriétés morphologiques en utilisant une variété de forces de cisaillement qui sont contrôlés par le dispositif microfluidique. Cet article fournira une description détaillée d’une technique pour améliorer l’étude des biofilms PA01-EGFP qui éventuellement peut être appliquées vers d’autres souches de bactéries, des champignons ou des algues, des biofilms en utilisant la plate-forme microfluidique.

Figure 4 une montre la zone seuillée pourcentage au fil du temps d’un 24h à flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Le biofilm couverture ou pourcentage seuil surface (C [%]) était différente pour tous les paramètres de cisaillement trois. La couverture de biofilm a été le plus rapide au cisaillement de 1,0 dyne/cm2 , où la zone du seuil a augmenté de 2 à 5 % à 100 % après 200 min de croissance et atteint une phase stationnaire après 400 min. À 0,5 dyne/cm2, la couverture de biofilm a été retardée et a commencé à augmenter à 400 min pour atteindre une couverture de 100 % après 800 min. La plus faible cisaillement à 0,2 dyne/cm2 a clairement démontré l’augmentation plus lente du biofilm couverture, où le pourcentage de couverture a commencé à augmenter à 500 min mais jamais atteint au-delà de la zone du seuil de 65 %. Ces résultats indiquent cisaillement a eu une influence directe dans la couverture de surface de biofilm. Le cisaillement plus élevé semble être une condition plus optimale pour la croissance de biofilm, peut-être dû au fait que les médias ont assuré la bactérie avec plus d’éléments nutritifs afin que le biofilm peut proliférer plus vite.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figure 4: zone du pourcentage seuil, accumulation totale de biofilm, coefficient de rugosité et entropie textural. zone du seuil a) pourcentage (C [%]) au fil du temps à l’aide de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur une 24h période. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement. b) total biofilm accumulation (mesure relative) en fonction du temps à l’aide de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur un 24h laps de temps. Les lignes noires sont des moindres carrés s’adapte à un modèle exponentiel. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement. c) coefficient de rugosité de PA01-EGFP en utilisant les valeurs de la contrainte de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 surveillé de plus de 24 heures de données a été obtenue d’un canal pour chaque condition de cisaillement. d) texture entropie de PA01-EGFP en utilisant les valeurs de la contrainte de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Figure 4 b est conforme aux résultats illustrés à la Figure 4a. L’accumulation de biofilm (N[rel]) a été mesurée basée sur l’hypothèse que le signal GFP à un point dans une image est proportionnel à la densité de cellules vivantes à cette position. Il démontre que l’accumulation totale mesure relative biofilm augmente en fonction du temps en utilisant 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur une 24h période et le taux de croissance a diminué de plus haute contrainte de cisaillement à la contrainte de cisaillement plus bas. Il y a une période de temps clair donnant une croissance exponentielle d'où un taux de croissance quantitative peut être calculé.
Figure 4 c prouver le coefficient de rugosité (Ra) au flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Rugosité de surface, quantifiée par le coefficient de rugosité, mesure l’écart dans le profil de l’épaisseur du film. La définition formelle est
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
où Tj’ai est la i-ème mesure de l’épaisseur, Tun , c’est l’épaisseur moyenne, et N est le nombre d’épaisseur mesure30. La procédure décrite dans cette enquête mesure l’épaisseur associée à des cellules vivantes. Un arrangement plat des cellules permet d’obtenir un coefficient de rugosité de zéro tandis que des variations importantes d’épaisseur par rapport à la moyenne permettra d’obtenir un coefficient de rugosité supérieur à un. Semblable à l’influence de cisaillement sur le taux de croissance et de la couverture de seuil en pourcentage du film, les biofilms expose différentes topographies au fil du temps. Dans l’ensemble, Ra diminué au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement indiquant que toutes les surfaces est devenue plus lisses. Cependant, en comparaison avec le plus faible cisaillement de 0,2 dyne/cm, les cisaillement des réglages élevés de 0,5 et 1,0 dyne/cm2 conduit à une surface plus lisse au fil du temps, indiquant qu’un flux de cisaillement plus rapide a contribué à la surface plus lisse et plus uniforme et le plus haut cisaillement de 1,0 dyne/cm2 au-dessous de 0,2 Run.
La douceur, la régularité ou la grossièreté d’une surface peut aussi être exprimée en texture entropie (TE). T’est une propriété utilisée dans l’analyse d’image pour mesurer le degré d’aléa dans une image bidimensionnelle. Son calcul est basé sur la matrice de co-occurrence des niveaux de gris, défini par Haralick et al., qui examine si les valeurs de pixels à un endroit sont corrélés avec des valeurs de pixel à un autre emplacement44. Un haut degré de corrélation conduira à faible entropie. Figure 4 d représente la TE à flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Le T’a augmenté au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement mais la contrainte de cisaillement plus élevée à 1,0 dyne/cm atteint le maximum (1.0) TE plus tôt que les contraintes de cisaillement inférieures à 900 min. La plus faible cisaillement de 0,2 dyne/cm2 avait le plus bas TE (0,8) pour atteindre son maximum après 1 000 min. Toutefois, la contrainte de cisaillement intermédiaire de 0,5 dyne/cm2 atteint sa TE maximale (1.2) beaucoup plus tard que les conditions de contrainte de cisaillement élevé ou faible.
Le coefficient de rugosité et TE mesurent des caractéristiques différentes. Alors qu’un film plat aurait un coefficient de rugosité faible et faible entropie, un film avec une variation importante épaisseur aurait un coefficient de rugosité élevée mais pourrait encore être faible entropie si la variation est sinusoïdal plutôt qu’aléatoire. Dans ce cas, Run diminue avec une augmentation des contraintes de cisaillement et de temps alors que les tendances TE ne peut pas être directement liées au shear stress appliqué à la formation de biofilm au fil du temps.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figure S1 : Saisie de la fenêtre de logiciel de contrôle d’image. Fenêtre avec menu Multi dimensionnelle Acquisition du logiciel ouvert (en haut). Module de commande pour un AutoRun (en bas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figure S2 Capture du logiciel pour l’examen des données d’images. Fenêtre de l’application après avoir sélectionné l’ensemble des données d’intérêt en utilisant l’outil d’Examen Multi dimensionnelle données dans le menu Outils d’analyse . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Nous décrivons ici l’utilisation d’un bioréacteur de microfluidique un débit plus élevé couplé avec un microscope à fluorescence pour l’analyse des effets de la contrainte de cisaillement sur les biofilms de Pseudomonas aeruginosa exprimant des protéines fluorescentes vertes, y compris les instruments mettre en place, la détermination des propriétés morphologiques, taux de croissance et couverture de biofilm.

Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, sur le développement de biofilms, tels que la façon d’identifier les conditions environnementales clés, qui affectent la croissance des biofilms et les caractéristiques comportementales pendant le développement. Le principal avantage de cette technique, c’est que les plaques micro-fluidiques multicanaux permettent l’acquisition rapide de résultats statistiquement significatifs. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la structure du biofilm, elle peut également être appliquée à l’étude des traitements antibiotiques et à la biorémédiation.En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, parce qu’une attention particulière aux détails du protocole et des compétences méticuleuses, sont nécessaires. Pour éviter une erreur de connexion de l’instrument au logiciel, allumez d’abord le poste de travail pc, suivi du module de fluorescence. Assurez-vous que l’obturateur de fluorescence est en mouvement et allumez les contrôleurs matériels.Ensuite, allumez le contrôleur du système d’imagerie et la caméra CCD. Ensuite, allumez la station d’imagerie. Lorsque tout l’équipement est prêt, démarrez l’application de commande et entrez le numéro de plaque, situé sur l’étiquette sur le côté de la plaque.Pour l’amorçage, retirez d’abord la plaque micro-fluidique de 48 puits de l’emballage, sans toucher la surface vitrée au fond de la plaque, et nettoyez la glissière de verre au fond de la plaque, à l’aide d’un tissu de lentille. Pour amorcer les canaux micro-fluidiques, pipette 200 microlitres de 37 degrés Celsius milieu minimal dans le puits de sortie, en prenant soin d’éviter les bulles. Ensuite, placez la plaque sur la scène de la plaque.Essuyez l’interface avec l’éthanol, en l’scellant sur le stade de la plaque une fois que l’éthanol a séché. En mode manuel sur le module de commande, réglez le fluide comme bouillon Luria-Bertani à 37 degrés Celsius, et max sheer comme cinq dym par centimètre carré. Cliquez sur les puits de sortie pour activer le flux de la sortie vers le puits d’entrée, pour amorce les canaux.Après cinq minutes, mettre en pause l’écoulement pour se préparer à l’ensemencement et retirer soigneusement la plaque de la scène. Ensuite, aspirez tout milieu résiduel de la sortie bien sans enlever aucun milieu du cercle intérieur qui conduit aux canaux micro-fluidiques. Pour ensemencer les canaux expérimentaux, ajouter 300 microlitres de milieu minimal dans le puits d’entrée, suivi de l’ajout de 300 microlitres de culture bactérienne, dans le puits de sortie.Retournez la plaque à l’étape de l’imagerie en vous assurant d’essuyer l’interface avec de l’éthanol avant de la placer sur la plaque, et utilisez le flux de la caméra en direct pour vous concentrer sur un seul canal. Tout en surveillant visuellement l’alimentation en direct, reprendre le flux à 1 à 2 dym par centimètre carré pendant environ 2 à 4 secondes, Pour permettre aux cellules d’entrer dans le canal expérimental, mais pas les canaux serpentins, et laisser la plaque sur le stade de température contrôlée pendant une heure, pour permettre aux cellules de s’attacher. À la fin de la période d’attachement, retirez soigneusement la plaque du stade et aspirez bien les bactéries de la sortie sans perturber le canal.Ensuite, utilisez une nouvelle pointe pipette pour retirer le milieu des puits d’entrée. Dans le logiciel, ouvrez l’acquisition dimensionnelle multiple pour contrôler l’acquisition d’image de microscope, et sélectionnez le laps de temps, les positions multiples d’étape, et les longueurs d’onde multiples. Dans l’onglet enregistrement, créez un nom de base simple, en vous assurant que le nom de base des empiétements s’il existe un fichier est vérifié.Inclure tous les détails essentiels de l’expérience dans la description. Cliquez sur sélectionnez répertoire, pour sélectionner le dossier dans lequel tous les fichiers seront enregistrés Sous l’onglet time lapse, ajuster la durée du temps expérimental, à 24 heures, et définir l’intervalle de temps pour acquérir des images toutes les cinq minutes tout au long de l’expérience. Utilisez le flux de caméra en direct et l’objectif 10x pour définir les positions de scène, en se concentrant sur le centre du canal, situé au-dessus ou en dessous des numéros de canal gravés sur la plaque.Passez à l’objectif 20x et localisez la zone de visualisation optimale et le plan focal à l’intérieur du chenal. Ensuite, ajoutez la position de la scène à la liste avec les nouveaux paramètres. Sous le menu longueurs d’onde, réglez le nombre de longueurs d’onde à 3, et réglez la première longueur d’onde à fitc 100% caméra, avec un temps d’exposition de dix millisecondes, la deuxième longueur d’onde à brightfield 50% caméra 50% visible, avec un temps d’exposition minimal de 3 millisecondes et la troisième longueur d’onde à tous fermés, de sorte qu’aucune lumière reste sur le dernier canal entre les temps d’acquisition.Dans le menu Modifier AutoRun, ouvrez l’onglet configuration du protocole et définissez un nouveau protocole d’une durée de 24 heures avec le flux défini dans la direction avant au taux de cisaillement expérimental approprié. Cliquez sur ajouter et enregistrer pour enregistrer le protocole et ouvrir l’onglet configuration de séquence. Pour configurer une nouvelle séquence, sélectionnez le bouillon Luria-Bertani à 37 degrés, comme fluide par défaut pour tous les canaux.Sous l’étape itération 1 pour les canaux 1 à 12, sélectionnez le protocole avec le premier taux de cisaillement expérimental et activer tous les canaux. Pour les canaux 13 à 24, sélectionnez le protocole avec le deuxième taux de cisaillement expérimental et activez tous les canaux. Sélectionnez Ensuite Appliquer et enregistrer as, pour enregistrer la séquence et ouvrir le menu AutoRun pour sélectionner la séquence enregistrée à utiliser pour l’AutoRun.Pour mettre en place l’expérience de biofilm à croissance infimes, ajouter jusqu’à 1300 microlitres de milieu minimal stérile dans le puits d’entrée de la plaque micro-fluidique, et remettre la plaque au stade d’imagerie. Ensuite, essuyez l’interface avec de l’éthanol et scellez la plaque. Confirmez que les protocoles et les séquences sont correctement mis en place.Sélectionnez démarrer, pour démarrer l’AutoRun, et cliquez immédiatement sur acquérir pour démarrer la collection d’images microscope. À la fin de la première acquisition d’image, cliquez sur pause et sélectionnez le mode image en direct dans la longueur d’onde brightfield. Sélectionnez aller pour afficher chaque position de scène, et sélectionnez défini à jour, pour définir les nouveaux paramètres.Ensuite, cliquez sur reprendre, avant de commencer la prochaine acquisition prévue. Dans cette expérience représentative de croissance du biofilm à temps, la couverture du biofilm, ou zone de surface seuil en pourcentage, était différente pour les trois paramètres de cisaillement, ce qui indique que le cisaillement a eu une influence directe sur la couverture de surface du biofilm. La mesure relative totale de l’accumulation de biofilms a augmenté en fonction du temps, le taux de croissance étant passé du stress de cisaillement le plus élevé au stress de cisaillement le plus bas.Sous chaque condition, il y avait aussi une période claire de croissance exponentielle à partir de laquelle un taux de croissance quantitatif pouvait être calculé. Dans l’ensemble, le coefficient de rugosité a diminué au fil du temps dans toutes les conditions de cisaillement, ce qui indique que toutes les surfaces du biofilm sont devenues plus lisses. Cependant, par rapport au cisaillement le plus bas, les réglages de cisaillement plus élevés ont donné lieu à une surface plus lisse au fil du temps, ce qui indique qu’un flux de cisaillement plus rapide contribue à une surface plus lisse et plus propre.En outre, l’entropie texturale, ou le caractère aléatoire dans la morphologie, a augmenté au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre la séquence spécifiée et de prendre le temps d’effectuer chaque étape avec précision. Les compétences nécessaires peuvent prendre quelques courses à maîtriser.Après cette procédure, d’autres méthodes telles que HBLC ou GCMS, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les concentrations de sous-straights, tels que le glucose, consommés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des biofilms pour explorer les environnements de flux généraux en temps réel avec des conditions expérimentales contrôlées et l’échantillonnage par hydrothérapie. N’oubliez pas que travailler avec des souches bactériennes BSL2 peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d’équipement de protection approprié et l’utilisation de protocoles de déchets appropriés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

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Recherche

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