Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

עבודה זו התאפשרה על ידי מענקים מן המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5P20GM103427), רכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)

המחברים אין לחשוף.

Microfluidic מערכת ותמונה ניתוח הפרוצדורה שנדונו כאן מתמקדת על הוצאתו להורג של microfluidic biofilm ניסויים כדי לקבוע מאפיינים מורפולוגיים שאינם מצריכים תלת מימדי מלא במידע שנמצא בדרך כלל מקונפוקלי מחקרים מיקרוסקופ. אלה כללו כיסוי תשתית microcolony (אחוז הכיסוי), חספוס פני השטח נמדד לפי מקדם החספוס וכן אנטרופיה רקמתי. שיטה להערכת biofilm יחסית הכולל תא הצטברות מוצג גם מאילו שיעורי צמיחה ביומן יכול להיות מחושב שלב.
ישנם מספר שלבים קטנים אך משמעותיים אמורים להיות מודגשים בשיטה זו. מנגב את הממשק עם אלכוהול מסייעת למנוע זיהום של חיידקים אחרים להיכנס ניסוי כדי ניסוי אבל גם מן טוב עד טוב. ניסוי אחד. הטרמה זריעה הינם גם מאוד חשוב משום לקרקע מאפשרת למשתמש לקבוע אילו ערוצים המאפשר התקשורת לזרום דרך הערוצים ללא כל הפרעות או סתימת. ערוצי צריך גם לא להיות מוטרד (כלומר הם צריכים להיות כל הזמן מלא מדיה) לאחר הטרמה כדי להגדיל את הסיכוי של ניסוי יירוט מוצלח עם אין בועות אוויר או סתימת. הצעד זריעה יכולים להיות מגוונים לפי הסוג של חיידקים, אז צריך להיות אופטימיזציה עבור התא מצורף. לדוגמה, אם תאים שאינם נראים לצרף, שינויים משטח יכול להתרחש על הצלחת microfluidic לפני זריעה או יותר פעמים incubations עשוי להיות נחוץ. חשוב גם לוודא כי המיקרוסקופ מוגדר כראוי כדי לקבל תמונה בפוקוס, צריכים להיות במעקב תקופתי לאורך כל הניסוי כדי להבטיח איכות תמונות מתקבלים. אם המוקד אינו פועל, המיקרוסקופ ניתן, צריך להיות מותאם ממשיך הניסוי. בזמן רכישת התמונה, הגל האחרונה צריכה להיות מוגדרת ל סגור כל כדי למנוע את החשיפה של תאורה לערוץ אחד בלבד בזמן ההמתנה המתרחשת בין הרכישות תמונה ומסננים. כמו כן, ניתוח התמונה קובע את כיסוי משטחים % תוכנן בבית כי המדריך תוכנה מונטאז במפורש לא מתארים את ההליך. יתר על כן, על מנת להרחיב על ניתוח תמונה, לקבוע מאפיינים אחרים כגון חספוס פני השטח, וכו '., פתח מקור קוד מבוסס פיתון45 פותחה בבית ומשותפים על המאגר gitHub. ישנן גם מגבלות על כמה נתונים יכול להיות שמורים ומנוהלים על הכונן הקשיח המקומי, כך כונן קשיח חיצוני או שיתוף מידע באינטרנט יש צורך כגון CyVerse46.
ריאקטורים קונבנציונליים, כגון המגיב ה-CDC ו את הטפטוף זרימה הכור34, דורשים הרבה מדיה, מספקים פחות גודל מדגם, דורשים כמות גבוהה של סטריליזציה של ציוד. לעומת זאת, היתרונות של הפלטפורמה תפוקה גבוהה יותר כוללות את היכולת שליטה הטיה, המחירים זרימה, ומזכירים ההנחה כי חוץ גופית בתוך ניסויים מקרוב ויוו תנאים. החסרונות של המערכת כוללים את האביזרים מרובים, התוכנה דורשת התקנה קפדני שנועד זה חייב להתבצע בסדר הנכון של אירועים. יתר על כן, במדריך המסופק לציוד לא מלא להסביר כל שלב של הניסויים, והן את הפקודות תוכנה, כתוצאה מכך, הרבה טעויות מתרחשות במהלך הניסויים, לרבות סתימת של ערוצים, חוסר גדילה או כקובץ מצורף. או חוסר תמונות מיקרוסקופ באיכות גבוהה או סרטים. המכשיר עצמו חומרים מתכלים, כגון הצלחות microfluidic, גם יקרים יחסית עם תג מחיר של יותר מ-200 דולר לכל צלחת והם אינם לשימוש חוזר. לפיכך, ואילו הטכניקה מקנה תוצאות רבות עוצמה, מומחיות טכנית הדרושים לשימוש שלה גבוה יחסית ודורש תרגול חוזר ונשנה על-ידי מומחים בתחום. דו ח זה מנסה לפתור בעיה זו על-ידי מתן מדריך למשתמשים חדשים של אלה ריאקטורים המחקר biofilms מאפיינים.
מערכת microfluidic, אשר מסוגל לבצע ניתוח הסלולר, צברה תשומת לב רבה על שיטות מדעיות שונות, כגון, מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, המטולוגיה, אונקולוגיה, מחקר תאי הגזע. ליתר דיוק, הטכנולוגיה הביא בפרסומים רבים המתארים נושאים הרלוונטיים במיוחד ביישומים רפואיים37,47, לרבות מיקרוביאלי אדהזיה אוראלי48, הקובע את ההשפעות של biosurfactants- Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus49,50, לארח הפתוגן אינטראקציות של e. coli51, סטרפטוקוקוס הדבקות52, וטיפול סיסטיק פיברוזיס53. לאור העובדה כי מערכת זו microfluidic היא מאוד תכליתי, הוא צפוי כי יותר ויותר מערכות יופץ ברחבי העולם.
כמה צעדים פרוטוקול ספציפי יש לשקול בזהירות. המדיה יכולה להיות מדולל על 50% עם dH2O כדי למנוע בועות ואת סתימת אך לא היה נדרש במקרה זה. הערך של יתר600 משמש זריעה להיקבע באמצעות האקסאלסיור של ניסוי גידול כדי לראות מה עובד הכי טוב עבור ערכת מסוים התנאים בהם נעשה שימוש. בועות הבארות לפני איטום יכול להוביל בועות בערוצים microfluidic ויש להסירם הכתיב צצו או נשאב החוצה עם טיפ פיפטה. חשוב לשמור על חיידקים מתוך הערוצים סרפנטין קטן. על ידי בעל נפחים שווים של התקשורת לקלט ולפלט במהלך תהליך זריעה, זרימה בלחץ נפח נוזלי נשלטות ולכן הזרימה היא רק בשל הלחץ יישומית מן המערכת. המרחקים כיול צריכה להגדיר במהלך ההתקנה על ידי נציג החברה. הגדרות אלה הם ספציפיים לכל מצלמה.
ישנם מספר אתגרים המתרחשות בעת מציאת סף קנאס לתמונה. הגדרת ערכי הסף המרבי יכול להיות קשה אם עוצמת הפיקסלים הממוצע על פני אזורים של הרקע אינן עקביות נגרם על-ידי בחירת מיקום הבמה שאינו במרכז של הערוץ או מפני פסולת על הצלחת. תחת תקן מ מ, לחץ על התהליך, ולאחר מכן בחר רקע ותיקון הצללת כלי תיקון עבור אלה של חוסר עקביות. עם זאת, כלי זה הוא בדרך כלל רק מועיל אם המשתמש לוקח תמונות של הערוצים לפני זריעה שהם יכולים להשתמש בו כתמונות הפניה. או, אם רקע/הצללה הפניה תמונות אינן זמינות, המשתמש יהיה צורך להשתמש הדין שלהם כדי לקבוע את ערך הסף משתרע ביותר תא שטח ללא רקע עבור התמונה כולה כולל. לחלופין, בחר נציג אזורי למדוד השוללים מחוזות עקביות על-ידי לחץ על האזור המלבני, אזור אליפסהאו מעקב אזור בחר אזור ולבחור אזור פעיל ולא כולו תמונה על החלון הצג סטטיסטיקה אזור (תחת כלי ניתוח). אם האזור מייצג הוא מנוצל עבור קביעת סף תמונת שדה בהיר, יש להשתמש באותו האזור למדידה של תמונת FITC המתאימים. זה עוזר להקליט את מרחבי סטטיסטיקות ספציפיות (שמאל למעלה, רוחב, גובה, אזור, ההיקף) המשויכות באותו אזור נציג כך יימצא באותו האזור, נמדד על התמונה המתאימה FITC.
כדי למנוע הצטברות של נתונים בכונן הקשיח שיגרמו למחשב להאט, ניתן לרכוש כונן קשיח חיצוני לאחסון נתונים. אפשרות נוספת עבור אחסון נתונים ושיתוף נתונים והקלה על היא פלטפורמת ביואינפורמטיקה CyVerse. ליצור חשבון על מערכת CyVerse על ידי הולך http://www.cyverse.org/. ברגע שנכנסת, להפעיל את הסביבה גילוי ולאחר מכן בחר "יומן ב CyVerse". בחר "נתונים" ונווטו את התיקיה. אם הערימה תמונה במחשב המקומי ולאחר מכן בחר "להעלות" ואז "פשוט להעלות משולחן העבודה". למצוא את הקובץ מחסנית התמונה ובחר להעלאה. ניתן לשתף את הקובץ או התיקיה עם משתפי פעולה. אם יש חשבון CyVerse, מקבלים הרשאה. שיתוף התיקיה data לקהל הרחב מחייב את המטה-נתונים יתווספו עבור כל קובץ באמצעות CyVerse אושרו תקנים. הליך זה לא יידונו כאן כי זה לא בתוך הטווח של עבודה זו.

כאן, אנו נדגים שיטה כדי למדוד את ההשפעה של גזירה על היווצרות של פלורסנט biofilms Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ) PA01 באמצעות מערכת אוטומטית microfluidic תפוקה גבוהה יותר.
Biofilms הן קהילות של מיקרואורגניזמים, כגון חיידקים, מאורגן על ידי חומר הפולימרים חוץ-תאית מחוברים תמיכה, ולא נמצאים בדרך כלל הממשק בין נוזל או מוצק פני שטח1. קהילות אלה biofilm יכול להיות מועיל לסביבה, כגון שיפור איכות המים קווי אספקת מים, למצבה של הסרבן תרכובות2,3. עם זאת, biofilms יכול להיות גם מאוד מזיק לבריאות האדם עם השלכות לא רצויות. לדוגמה, מכשירים רפואיים, כגון שתלים הירך והברך, הם סוג אחד של השטח שבו biofilm הצטברות כבר אתגר וגורם סיבוכים רפואיים קשים4,5. Biofilms ניתן גם להזין מערכות מים טבעיים, כגון נהרות ואגמים, לחדור אספקת המים לצינורות המובילים לזיהום חיידקים במי שתייה וכתוצאה מכך זיהומים-6,-7,-8. Biofilms שהוקמה ב סביבות ימיות לדבוק ספינות ותערובות מעשה ידי אדם אחרים ולהציג בעיה כלכלית וסביבתית גדולה כמו הגדלת החיכוך מוביל להגדלת9,צריכת דלק10. ציפויים מיקרוביאלית, כגון Tributyltin, פותחו כדי למנוע בעיות אלו אך רעיל החיים הימיים11.
Aeruginosa פ הוא חיידק גראם שליליים עם היכולות הגבוהות משגשג במגוון רחב של תנאים סביבתיים וגורמים nutrimental12. Aeruginosa פ היא גורם שכיח של הקהילה, בית החולים-רכשה זיהומים ומצא להיות הדוק משויך פציעות, כוויות חמורות, ו immunocompromised מארחים, כמו סיסטיק פיברוזיס (CF)5,12, 13, איידס, סרטן המטופלים5,13. היווצרות biofilms פ aeruginosa חובר באופן חמור ל CF, דלקות ריאות כרונית איפה הגורם המוביל של מוות על מחלה זו5.
זן הפניה של aeruginosa פ, PA01, משמש בדו ח זה, הוא מהונדסים גנטית לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (PA-EGFP) משופרת. EGFP מייצג את המוטציות צורה של GFP עם מאפיינים פלורסצנטיות גדול המאפשר בחיי עיר biofilm ניתוח באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ14,15,16. סוג זה של ניתוח פלורסצנטיות היא יתרון עבור חקר biofilms GFP לא יפגע באופן משמעותי עם צמיחת תאים, הפונקציה17. לדוגמה, תאים Escherichia coli שתויגו עם GFP גדל היטב ובאופן רצוף בלי אחרי שנים של סבל תופעות רעילות לעומת חיידקים שליטה17. דוחות אחרים לבסס טענה18,19,20. יתר על כן, השימוש של עיתונאי פלורסנט כגון EGFP הוא מהיר ופשוט, אך תאים חיים רק נמדד כי תאים מתים מהר לחדול לזרוח21.
Biofilms יכול לגדול בתנאים סביבתיים שונים, כולל אלה בעלי זרימה שונים המחירים. לדוגמה, סרטים יכול לגדול בגזירה גבוהה, כגון בנהרות, שם התנאים זרימת מים גבוהה להוביל מיקרוביאלי גיוון גדול22. לעומת זאת, מים עומדים בריכות או אוראלי biofilms ניסיון של הרבה התחתון הטיה כוח23. בנוסף קצב הזרימה, ישנם גורמים אחרים המשפיעים biofilm אדהזיה, חספוס פני שטח כולל hydrophobicity, הרכב מדיה, ו אפילו בקטריאלי תא השטח1,4,7, 24. תנאים יכול לגרום גם וריאציה המרחבי או המורפולוגיה של ממבנה biofilm. זה כולל תנאים סביבתיים כגון גזירה שהופעל על ידי נוזל נע או מעברי צבע זמינות חומרי הזנה, גורמים ביולוגיים כגון המינים המצויים המערכת תנועתיות של תאים, החלבונים ספציפית נוכח חוץ-תאית 26,25,חומר הפולימרים27. בתנאים מסוימים, biofilm יהיה כמו הדשא זמן (חלקה ולא שטוח), בתנאים אחרים biofilm להיות מחוספס, רכות, או אפילו כמו פטריות28. בעוד ההבדל איכותי בין מדשאות biofilm ומבנים פטריות ניתן לראות בבירור בתמונות מיקרוסקופיים, הבנת הקשר בין קולנוע מבנה ותהליכים ביולוגיים בתוך הסרט דורש שיטתית, תפוקה שיטות לתאר את המורפולוגיה. מאפיינים מורפולוגיים למחקר שהציעו החוקרים כוללים נקבוביות, ממד פרקטל, אורך diffusional, אזור microcolony תשתית האחסון microcolony, מקדם החספוס, אנטרופיה רקמתי29,30 .
אינקובטורים-מטלטל סיבובי משמשים במחקר של biofilms לחקות תנאי החיים האמיתיים31. טפטוף זרימה כורים (DFR) מייצגים סביבה נמוך-הטיה איפה מזינים בתקשורת לזרום באיטיות על פני תאים מצרף על פני השטח לאורך זמן כדי ליצור ממבנה biofilm עם צפיפות תאים גבוהה32. ה-CDC כורים הם ריאקטורים יוצר סביבה נוזלים גבוהה גזירה על ידי שליטה על מוט מלהיב זה מסתובב ללא הרף בתוך התקשורת מלא טנק33. סוגים אלה של ריאקטורים פשוט להגדיר, אך הם מוגבלים בהיקף בגלל גודל המדגם נמוכה יחסית, צריכה גבוהה של מדיה, כמויות גדולות של פסולת ותברואה המופק מדיה טפטוף זורם החל µL 125/דקה טפטוף זרימה כורים יותר מ 1 מ"ל/מינימום עבור CDC כורים, והצורך אוטוקלב כמויות גדולות של המדיה של כלי זכוכית, פסולת-34. Biofilms לא גדלים באופן שווה על פני השטח ב כור זרימה טפטוף כי ההטיה נמוכה של התקשורת גורם נגרר לאורך את התאגידים גדול יותר של חיידקים aeruginosa פ ולכן, הגידול biofilm אינה חלקה מאוד, הדגימות לא אחידה לא יכול להיות ניתחו בקלות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ35,36 .
כמה מגבלות ביוריאקטור נפוצים הם להתגבר באמצעות ביוריאקטור תפוקה בינונית microfluidic, שבו רק מיליליטר של מדיה נדרשים, הלוחות התגובה הם קטנים, ברצון חד פעמית לאחר autoclaving37. יתר על כן, תלוי במספר בארות, שכפולי רבים ניתן לבצע ב כור אחד ברח, אשר מספק כמות מספקת של נתונים כדי לבצע ניתוח סטטיסטי משמעותי. איור 1, הרכיבים השונים של המערכת microfluidic-מיקרוסקופ זה לאפשר תנאים מבוקרים, לרבות חום וזרימה שיעור38,39,40, מוצגים. ביוריאקטור זה משולב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי להמחיש את זריחה של התג EGFP ב PA01 תחת להחיל נמוך באמצעות גזירה גבוהה בתנאים המחקים תרחישים מציאותיים יותר אתה נתקל בסביבה או בתחום הביו-רפואי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> איור 1 : רכיבים בודדים של מערכת Microfluidic. רכיבים בודדים מופיעים משמאל לימין: 1. מצלמת CCD, 2. גבוהה ברזולוציה הפוכה מיקרוסקופ עם שלב אוטומטי, אוטומטי מודול פלורסצנטיות פוקוס אוטומטי מודול, 3. צלחת הבמה, 4: מערכת ממשק, 5 הדמיה: שלב מיקרוסקופ ידני : שליטה, 6 מלכודת קיטור, 7: מערכת בקר (כולל בקר טמפרטורה), 8 הדמיה: חומרת בקרי, 9: זריחה בקר, 10: תצורתו, 11: כונן קשיח חיצוני לאחסון תמונות, 12: תחנת PC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
קטע של צלחת microfluidic מוצג באיור2. הלוחות הנפוצים מורכבות 48 בארות. ניסוי אחד מחייב כניסה אחת, שקע אחד בארות, סך של 2 בארות. דבר זה מאפשר 24 סימולטני ניסויים שניתן לבצע עם תנאים ניסויים שונים, כגון זני חיידקים, טיפולים מיקרוביאלית ומדיה מגוונת ערוץ ערוץ ומבוקר הטיה הזרימה עבור כל אחת מהעמודות של שישה ערוצים. הטמפרטורה ניסיוני נשלטת גם עם הגדרה אחת טמפרטורה ברחבי הבסיס. הערוצים microfluidic מראים כי לכל ערוץ יש אזור סרפנטין לספק מספיק לחץ אחורי, הטיה מבוקרת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> איור 2: ויזואליזציה של ערוצי microfluidic, חלון צפייה. שתי בארות כניסת ולשקע עם הערוצים microfluidic חיבורם מודגשים עם צבעי אדום וירוק. לצבוע גורם גלויים אזור סרפנטין בכל אחד מהערוצים אשר יוצרת לחץ אחורי מספיקות ו הטיה מבוקר במהלך זרימת נוזלים. כל ערוץ צפייה (בתוך המעגל האדום) יכול לדימות עם אורכי הגל הרצוי. מוצגות שדה בהיר (למעלה), פלורסנט (למטה) מיקרוסקופיה תמונות של ערוץ אחד עם ממבנה biofilm PA01-EGFP באמצעות מטרה X 20. סרגל קנה מידה = 80 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מדריך צעד אחר צעד מסופק כדי לאפשר למשתמשים של ריאקטורים microfluidic אשר נמצאים ביחד עם קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי לערוך ניסויים biofilm הרומן באמצעות סביבות שונות הטיה. שיטה זו יאפשר ההרחבה של ניסויים מעורבים מיקרואורגניזמים אחרים מלבד חיידקים, כגון פטריות, אצות, בעלי יישומים רפואיים וסביבתיים -41,-42,-43. הגישה מפורט מתאר כיצד תרבות PA01-EGFP, לחסן צלחת 48-ובכן, להגדיר את microfluidic המכשיר והתוכנה, להגדיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להדגים את ניתוח תוכנה כדי לקבל את הכיסוי biofilm, שיעור הצמיחה, ו מאפיינים מורפולוגיים כגון חספוס פני השטח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

תפוקה גבוהה יותר microfluidic במבחנה מגיב ביולוגי בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ שימש ללמוד biofilm חיידקי הצמיחה, מורפולוגיה, כולל Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ). כאן, אנו נתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת כדי ללמוד את קינטיקה גידול והמאפיינים מורפולוגי כגון חספוס פני השטח, רקמתי האנטרופיה של זן aeruginosa פ PA01 המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק (PA01-EGFP משופרת ). פרוטוקול מפורט יתאר כיצד לגדל זרע תרבויות PA01-EGFP, כיצד להגדיר למעלה את המיקרוסקופ (autorun), לנהל את ניתוח התמונה כדי לקבוע שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגית באמצעות מגוון של כוחות גזירה נשלטים על ידי microfluidic התקן. מאמר זה מספק תיאור מפורט של טכניקה כדי לשפר את המחקר של biofilms PA01-EGFP אשר בסופו של דבר יכול להיות מיושם לכיוון זנים אחרים של חיידקים, פטריות או אצות biofilms באמצעות פלטפורמת microfluidic.

איור 4 מדגים את האזור thresholded אחוז לאורך זמן של ה 24 להפעיל זרימות הטיה של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2. Biofilm כיסוי או אחוזים סף שטח (C [%]) היה שונה עבור כל הטיה שלוש ההגדרות. הכיסוי biofilm היה המהיר ליד הטיה2 דיין 1.0/cm, היכן האזור הסף עלה מ 2-5% ל- 100% לאחר מינימום 200 הצמיחה הגיע שלב נייח לאחר 400 דקות. -דיין 0.5/cm2, כיסוי biofilm עוכב והחל להגדיל ב- 400 דקות להגיע 100% כיסוי לאחר מינימום 800. ההטיה הנמוך-דיין 0.2/cm2 הראו בבירור העלייה האיטית ביותר בסיקור biofilm, שבו אחוז כיסוי החלו להגדיל ב- 500 דקה אך לא הגיעה מעבר לאזור הסף 65%. התוצאות הצביעו על הטיה הייתה השפעה ישירה על כיסוי משטחים biofilm. ההטיה גבוהים נראה להיות מצב אופטימלי יותר לצמיחה biofilm, אולי בשל העובדה כי התקשורת סיפק החיידק עם חומרים מזינים יותר כך biofilm יכול להתרבות מהר יותר.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> איור 4: פינת סף אחוז, הצטברות biofilm הכולל, מקדם החספוס, אנטרופיה רקמתי. הסף a) אחוז שטח (C [%]) לאורך זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות בתקופה. נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. b) סה כהצטברות biofilm (מדד יחסי) כפונקציה של זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות בתקופה. הקווים השחורים הם ריבועים מתאים למודל מעריכי. נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. ג) מקדם החספוס של PA01-EGFP באמצעות גזירה ערכים של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 פיקוח מעל 24 ח' נתונים הושג מערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה. d) אנטרופיה רקמתי של PA01-EGFP באמצעות גזירה ערכים של 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2. הנתונים היה המתקבלים ערוץ אחד עבור כל תנאי הטיה (Valquier-פלין, ה, Sutlief, א. ל, וונטוורת, מועדון, 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
איור 4 b היא בקנה אחד עם הממצאים המוצגים באיור 4. הצטברות biofilm (N[rel]) נמדדה מבוסס על ההנחה כי האות GFP בכל נקודה בתמונה הוא יחסי לצפיפות תא חי באותו מיקום. הוא מדגים כי סך מדידה יחסית biofilm הצטברות גדל כפונקציה של זמן באמצעות 0.2 0.5, דיין 1.0/cm2 מעל 24 שעות ביממה תקופת זמן, קצב הצמיחה ירדה מגזירה הגבוהה ביותר ל גזירה הנמוך. יש פרק זמן ברור נותן הגידול האקספוננציאלי שממנו ניתן לחשב קצב גדילה כמותית.
איור 4 ג מדגים את מקדם החספוס (R)-הטיה תזרימי של 0.2 0.5, דיין 1.0/ס מ2. חספוס פני השטח, לכמת על ידי מקדם החספוס, מודד את השונות בפרופיל עובי של הסרט. ההגדרה הפורמלית היא
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
Tאני איפה שאני-th עובי המדידה, T הוא עובי ממוצע ו- N הוא המספר של מדידת עובי30. ההליך המתואר בחקירה הזו מודדת את עובי המשויך תאים חיים. סידור שטוח של תאים תניב מקדם החספוס של אפס ואילו וריאציות משמעותיות של עובי מן הממוצע תניב מקדם החספוס גדול מאחד. בדומה השפעת הטיה על הצמיחה ועל סף אחוז הכיסוי של הסרט, biofilms הציג topographies שונים לאורך זמן. בסך הכל, R ירד לאורך זמן עבור כל התנאים הטיה המציין כי כל המשטחים הפך חלקה יותר. עם זאת, בהשוואה הטיה הנמוך של דיין 0.2/cm, ההגדרות הטיה גבוהה יותר של 0.5 ו דיין 1.0/cm2 הביא משטח חלקה לאורך זמן המציינת כי זרם הטיה מהיר תרמו השטח אפילו יותר וחלק יותר, ו את ההטיה הגבוהה ביותר של דיין 1.0/cm2 להגיע מתחת 0.2 R.
החלקות, סדירות, או גסות של משטח יכול להתבטא גם ב רקמתי אנטרופיה (TE). טה הינו נכס המשמש בניתוח התמונה כדי למדוד את מידת האקראיות תמונה דו-ממדית. בחישוב מבוסס על המטריצה אפור מופע משותף ברמה, שהוגדרו על-ידי הארליק et al., אשר בוחן אם ערכי פיקסלים במיקום אחד נמצאים בקורלציה עם ערכי פיקסלים-מיקום אחר44. רמה גבוהה של המתאם יוביל אנטרופיה נמוכה. איור 4 d מתארת TE-הטיה תזרימי של 0.2 0.5, דיין 1.0/ס מ2. TE מוגברת לאורך זמן עבור כל התנאים הטיה אבל את הגבוה ביותר מאמץ גזירה על דיין 1.0/ס הגיע המרבי TE (1.0) מוקדם יותר הלחצים הטיה נמוך ב- 900 דקה. ההטיה הנמוך של דיין 0.2/cm2 היה TE הנמוך (0.8) להגיע המקסימאלית שלה לאחר 1,000 דקות. עם זאת, גזירה ביניים של דיין 0.5/cm2 להגיע שלה טה המרבי (1.2) הרבה יותר מאוחר מאשר התנאים גזירה גבוה או נמוך.
מקדם החספוס של טה למדוד תכונות שונות. בעוד סרט שטוח מקדם החספוס נמוכה בעלת אנטרופיה נמוכה, סרט עם וריאציה משמעותי עובי מקדם החספוס גבוהה אבל עדיין יכול להיות אנטרופיה נמוכה אם וריאציית הוא sinusoidal ולא אקראי. במקרה זה, R ירד עם גזירה מוגברת זמן בזמן המגמות טה לא יכול להיות קשור ישירות להטיית מתח שהוחל ביופילמים לאורך זמן.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> איור S1 : תמונה לכידה של windows תוכנת שליטה. להיפתח חלון התוכנה עם תפריט רב מימדי רכישה (למעלה). מודול בקרת סט ההפעלה האוטומטית (למטה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> איור S2 תמונה לכידה של התוכנה עבור סקירת נתונים. חלון היישום לאחר בחירת ערכת הנתונים עניין באמצעות הכלי סקירה רב מימדי נתונים ' מתפריט ' כלי ניתוח . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

כאן, אנו מתארים את השימוש תפוקה גבוהה יותר microfluidic מגיב ביולוגי בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח של גזירה השפעות על biofilms Pseudomonas aeruginosa המבטאים חלבונים ניאון ירוק, כולל כלי להגדיר, הקביעה של כיסוי biofilm, שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגי.

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, על פיתוח ביופילם, כגון כיצד לזהות תנאים סביבתיים מרכזיים, המשפיעים על צמיחת ביופילם ומאפיינים התנהגותיים במהלך הפיתוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהצלחות הרב-ערוציות והמיקרו-נוזליות מאפשרות רכישה מהירה של תוצאות מובהקות סטטיסטית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מבנה biofilm, זה יכול להיות מיושם גם על המחקר של טיפולים אנטיביוטיים, bioremediation.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי תשומת לב זהירה לפרטי הפרוטוקול ומיומנויות קפדניות, יש צורך. כדי למנוע שגיאה של החיבור של המכשיר לתוכנה, הפעל תחילה את תחנת העבודה של המחשב ולאחר מכן את מודול הפלואורסצנטיות. ודא שתריס הפלואורסצנטיות דליל והפעיל את בקרי החומרה.לאחר מכן, הפעל את בקר מערכת ההדמיה ואת מצלמת CCD. ואז להפעיל את תחנת ההדמיה. כאשר כל הציוד מוכן, הפעל את יישום הבקרה והזן את מספר הלוחית, הממוקם על התווית בצד הצלחת.עבור priming, תחילה להסיר את צלחת מיקרו נוזלי 48 היטב מן האריזה, מבלי לגעת משטח הזכוכית בתחתית הצלחת, ולנקות את החלקת הזכוכית בתחתית הצלחת, עם רקמת עדשה. כדי להפוך את הערוצים מיקרו נוזלים, פיפטה 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס מדיום מינימלי לתוך התפוקה היטב, דואג להימנע בועות. ואז למקם את הצלחת על הבמה צלחת.לנגב את הממשק עם אתנול, איטום אותו על שלב הצלחת לאחר האתנול התייבש. במצב ידני במודול הבקרה, הגדר את הנוזל כמרק לוריא-ברטאני ב-37 מעלות צלזיוס, ומקסימום 5 דיאם לס"מ מרובע. לחץ על בארות הפלט כדי להפעיל את הזרימה מהפלט ל הבאר הקלט, כדי להפוך את הערוצים לראש.לאחר חמש דקות, להשהות את הזרימה כדי להתכונן לזריעה, בזהירות להסיר את הצלחת מהבמה. לאחר מכן, שאפו כל מדיום שיורית מהפלט היטב מבלי להסיר כל מדיום מהמעגל הפנימי שמוביל לערוצי המיקרו-נוזלים. כדי לזרוע את הערוצים הניסיוניים, להוסיף 300 microliters של מדיום מינימלי לתוך באר הקלט, ואחריו תוספת של 300 microliters של תרבות חיידקית, לתוך הפלט היטב.מחזירים את הלוח לשלב ההדמיה ומוודאים לנגב את הממשק עם אתנול לפני הנחתו על הצלחת, ולהשתמש בהזנת המצלמה החיה כדי להתמקד בערוץ אחד. תוך ניטור חזותי של ההזנה החיה, לחדש את הזרימה ב 1 עד 2 דיאם לסנטימטר מרובע במשך כ 2 עד 4 שניות, כדי לאפשר לתאים להיכנס לערוץ הניסוי אך לא ערוצי הנרפנטין, ולהשאיר את הלוח על הבמה מבוקרת הטמפרטורה במשך שעה אחת, כדי לאפשר לתאים לצרף. בסוף תקופת ההחזקה, להסיר בזהירות את הצלחת מהשלב ול שאפו את החיידקים מן הפלט היטב מבלי להפריע לערוץ.לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להסיר את המדיום מ בארות הקלט. בתוכנה, פתח רכישה מרובת ממדים כדי לשלוט ברכישת תמונת המיקרוסקופ, ובחר לשגות זמן, עמדות שלב מרובות אורכי גל מרובים. בכרטיסיה 'שמירה', צור שם בסיס פשוט, וודא ששמות הבסיס של ההטבעות אם הקובץ קיים, נבדקים.כלול את כל הפרטים החיוניים של הניסוי בתיאור. לחץ על בחר ספריה, כדי לבחור את התיקיה שבה כל הקבצים יישמרו תחת לשונית הזמן לשגות, להתאים את משך הזמן הניסיוני, ל 24 שעות, ולהגדיר את מרווח הזמן כדי להשיג תמונות כל חמש דקות לאורך הניסוי. השתמש בהזנה של המצלמה החיה ובמטרה 10x כדי להגדיר את עמדות הבמה, תוך התמקדות במרכז הערוץ, הממוקם מעל או מתחת למספרי הערוץ החרוטים על הלוח.עבור למטרה 20x, ואתר את אזור הצפייה האופטימלי ואת מישור המוקד בתוך הערוץ. לאחר מכן, הוסף את מיקום הבמה לרשימה עם ההגדרות החדשות. תחת תפריט אורכי הגל, הגדר את מספר אורכי הגל ל- 3, והגדר את אורך הגל הראשון ל- FITC 100%camera, עם זמן חשיפה של עשר אלפיות השניה, אורך הגל השני לבהירפילד 50% מצלמה 50%גלוי, עם זמן חשיפה מינימלי של 3 אלפיות שנייה ואורך הגל השלישי לכל סגור, כך שלא נשאר אור בערוץ האחרון בין זמני הרכישה.בתפריט עריכת הפעלה אוטומטית, פתח את הכרטיסיה הגדרת פרוטוקול והגדר פרוטוקול חדש עם משך זמן של 24 שעות כאשר הזרימה מוגדרת בכיוון קדימה בקצב ההיפוי הניסיוני המתאים. לחץ על הוספה ושמור בשם כדי לשמור את הפרוטוקול ולפתוח את הכרטיסיה הגדרת רצף. כדי להגדיר רצף חדש, בחר מרק לוריא-ברטאני ב- 37 מעלות, כנוזל ברירת המחדל עבור כל הערוצים.תחת איטרציה שלב 1 עבור ערוצים 1 עד 12, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההמהר הניסיוני הראשון ולהפוך את כל הערוצים לזמינים. עבור ערוצים 13 עד 24, בחר את הפרוטוקול עם קצב ההיסוף הניסיוני השני והפוך את כל הערוצים לזמינים. לאחר מכן בחרו 'החל' ו'שמור בשם', כדי לשמור את הרצף ולפתוח את התפריט 'הפעלה אוטומטית' כדי לבחור את הרצף שנשמר שישמש להפעלה האוטומטית.כדי להקים את ניסוי הביופילם של הצמיחה בזמן, הוסיפו עד 1300 מיקרוליטרים של מדיום מינימלי סטרילי לתוך באר הקלט של הלוח המיקרו-נוזלי, והחזירו את הלוח לשלב ההדמיה. לאחר מכן, לנגב את הממשק עם אתנול, ולאטום את הצלחת. ודא שהפרוטוקולים והרצפים מוגדרים כראוי.בחר התחל, כדי להפעיל את 'הפעלה אוטומטית' ולחץ מיד על 'רכוש' כדי להפעיל את אוסף התמונות של המיקרוסקופ. בסיום רכישת התמונה הראשונה, לחץ על השהה ובחר את מצב התמונה החיה באורך הגל של שדה בהיר. בחר עבור אל כדי להציג כל מיקום שלב ובחר מוגדר כיום, כדי להגדיר את ההגדרות החדשות.לאחר מכן, לחץ על חדש פעולה, לפני שתתחיל את הרכישה המתוזמנת הבאה. בניסוי גידול ביופילם מתוזמן זה, כיסוי הביופילם, או שטח הפנים של סף האחוזים, היה שונה עבור כל שלוש הגדרות ההטעיה, מה שמצביע על כך שלגבה הייתה השפעה ישירה על כיסוי פני השטח של הביופילם. המדידה היחסית הכוללת של הצטברות הביופילם, עלתה כפונקציה של זמן, כאשר קצב הגדילה ירד מלחץ ההמהר הגבוה ביותר ללחץ ההמהר הנמוך ביותר.בכל תנאי הייתה גם תקופה ברורה של צמיחה אקספוננציאלית שממנה ניתן היה לחשב קצב גידול כמותי. בסך הכל, מקדם החספוס ירד עם הזמן בכל תנאי ההטיה, מה שמצביע על כך שכל משטחי הביופילם נעשו חלקים יותר. עם זאת, בהשוואה לגימה הנמוכה ביותר, הגדרות הגזירה הגבוהות יותר גרמו למשטח חלק יותר לאורך זמן, מה שמצביע על כך שזרימת הגזירה מהירה יותר תורמת למשטח חלק יותר ושווה יותר.יתר על כן, האנטרופיה הטקסטואלית, או האקראיות במורפולוגיה, גדלה עם הזמן עבור כל תנאי ההטיה. בעת ביצוע הליך זה חשוב לזכור לעקוב אחר הרצף שצוין ולקחת את הזמן כדי לבצע כל שלב במדויק. הכישורים הדרושים יכולים לקחת כמה ריצות כדי לשלוט.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כגון HBLC או GCMS, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ריכוזי substraights, כגון גלוקוז, להיות נצרך. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופילמים לחקור סביבות זרימה כלליות בזמן אמת עם תנאי ניסוי מבוקרים ודגימה הידרותרפית. אל תשכח, כי עבודה עם זנים חיידקיים BSL2 יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן תקין ושימוש בפרוטוקולי פסולת מתאימים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...