Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
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यह काम नेशनल इंस्टिट्यूट फॉर जनरल मेडिकल साइंस (NIGMS) (5P20GM103427), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) के एक घटक से अनुदान द्वारा संभव बनाया गया था

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

इन विट्रो में एक उच्च प्रवाह microfluidic प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित Pseudomonas aeruginosa (पी. aeruginosa) सहित बैक्टीरियल फिल्म विकास और आकृति विज्ञान, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहां, हम वर्णन कैसे प्रणाली को विकास कैनेटीक्स और रूपात्मक गुण जैसे सतह असभ्यता और पी aeruginosa तनाव PA01 कि एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (PA01-EGFP एक्सप्रेस के textural एन्ट्रापी के रूप में अध्ययन किया जा सकता है ). एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे विकसित करने के लिए और बीज PA01-EGFP संस्कृतियों, कैसे माइक्रोस्कोप और स्वतः चलाएं स्थापित करने के लिए, और छवि विश्लेषण आचरण विकास दर और रूपात्मक कतरनी बलों है कि द्वारा नियंत्रित कर रहे है की एक किस्म का उपयोग कर गुण निर्धारित करने के लिए microfluidic डिवाइस । यह लेख एक तकनीक का विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए PA01-EGFP के अध्ययन में सुधार होगा जो अंततः बैक्टीरिया, कवक, या शैवाल microfluidic मंच का उपयोग कर फिल्म के अंय उपभेदों की ओर लागू किया जा सकता है ।

चित्र 4 एक 24 एच ०.२, ०.५, और १.० डाइन/मुख्यमंत्री2के कतरनी प्रवाह पर चलाने से समय के साथ एक प्रतिशत सीमा क्षेत्र दर्शाता है । सभी तीन कतरनी सेटिंग्स के लिए फिल्म कवरेज या प्रतिशत सीमा सतह क्षेत्र (सी [%]) अलग था । इस फिल्म कवरेज १.० डाइन/cm2 कतरनी पर सबसे तेज था, जहां दहलीज क्षेत्र 2-5% से १००% वृद्धि के २०० मिनट के बाद वृद्धि हुई है और ४०० मिनट के बाद एक स्थिर चरण तक पहुंच गया । ०.५ डाइन/cm2में, फिल्म कवरेज में देरी हुई और ८०० मिनट के बाद १००% कवरेज तक पहुंचने में ४०० मिनट की वृद्धि हुई । ०.२ डाइन/cm2 में सबसे कम कतरनी स्पष्ट रूप से फिल्म कवरेज, जहां प्रतिशत कवरेज के लिए ५०० मिनट में वृद्धि हुई है लेकिन ६५% सीमा क्षेत्र से परे नहीं पहुंच शुरू में धीमी वृद्धि का प्रदर्शन किया । इन परिणामों के संकेत कतरनी फिल्म सतह कवरेज में एक सीधा प्रभाव था । उच्च कतरनी के लिए एक अधिक इष्टतम शर्त लग रहा था, संभवतः इस तथ्य यह है कि मीडिया अधिक पोषक तत्वों के साथ बैक्टीरिया प्रदान की है कि इतनी अधिक है कि फिल्म तेज पैदा करना कर सकते है के कारण ।
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> चित्रा 4: प्रतिशत सीमा क्षेत्र, कुल फिल्म संचय, किसी न किसी गुणांक, और textural एन्ट्रापी. a) प्रतिशत थ्रेशोल्ड क्षेत्र (C [%]) का उपयोग कर समय पर ०.२, ०.५, और १.० डाइन/cm2 पर एक 24 ज समय अवधि । डेटा प्रत्येक कतरनी शर्त के लिए एक चैनल से प्राप्त किया गया था । ख) कुल फिल्म संचय (सापेक्ष उपाय) का उपयोग कर समय के एक समारोह के रूप में ०.२, ०.५, और १.० डाइन / काली रेखाएं एक घातांक मॉडल में फ़िट होती हैं । डेटा प्रत्येक कतरनी शर्त के लिए एक चैनल से प्राप्त किया गया था । ग) PA01 के गुणांक-EGFP की कतरनी तनाव मूल्यों का उपयोग कर ०.२, ०.५, और १.० डाइन/सेमी2 पर नजर रखी 24 एच डेटा प्रत्येक कतरनी हालत के लिए एक चैनल से प्राप्त किया गया था । घ) Textural एन्ट्रापी के PA01-EGFP का उपयोग कतरनी तनाव मूल्यों के ०.२, ०.५, और १.० डाइन / डेटा प्रत्येक कतरनी शर्त (Valquier-फ्लिन, एच., Sutlief, अल, वेंटवर्थ, C.D., २०१८) के लिए एक चैनल से प्राप्त किया गया था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
चित्र 4 b चित्रा 4एमें दर्शाए गए निष्कर्षों के अनुरूप है । इस फिल्म संचय (एन[रिलायंस एनर्जी]) इस धारणा के आधार पर मापा गया था कि एक छवि में एक बिंदु पर GFP संकेत है कि स्थिति में रहते सेल घनत्व के लिए आनुपातिक है । यह दर्शाता है कि कुल सापेक्ष माप फिल्म संचय ०.२, ०.५ का उपयोग कर समय के एक समारोह के रूप में वृद्धि हुई है, और १.० डाइन/cm2 एक 24 घंटे की अवधि में, और वृद्धि दर उच्चतम कतरनी तनाव से सबसे कम कतरनी तनाव से मना कर दिया । वहां एक स्पष्ट समय घातीय वृद्धि है जिसमें से एक मात्रात्मक वृद्धि दर की गणना कर सकते है दे अवधि है ।
चित्र 4 सी ०.२, ०.५ के कतरनी प्रवाह में किसी न किसी गुणांक (आरए) दर्शाता है, और १.० डाइन/ सतह किसी न किसी गुणांक द्वारा quantified, फिल्म की मोटाई प्रोफ़ाइल में विचरण के उपाय । औपचारिक परिभाषा यह है
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
जहां ti -th मोटाई माप, ta औसत मोटाई है, और N मोटाई माप30की संख्या है । इस जांच में वर्णित प्रक्रिया के रहने वाले कोशिकाओं के साथ जुड़े मोटाई उपाय । कोशिकाओं की एक सपाट व्यवस्था शूंय का एक मोटा गुणांक निकलेगा, जबकि औसत से मोटाई की महत्वपूर्ण बदलाव होगा एक किसी न किसी गुणांक से अधिक एक से अधिक सहसंबंध निकलेगा । विकास दर और फिल्म की प्रतिशत सीमा कवरेज पर कतरनी प्रभाव के समान, समय के साथ विभिंन स्थलाकृति प्रदर्शित फिल्म । कुल मिलाकर, आरए सभी कतरनी यह दर्शाता है कि सभी सतहों चिकनी हो गई स्थितियों के लिए समय के साथ कम हुई । हालांकि, ०.२ डाइन/सेमी की सबसे कम कतरनी की तुलना में, उच्च कतरनी सेटिंग्स के ०.५ और १.० डाइन/सेमी2 समय के साथ एक चिकनी सतह का संकेत है कि एक तेज कतरनी प्रवाह चिकनी और अधिक भी सतह के लिए योगदान दिया है, और उच्चतम कतरनी के परिणामस्वरूप १.० डाइन/सेमी2 नीचे पहुंचकर ०.२ Ra.
चिकनाई, नियमितता, या किसी सतह की बेअदबी को भी textural एन्ट्रापी (TE) में व्यक्त किया जा सकता है । TE एक दो आयामी छवि में यादृच्छिकता की डिग्री को मापने के लिए छवि विश्लेषण में इस्तेमाल किया संपत्ति है । इसकी गणना Haralick एट अल., द्वारा परिभाषित ग्रे स्तर सह घटना मैट्रिक्स पर आधारित है, जो कि एक स्थान पर पिक्सेल मूल्यों४४अन्य स्थान पर पिक्सेल मूल्यों के साथ संबंधित हैं कि क्या लगता है. सहसंबंध के एक उच्च डिग्री कम एन्ट्रापी करने के लिए नेतृत्व करेंगे । चित्र 4 d ०.२, ०.५, और १.० डाइन/मुख्यमंत्री2के कतरनी प्रवाह पर ते को चित्रित करती है । ते सभी कतरनी की स्थिति के लिए समय के साथ वृद्धि हुई, लेकिन १.० डाइन/सेमी पर सबसे अधिक कतरनी तनाव ९०० मिनट में कम कतरनी तनाव से पहले अधिकतम ते (१.०) तक पहुंच गया । ०.२ डाइन/सेमी2 की सबसे कम कतरन १,००० मिनट के बाद अपनी अधिकतम तक पहुंचने (०.८) सबसे कम थी । हालांकि, ०.५ डाइन/cm2 के मध्यवर्ती कतरनी तनाव उच्च या कम कतरनी तनाव की स्थिति से अधिक बाद में अपने अधिकतम ते (१.२) तक पहुंच गया ।
किसी न किसी गुणांक और ते विभिंन सुविधाओं को मापने । जबकि एक फ्लैट फिल्म एक कम मोटा गुणांक और कम एन्ट्रापी, मोटाई में महत्वपूर्ण भिंनता के साथ एक फिल्म है एक उच्च किसी न किसी गुणांक होगा, लेकिन अभी भी कम एन्ट्रापी हो सकता है अगर भिंनता sinusoidal बजाय यादृच्छिक है । इस मामले में, आरएक वृद्धि की कतरनी तनाव और समय के साथ कमी आई जबकि ते प्रवृत्तियों सीधे कतरनी तनाव से संबंधित नहीं किया जा सकता है समय पर फिल्म निर्माण के लिए लागू होता है ।
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> चित्र s : नियंत्रण सॉफ्टवेयर खिड़कियों की छवि कैद । बहु आयामी अधिग्रहण मेनू ओपन (ऊपर) के साथ सॉफ्टवेयर खिड़की । नियंत्रण मॉड्यूल एक स्वतः चलाएं (नीचे) के लिए सेट करें । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> चित्र S2 आंकड़ों की समीक्षा के लिए सॉफ्टवेयर की छवि पर कब्जा । विश्लेषण उपकरण मेनू से बहु आयामी डेटा की समीक्षा करें उपकरण का उपयोग कर ब्याज का डेटा सेट का चयन करने के बाद अनुप्रयोग विंडो. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

यहां, हम एक उच्च प्रवाह microfluidic Pseudomonas aeruginosa पर कतरनी तनाव प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित प्रतिक्रिया के प्रयोग का वर्णन है, उपकरण सहित ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सेट अप, फिल्म कवरेज, विकास दर, और रूपात्मक संपत्तियों का निर्धारण ।

Pseudomonas aeruginosa पर कतरनी तनाव के लाइव सेल विश्लेषण एक स्वचालित उच्च प्रवाह Microfluidic प्रणाली का उपयोग

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

यह विधि बायोफिल्म विकास के बारे में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि प्रमुख पर्यावरणीय स्थितियों की पहचान कैसे करें, जो विकास के दौरान बायोफिल्म विकास और व्यवहार विशेषताओं को प्रभावित करते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि बहु-मोड़ा, माइक्रो-फ्लूइड प्लेटें, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणामों के त्वरित अधिग्रहण के लिए अनुमति देती हैं। हालांकि यह विधि बायोफिल्म संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे एंटीबायोटिक उपचार और बायोरेमेडिएशन के अध्ययन पर भी लागू किया जा सकता है।आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे, क्योंकि प्रोटोकॉल और सावधानीपूर्वक कौशल के विवरण पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। सॉफ्टवेयर के लिए उपकरण के कनेक्शन की त्रुटि से बचने के लिए, पीसी वर्क स्टेशन को पहले चालू करें, इसके बाद फ्लोरेसेंस मॉड्यूल। सुनिश्चित करें कि फ्लोरेसेंस शटर चालू है, और हार्डवेयर नियंत्रकों को चालू करें।इसके बाद इमेजिंग सिस्टम कंट्रोलर और सीसीडी कैमरे को चालू करें। इसके बाद इमेजिंग स्टेशन चालू करें। जब सभी उपकरण तैयार हो जाएं, तो नियंत्रण आवेदन शुरू करें, और प्लेट नंबर दर्ज करें, जो प्लेट के किनारे पर लेबल पर स्थित है।भड़काना के लिए, पहले पैकेजिंग से 48 अच्छी तरह से माइक्रो-फ्लूइड प्लेट को हटा दें, प्लेट के नीचे कांच की सतह को छूने के बिना, और प्लेट के नीचे ग्लास स्लाइड को साफ करें, लेंस ऊतक के साथ। माइक्रो-फ्लूइड चैनलों को प्राइम करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस के पिपेट 200 माइक्रोलीटर उत्पादन में न्यूनतम माध्यम को अच्छी तरह से जोड़ते हैं, बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखते हैं। फिर प्लेट को प्लेट स्टेज पर रखें।इथेनॉल के साथ इंटरफ़ेस को मिटा दें, इथेनॉल सूख जाने के बाद इसे प्लेट स्टेज पर सील करें। नियंत्रण मॉड्यूल पर मैनुअल मोड में, तरल पदार्थ को लुरिया-बर्टानी शोरबा के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और अधिकतम सरासर पांच डाइम प्रति वर्ग सेंटीमीटर के रूप में। आउटपुट कुओं पर क्लिक करें ताकि आउटपुट से इनपुट तक प्रवाह को अच्छी तरह से सक्रिय किया जा सके, चैनलों को प्राइम करें।पांच मिनट के बाद, सीडिंग के लिए तैयार करने के लिए प्रवाह को रोकें, और ध्यान से मंच से प्लेट को हटा दें। फिर, इनर सर्कल से किसी भी माध्यम को हटाए बिना आउटपुट से किसी भी अवशिष्ट माध्यम को अच्छी तरह से आकांक्षी करें जो माइक्रो-फ्लूइड चैनलों की ओर जाता है। प्रायोगिक चैनलों को बीज देने के लिए, इनपुट में न्यूनतम माध्यम के 300 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें, इसके बाद आउटपुट में बैक्टीरियल कल्चर के 300 माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से जोड़ा गया।प्लेट को प्लेट पर रखने से पहले इथेनॉल के साथ इंटरफ़ेस को पोंछना सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग चरण पर वापस करें, और एक चैनल पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लाइव कैमरा फ़ीड का उपयोग करें। नेत्रहीन लाइव फ़ीड की निगरानी करते हुए, लगभग 2 से 4 सेकंड के लिए 1 से 2 डाइम प्रति वर्ग सेंटीमीटर पर प्रवाह फिर से शुरू करें, कोशिकाओं को प्रायोगिक चैनल में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए, लेकिन टेढ़ा चैनल नहीं, और प्लेट को एक घंटे के लिए तापमान नियंत्रित चरण पर छोड़ दें, ताकि कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति दी जा सके। अनुलग्नक अवधि के अंत में, ध्यान से मंच से प्लेट को हटा दें और चैनल को परेशान किए बिना बैक्टीरिया को अच्छी तरह से आउटपुट से हटा दें।फिर, इनपुट कुओं से माध्यम को हटाने के लिए एक नए पिपेट टिप का उपयोग करें। सॉफ्टवेयर में, माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण को नियंत्रित करने के लिए कई आयामी अधिग्रहण खोलें, और समय चूक, कई चरण पदों और कई तरंगदैर्ध्य का चयन करें। सेविंग टैब में, एक साधारण आधार नाम बनाएं, यह सुनिश्चित करें कि यदि फ़ाइल मौजूद है तो इनक्रोमेंट्स बेस नाम की जांच की जाती है।विवरण में प्रयोग के किसी भी आवश्यक विवरण को शामिल करें। चयन निर्देशिका पर क्लिक करें, फ़ोल्डर का चयन करने के लिए जिसमें सभी फ़ाइलों को समय चूक टैब के तहत सहेजा जाएगा, प्रायोगिक समय की अवधि को 24 घंटे तक समायोजित करें, और पूरे प्रयोग में हर पांच मिनट में छवियों को प्राप्त करने के लिए समय अंतराल निर्धारित करें। लाइव कैमरा फ़ीड और 10x उद्देश्य का उपयोग करें मंच पदों को सेट करने के लिए, चैनल के केंद्र पर ध्यान केंद्रित, ऊपर या नीचे स्थित चैनल संख्या थाली पर उत्कीर्ण ।20x उद्देश्य पर स्विच करें, और चैनल के भीतर इष्टतम देखने के क्षेत्र और फोकल प्लेन का पता लगाएं। फिर, नई सेटिंग्स के साथ सूची में चरण की स्थिति जोड़ें। तरंगदैर्ध्य मेनू के तहत, तरंगदैर्ध्य की संख्या को 3 सेट करें, और फिटसी 100% कैमरे के लिए पहली तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें, दस मिलीसेकंड एक्सपोजर समय के साथ, ब्राइटफील्ड 50% कैमरा 50% दृश्यमान के लिए दूसरी तरंगदैर्ध्य, 3 मिलीसेकंड के न्यूनतम जोखिम समय और सभी बंद करने के लिए तीसरी तरंगदैर्ध्य के साथ, इसलिए अधिग्रहण के बीच अंतिम चैनल पर कोई प्रकाश नहीं रहता है।संपादित ऑटोरन मेनू में, प्रोटोकॉल सेटअप टैब खोलें और उचित प्रयोगात्मक कतरनी दर पर आगे की दिशा में सेट प्रवाह के साथ 24 घंटे की अवधि के साथ एक नया प्रोटोकॉल सेट करें। प्रोटोकॉल को बचाने और सीक्वेंस सेटअप टैब खोलने के लिए ऐड और सेव पर क्लिक करें। एक नया अनुक्रम स्थापित करने के लिए, लुरिया-बर्टानी शोरबा को 37 डिग्री पर चुनें, सभी चैनलों के लिए डिफ़ॉल्ट तरल पदार्थ के रूप में।चैनलों के लिए चरण पुनरावृत्ति 1 के तहत 1 से 12, पहले प्रयोगात्मक कतरनी दर के साथ प्रोटोकॉल का चयन करें और सभी चैनलों को सक्षम करें। चैनलों के लिए 13 से 24 के माध्यम से, दूसरे प्रयोगात्मक कतरनी दर के साथ प्रोटोकॉल का चयन करें और सभी चैनलों को सक्षम करें । फिर अनुक्रम को बचाने के लिए आवेदन और सहेजें, और ऑटोरन के लिए उपयोग किए जाने वाले सहेजे गए अनुक्रम का चयन करने के लिए ऑटोरन मेनू खोलें।समय पर विकास बायोफिल्म प्रयोग स्थापित करने के लिए, माइक्रो-फ्लूइड प्लेट के इनपुट वेल में बाँझ न्यूनतम माध्यम के 1300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को इमेजिंग चरण में वापस करें। फिर, इथेनॉल के साथ इंटरफ़ेस को मिटा दें, और प्लेट को सील करें। पुष्टि करें कि प्रोटोकॉल और दृश्य सही ढंग से स्थापित किए गए हैं।स्टार्ट का चयन करें, ऑटोरन शुरू करने के लिए, और तुरंत माइक्रोस्कोप छवि संग्रह शुरू करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें। पहली छवि अधिग्रहण के अंत में, रुकने पर क्लिक करें और ब्राइटफील्ड तरंगदैर्ध्य में लाइव इमेज मोड का चयन करें। प्रत्येक चरण की स्थिति को देखने के लिए जाएं, और नई सेटिंग्स सेट करने के लिए सेट को वर्तमान में चुनें।फिर, अगले अनुसूचित अधिग्रहण शुरू करने से पहले, फिर से शुरू पर क्लिक करें । इस प्रतिनिधि समय पर बायोफिल्म विकास प्रयोग में, बायोफिल्म कवरेज, या प्रतिशत दहलीज सतह क्षेत्र, सभी तीन कतरनी सेटिंग्स के लिए अलग था, यह दर्शाता है कि कतरनी बायोफिल्म सतह कवरेज पर सीधा प्रभाव पड़ा । बायोफिल्म संचय के कुल सापेक्ष माप, समय के एक समारोह के रूप में वृद्धि हुई है, विकास दर सबसे अधिक कतरनी तनाव से सबसे कम कतरनी तनाव में गिरावट के साथ ।प्रत्येक शर्त के तहत, घातीय वृद्धि की एक स्पष्ट अवधि भी थी जिसमें से मात्रात्मक विकास दर की गणना की जा सकती थी । कुल मिलाकर, खुरदरापन गुणांक सभी कतरनी स्थितियों के तहत समय के साथ कम हो गया, यह दर्शाता है कि बायोफिल्म सतहों के सभी चिकनी हो गया । हालांकि, सबसे कम कतरनी की तुलना में, उच्च कतरनी सेटिंग्स समय के साथ एक चिकनी सतह में हुई, यह दर्शाता है कि एक तेजी से कतरनी प्रवाह एक चिकनी और अधिक भी सतह के लिए योगदान देता है ।इसके अलावा, पाठ्य एंट्रोपी, या आकृति विज्ञान में यादृच्छिकता, कतरनी स्थितियों के सभी के लिए समय के साथ वृद्धि हुई। इस प्रक्रिया को करते समय निर्दिष्ट अनुक्रम का पालन करना और प्रत्येक चरण को ठीक से करने के लिए समय लेना याद रखना महत्वपूर्ण है। जरूरत कौशल मास्टर करने के लिए कुछ रन ले सकते हैं ।इस प्रक्रिया के बाद, एचबीएलसी या जीसीएमएस जैसे अन्य तरीकों को ग्लूकोज जैसे उप-चिकित्सा की सांद्रता के बारे में अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने बायोफिल्म्स के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए नियंत्रित प्रायोगिक स्थितियों और स्वीमिंग नमूने के साथ वास्तविक समय में सामान्य प्रवाह वातावरण का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया। मत भूलना, कि BSL2 जीवाणु उपभेदों के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय उचित सुरक्षा उपकरण पहनने और उचित अपशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करने जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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