Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Questo lavoro è stato reso possibile dalle sovvenzioni dell'Istituto nazionale per General Medical Science (NIGMS) (5P20GM103427), un componente del National Institutes of Health (NIH)

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura di analisi di immagine e sistema microfluidico discusso qui si concentra sull'esecuzione di microfluidica biofilm esperimenti per determinare le proprietà morfologiche che non richiedono le informazioni completo tridimensionale in genere trovate da confocale studi del microscopio. Questi hanno incluso microcolony copertura di substrato (percentuale di copertura), rugosità di superficie misurata dal coefficiente di scabrezza e tessiturale entropia. Un metodo per la stima totale biofilm relativa accumulazione delle cellule inoltre è presentato da che i tassi di crescita nel registro fase può essere calcolato.
Ci sono diversi passi piccoli ma significativi che dovrebbero essere evidenziate in questo metodo. Pulendo l'interfaccia con l'alcol aiuta a evitare la contaminazione di altri batteri in andando da esperimento a esperimento ma anche da un pozzetto a altro in un esperimento. Semina e priming sono anche molto importanti perché innesco permette all'utente di determinare quali canali sono consentendo il supporto di fluire attraverso i canali senza disturbi o intasamento. Canali non dovrebbero anche essere disturbato (cioè dovrebbero essere costantemente pieno di media) dopo priming per aumentare le probabilità di un esperimento riuscito senza bolle d'aria o di intasamento. Il passo di semina può essere variato secondo il tipo di batteri e quindi dovrebbe essere ottimizzato per collegamento delle cellule. Ad esempio, se le cellule non sembrano collegare, superficie modifiche potrebbero essere necessario verificarsi sulla piastra microfluidica prima della semina o tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari. È anche fondamentale per assicurarsi che il microscopio è correttamente impostato per ottenere un'immagine messa a fuoco e dovrebbe essere controllato periodicamente in tutto l'esperimento per assicurare che si ottengono immagini di qualità. Se il fuoco è spento, il microscopio può e deve essere regolato come l'esperimento continua. Durante il tempo di acquisizione di immagini, l'ultima lunghezza d'onda deve essere impostata Chiuso tutti al fine di evitare l'esposizione dei filtri e illuminazione a un solo canale durante il tempo di attesa che si verifica tra le acquisizioni di immagine. Inoltre, l'analisi di immagine che determina la % di copertura superficiale è stato progettato in casa perché il manuale del software di montaggio non descrivere in modo esplicito la procedura. Inoltre, al fine di ampliare l'analisi di immagine e determinare altre caratteristiche quali rugosità superficiale, ecc., open source codice basato su Python45 è stato sviluppato in casa e condiviso il repository su gitHub. Esistono anche alcune limitazioni su quanti dati possono essere archiviati e gestiti sul disco rigido locale, quindi è necessario un disco rigido esterno o condivisione dati online come CyVerse46.
Bioreattori convenzionali, come il reattore di CDC e il gocciolamento flusso reattore34, richiedono molto media, forniscono meno dimensioni del campione e richiedono una quantità elevata di sterilizzazione delle attrezzature. Al contrario, i vantaggi di questa piattaforma di velocità effettiva superiore includono la possibilità di controllo taglio, velocità di flusso, e il presupposto che in vitro gli esperimenti molto attentamente assomigliare condizioni in vivo . Svantaggi del sistema includono i molteplici accessori e software che richiedono una meticolosa di installazione che dovrà essere eseguite nell'ordine corretto di eventi. Inoltre, il manuale che viene fornito per le attrezzature non completamente spiegare ogni passaggio di esperimenti e i comandi del software e, di conseguenza, molti errori si verificano durante gli esperimenti, tra cui ostruzione dei canali, mancanza di crescita o allegato, o la mancanza di alta qualità microscopia immagini o filmati. Lo strumento stesso e materiali di consumo, quali le piastre di microfluidica, inoltre sono relativamente costosi con un prezzo di oltre $200 per piastra e non sono riutilizzabili. Così, mentre la tecnica conferisce risultati potente, la competenza tecnica necessaria per il suo utilizzo è relativamente alta e richiede ripetuti formazione di esperti nel campo. Questa relazione tenta di risolvere questo problema, fornendo una guida per nuovi utenti di questi bioreattori per studiare le caratteristiche di biofilm.
Il sistema di microfluidica, che è in grado di eseguire analisi cellulare, ha guadagnato l'attenzione considerevole per le varie modalità scientifica, come ad esempio in microbiologia, immunologia, ematologia, oncologia e la ricerca sulle cellule staminali. Più specificamente, la tecnologia ha portato a numerose pubblicazioni Descrizione degli argomenti che sono altamente rilevanti per le applicazioni mediche37,47comprese microbica orale adesione48, determinazione degli effetti delle biotensioattivi su Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus49,50, ospitano interazioni patogeno in51di Escherichia coli, streptococco di aderenza52e trattamento di fibrosi cistica53. Dato il fatto che questo sistema di microfluidica è molto versatile, si prevede che più sistemi saranno distribuiti in tutto il mondo.
Alcuni passaggi del protocollo specifico dovrebbero essere considerate con attenzione. Media può essere diluito al 50% con dH2O per aiutare a prevenire bolle e intasamento ma non è stato richiesto in questo caso. Il valore specifico di OD600 utilizzato per la semina deve essere determinato con prove di un esperimento di crescita per vedere cosa funziona meglio per il particolare insieme di condizioni utilizzate. Bolle in pozzi prima del sigillamento possono portare a bolle nei canali microfluidici e dovrebbero essere rimosso da spuntato o succhiato fuori con un puntale. È importante mantenere i batteri fuori le piccole scanalature del serpentine. Avendo volumi uguali di media in ingresso e in uscita durante il processo di seeding, flusso dovuto pressione dal volume di liquido sarà controllato quindi flusso è solo a causa della pressione applicata dal sistema. Le distanze di taratura devono essere impostare durante l'installazione dal rappresentante della società. Queste impostazioni sono specifiche per ogni telecamera.
Ci sono diverse sfide che si verificano quando trovare la soglia più rappresentativa per un'immagine. Impostazione dei valori di soglia massima può essere difficile se l'intensità medio dei pixel in tutte le regioni dello sfondo non è coerente causato selezionando una posizione di fase che non è al centro del canale o da detriti sulla piastra. Sotto lo Standard MM, fare clic sul processoe quindi selezionare sfondo e ombreggiatura correzione strumento di correzione per queste contraddizioni. Tuttavia, questo strumento è generalmente utile solo se l'utente ha scattato immagini dei canali prima della semina che possono utilizzare come immagini di riferimento. O, se ombreggiatura di sfondo/riferimento immagini non sono disponibili, l'utente avrà bisogno di usare il loro giudizio per impostare un valore di soglia che copre più area di cella senza includere lo sfondo per l'immagine intera. In alternativa, selezionare aree rappresentative per misurare che escludono le regioni di incoerenza con un click Regione rettangolare, Ellisse areao Regione traccia per selezionare una regione e selezionare Regione attiva piuttosto che intero Immagine sulla finestra Visualizza le statistiche di regione (in Strumenti di analisi). Se una rappresentanza regione è utilizzata per soglia l'immagine di campo luminoso, la stessa regione deve essere utilizzata per la misura dell'immagine corrispondente FITC. È utile registrare le statistiche spaziali specifiche (sinistra, alto, larghezza, altezza, Area, perimetro) associate a quella regione rappresentante così si troverà la stessa regione e misurato sull'immagine corrispondente FITC.
Per evitare un accumulo di dati sul disco rigido che causa il computer a rallentare, un disco rigido esterno può essere acquistato per archiviazione dei dati. Un'altra opzione per l'archiviazione e semplificando la condivisione dei dati è la piattaforma di bioinformatica di CyVerse. Creare un account sul sistema CyVerse andando a http://www.cyverse.org/. Una volta loggato, avviare l'ambiente di Discovery, quindi selezionare "Log in CyVerse". Selezionare "dati" e passare al sei la cartella. Se lo stack di immagine è sul computer locale quindi selezionare "Upload" e poi "Caricamento semplice dal Desktop". Individuare il file di immagine dello stack e selezionare per l'upload. Il file o una cartella possa essere condivisi con collaboratori se hanno un account CyVerse e viene concessa l'autorizzazione. Condivisione della cartella dati al pubblico richiede che i metadati aggiunti per ogni file utilizzando CyVerse gli standard approvati. Questa procedura non sarà discusso qui perché questo non è nell'ambito di questo lavoro.

Qui, dimostriamo un metodo per misurare l'effetto dello shear stress sulla formazione di fluorescente biofilm PA01 Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa) utilizzando un sistema automatizzato microfluidici throughput più elevato.
I biofilm sono comunità di microrganismi, quali batteri, organizzati da una sostanza polimerica extracellulare che sono fissati ad un supporto e sono in genere presenti all'interfaccia tra un liquido e un solido superficie1. Queste comunità di biofilm possono essere vantaggiosa per l'ambiente, come migliorare la qualità dell'acqua in linee di approvvigionamento idrico e nel biorisanamento di recalcitranti i composti2,3. Tuttavia, i biofilm possono anche essere altamente nocivi per la salute umana con conseguenze indesiderabili. Ad esempio, dispositivi medici, quali protesi di anca e ginocchio, sono un tipo di superficie dove accumulo di biofilm è stata una sfida e provoca gravi complicazioni mediche4,5. Biofilm possono anche entrare in sistemi naturali di acqua, come fiumi e laghi e infiltrarsi acqua tubazioni che conducono alla contaminazione di batteri nell'acqua potabile conseguente infezioni6,7,8. Biofilm formato negli ambienti marini aderire alle navi e altri substrati artificiali e presentare un grave problema economico e ambientale come maggiore attrito porta ad aumento carburante consumo9,10. Rivestimenti antimicrobici, quali tributilstagno, sono stati sviluppati per evitare questi problemi ma sono tossici per la vita marina11.
P. aeruginosa è un batterio gram-negativo con elevate capacità prospera in una varietà di condizioni ambientali e nutrimental12. P. aeruginosa è una causa comune delle infezioni comunità - e ospedale-acquistata e trovato per essere strettamente associati a lesioni, quali gravi ustioni e ospiti immunocompromessi, come nella fibrosi cistica (CF)5,12, 13, AIDS e cancro pazienti5,13. La formazione di biofilm di p. aeruginosa è stata collegata più seriamente al CF, dove le infezioni polmonari croniche sono la principale causa di morte per questa malattia5.
Un ceppo di riferimento di p. aeruginosa, PA01, viene utilizzato in questa relazione e geneticamente modificato per esprimere una proteina fluorescente verde avanzata (PA-EGFP). EGFP rappresenta una forma mutante di GFP con maggiore proprietà di fluorescenza che permette in situ biofilm analisi con microscopia di fluorescenza14,15,16. Questo tipo di analisi di fluorescenza è vantaggioso per lo studio dei biofilm perché GFP non interferisce significativamente con la crescita delle cellule e funzione17. Ad esempio, le cellule di Escherichia coli che sono stata contrassegnate con GFP è cresciuta bene e continuamente senza aver subito effetti tossici rispetto il controllo batteri17. Altri rapporti di motivare questa affermazione18,19,20. Inoltre, l'uso di un reporter fluorescente quali EGFP è semplice e veloce, ma saranno misurate cellule vive solo perché le cellule morte rapidamente cessano di essere flourescente21.
Biofilm possono crescere nelle varie condizioni ambientali, compresi quelli con diverse portate. Ad esempio, film può crescere in alto shear stress, come ad esempio nei fiumi, dove le condizioni di flusso di acqua alta portano ad una maggiore diversità microbica22. Al contrario, acqua stagnante in stagni o biofilm orali esperienza un molto inferiore al taglio forza23. Oltre alla portata, ci sono altri fattori che influenzano l'adesione di biofilm, compresa la rugosità superficiale e idrofobicità, composizione media, e anche il batterico delle cellule superficiali1,4,7, 24. condizioni possono anche causare la variazione della struttura spaziale o la morfologia di un biofilm. Questo include condizioni ambientali quali la sollecitazione di taglio esercitata da un fluido in movimento o gradienti nella disponibilità di nutrienti e fattori biologici quali le specie presentano nel sistema, motilità delle cellule e le proteine specifiche presenti in extracellulare sostanza polimerica25,26,27. In alcune condizioni, il biofilm sarà simile a Prato (liscio e piatto), mentre in altre condizioni il biofilm sarà ruvido, soffice, o anche fungo-come28. Mentre la differenza qualitativa tra prati di biofilm e strutture del fungo può essere visto chiaramente in immagini microscopiche, comprendere la relazione tra la struttura del film e processi biologici all'interno del film richiede sistematiche e quantitative metodi di descrizione della morfologia. Proprietà morfologiche suggerito per studio dai ricercatori includono porosità, dimensione frattale, lunghezza diffusionale, area microcolony presso il substrato, microcolony volume, coefficiente di scabrezza e tessiturali entropia29,30 .
Bioreattori sono utilizzati nello studio dei biofilm per imitare la vita reale condizioni31. Gocciolamento flusso reattori (DFR) rappresentano un ambiente di basso-shear dove nutrienti nei media scorrono lentamente le cellule che si collega a una superficie nel tempo per formare un biofilm con una cella ad alta densità32. Reattori di CDC vengono riempiti di bioreattori che creano un ambiente fluido di alta sollecitazione di taglio di controllo di una bacchetta che continuamente ruota all'interno della media serbatoio33. Questi tipi di bioreattori sono semplici da impostare, ma sono limitati nell'ambito a causa delle dimensioni relativamente basso del campione, l'elevato consumo dei media, grandi quantità di rifiuti a rischio biologico prodotto da media del gocciolamento flussi che vanno da 125 µ l/minuto per reattori di flusso gocciolare a più di 1 mL/min per i reattori di CDC e la necessità di grandi quantità di autoclave di vetro e rifiuti media34. Biofilm non crescono in modo uniforme su tutta la superficie in un reattore di flusso goccia perché il taglio basso dei media provoca finali lungo i più grandi conglomerati di batteri di p. aeruginosa di conseguenza, la crescita di biofilm non è molto liscia e i campioni irregolari non possono essere facilmente analizzabile con microscopia di fluorescenza35,36 .
Alcune limitazioni di bioreattore comuni sono superare utilizzando un bioreattore medio-throughput microfluidica, dove solo millilitri di media sono necessari, e le piastre di reazione sono piccole e facilmente eliminabile dopo sterilizzazione in autoclave37. Inoltre, a seconda del numero di pozzi, molte repliche possono essere eseguite in un solo reattore esegue, che fornisce una quantità sufficiente di dati per condurre analisi statistiche significative. Nella Figura 1sono mostrati i diversi componenti del sistema microfluidico-microscopia che permettono condizioni controllate, tra cui temperatura e flusso tasso38,39,40. Il bioreattore è accoppiato con microscopia di fluorescenza per visualizzare la fluorescenza del tag EGFP in PA01 sotto basso applicato attraverso condizioni di taglio alto che imitano scenari più realistici che si verificano nell'ambiente o in campo biomedico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figura 1 : Singoli componenti del sistema microfluidico. I singoli componenti sono elencati da sinistra a destra: 1. telecamera CCD, 2. ad alta risoluzione microscopio invertito con fase automatizzata, Automated modulo per fluorescenza e modulo Autofocus, 3. portapiastre, 4: Imaging system Interface, 5: fase di microscopio manuale Controllo, 6: Vapor trappola, 7: Imaging system Controller (Controller di temperatura compresi), 8: controller Hardware, 9: Controller di fluorescenza, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: External Hard Drive per la memorizzazione di immagini, 12: PC Workstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un estratto della piastra microfluidica è illustrato nella Figura 2. Le piastre più comunemente usate è costituito da 48 pozzetti. Un esperimento richiede un ingresso e un'uscita wells, un totale di 2 pozzi. Questo consente per 24 esperimenti simultanei che possono essere eseguiti con varie condizioni sperimentali, quali ceppi batterici, trattamenti antimicrobici e media varia da canale a canale e controllato il flusso di shear per ogni colonna di sei canali. La temperatura sperimentale è anche controllata con una regolazione della temperatura in tutta la piastra. I canali microfluidici mostrano che ogni canale ha una serpentina regione per fornire sufficiente pressione posteriore e taglio controllato.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figura 2: visualizzazione della finestra di visualizzazione e canali microfluidici. Due pozzi di aspirazione e mandata con i canali microfluidici che li collega sono evidenziati con coloranti rossi e verdi. La tintura rende visibile una regione serpentina in ciascun canale che crea sufficiente pressione posteriore e taglio controllato durante il flusso del fluido. Ogni canale di visualizzazione (all'interno del cerchio rosso) può essere imaged con lunghezze d'onda desiderate. Vengono mostrati campo luminoso (in alto) e fluorescente (in basso) immagini di microscopia di un singolo canale con un biofilm PA01-EGFP utilizzando un obiettivo X 20. Barra della scala = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Una guida passo per passo è fornita per consentire agli utenti di bioreattori microfluidici che sono accoppiati con microscopia di fluorescenza per condurre esperimenti di biofilm romanzo utilizzando ambienti differenti del taglio. Questo metodo consentirà l'espansione degli esperimenti che coinvolgono altri microrganismi oltre a batteri, quali funghi e alghe, che dispongono di applicazioni mediche e ambientali41,42,43. L'approccio dettagliato viene descritto come cultura PA01-EGFP, inoculare una piastra 48 pozzetti e impostare il dispositivo microfluidico e software, impostare il microscopio a fluorescenza e dimostrare l'analisi del software per ottenere la copertura del biofilm, il tasso di crescita, e proprietà morfologiche come la rugosità superficiale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Un throughput più elevato microfluidica in vitro bioreattore accoppiato con microscopia di fluorescenza è stato utilizzato per studiare la crescita di biofilm batterico e morfologia, compreso Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa). Qui, descriviamo come il sistema può essere utilizzato per studiare la cinetica di crescita e le proprietà morfologiche come la rugosità superficiale e tessiturale entropia di p. aeruginosa ceppo PA01 che esprime una proteina fluorescente verde avanzata (PA01-EGFP ). Un protocollo dettagliato descriverà come coltivare e culture PA01-EGFP del seme, come impostare il microscopio e autorun e condurre l'analisi di immagine per determinare il tasso di crescita e le proprietà morfologiche utilizzando una varietà di forze di taglio che sono controllati dalla dispositivo microfluidico. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di una tecnica per migliorare lo studio dei biofilm PA01-EGFP che alla fine può essere applicato nei confronti di altri ceppi di batteri, funghi o alghe biofilm utilizzando la piattaforma microfluidica.

Figura 4 un dimostra l'area con soglia percentuale nel tempo da un 24h eseguire a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Il biofilm copertura o per cento soglia superficie (C [%]) era diversa per tutte le impostazioni di taglio tre. La copertura di biofilm è stata più veloce a forze di taglio di 1,0 dyne/cm2 , dove la zona di soglia aumentata da 2-5% a 100% dopo 200 min di crescita ed ha raggiunto una fase stazionaria dopo 400 min. A 0,5 dyne/cm2, la copertura di biofilm era in ritardo e ha cominciato ad aumentare a 400 min raggiungendo una copertura del 100% dopo 800 min. Il taglio più basso a 0,2 dyne/cm2 ha dimostrato chiaramente l'aumento più lento in biofilm copertura, dove la percentuale di copertura ha cominciato ad aumentare a 500 min ma non raggiunse mai oltre la soglia del 65%. Questi risultati hanno indicato il taglio ha avuto un'influenza diretta in biofilm copertura della superficie. Il taglio superiore sembrava essere una condizione più ottima per la crescita di biofilm, forse dovuto al fatto che il supporto fornito i batteri con più sostanze nutritive in modo che il biofilm possono proliferare più velocemente.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figura 4: area percentuale soglia, accumulo di biofilm totale, coefficiente di scabrezza e tessiturali entropia. area di soglia) percentuale (C [%]) nel tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio. b) totale accumulo di biofilm (misura relativa) come funzione del tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo. Le linee nere sono minimi quadrati si adatta a un modello esponenziale. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio. c) rugosità coefficiente di PA01-EGFP utilizzando i valori di sollecitazione di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 monitorati oltre 24 h. dati è stata ottenuta da un canale per ogni condizione di taglio. d) tessiturale entropia di PA01-EGFP utilizzando i valori di sollecitazione di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Dati sono stati ottenuti da un canale per ogni condizione di taglio (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 4 b è coerente con i risultati mostrati in Figura 4un. L'accumulo di biofilm (N[rel]) è stato misurato basato sul presupposto che il segnale GFP in un punto in un'immagine è proporzionale alla densità di cellule vive in quella posizione. Viene illustrato che accumulo di biofilm misura relativa totale aumentato come funzione del tempo utilizzando 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2 sopra un 24h periodo di tempo, e il tasso di crescita è diminuito da sollecitazione di taglio massima alla minima sollecitazione di taglio. C'è un periodo di tempo chiaro dando una crescita esponenziale da cui può essere calcolato un tasso di crescita quantitativa.
Figura 4 c viene illustrato il coefficiente di scabrezza (Run) a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Rugosità superficiale, quantificato mediante il coefficiente di scabrezza, misura la varianza nel profilo spessore del film. La definizione formale è
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
dove Tho è l'io-th misurazione dello spessore, Tuna è lo spessore medio, e N è il numero di spessore misura30. La procedura descritta in questa indagine misura lo spessore associato con le cellule viventi. Una disposizione piana delle cellule consente di ottenere un coefficiente di rugosità pari a zero mentre significative variazioni di spessore dalla media produrrà un coefficiente di rugosità maggiore di uno. Simile all'influenza di taglio sul tasso di crescita e la copertura di soglia percentuale del film, il biofilm esposte diverse topografie nel corso del tempo. Nel complesso, Runa diminuita nel corso del tempo per tutte le condizioni di taglio, che indica che tutte le superfici è diventato più fluide. Tuttavia, in confronto il taglio minimo di 0,2 dyne/cm, le impostazioni di taglio maggiore di 0,5 e 1,0 dyne/cm2 ha provocato una superficie più liscia nel tempo che indica che un veloce flusso di shear contribuito alla superficie più liscia e più uniforme e il taglio più alto di 1,0 dyne/cm2 , raggiungendo di sotto dei 0,2 Runa.
La scorrevolezza, regolarità o grossolanità di una superficie può anche essere espressa in tessiturale entropia (TE). TE è una proprietà utilizzata nell'analisi dell'immagine per misurare il grado di casualità in un'immagine bidimensionale. Relativo calcolo si basa sulla matrice grigio livello co-occorrenza, definita da Haralick et al., che esamina se i valori dei pixel in un'unica sede siano correlati con i valori dei pixel in un'altra posizione44. Un alto grado di correlazione porterà a bassa entropia. Figura 4 d raffigura il TE a flussi di taglio di 0,2, 0,5 e 1,0 dyne/cm2. Il TE è aumentato nel corso del tempo per tutte le condizioni di taglio ma la sollecitazione di taglio massima a 1,0 dyne/cm ha raggiunto la massima TE (1.0) precedenti alle sollecitazioni di taglio inferiore a 900 min. Il taglio minimo di 0,2 dyne/cm2 aveva il TE più basso (0,8), raggiungendo il suo massimo dopo 1.000 min. Tuttavia, la sollecitazione di taglio intermedia di 0,5 dyne/cm2 raggiunto sua massima TE (1.2) molto più tardi rispetto alle condizioni di sollecitazione di taglio di alta o bassa.
Il coefficiente di scabrezza e TE misurare diverse caratteristiche. Mentre una pellicola piana avrebbe un coefficiente di rugosità bassa e bassa entropia, un film con significative variazioni di spessore avrebbe un coefficiente di rugosità elevata ma potrebbe ancora essere bassa entropia se la variazione è sinusoidale, piuttosto che casuale. In questo caso, Run diminuito con una maggiore sollecitazione di taglio e momento mentre le tendenze di TE non possono essere direttamente correlate shear stress applicato alla formazione del biofilm nel corso del tempo.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figura S1 : Acquisizione del software windows controllo immagine. Finestra di software con menu Multi dimensionale acquisizione aprire (in alto). Modulo di controllo impostato per un AutoRun (in basso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figura S2 Acquisizione del software per l'analisi dei dati immagine. Finestra dell'applicazione dopo aver selezionato il Set di dati di interesse utilizzando lo strumento di Revisione Multi dimensionale dei dati dal menu Strumenti di analisi . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Qui, descriviamo l'uso di un bioreattore di throughput più elevato microfluidici accoppiato con un microscopio a fluorescenza per l'analisi degli effetti di sollecitazione di taglio su biofilm di Pseudomonas aeruginosa che esprimono le proteine fluorescenti verde, compreso lo strumento istituito, la determinazione delle proprietà morfologiche, tasso di crescita e copertura di biofilm.

Live Cell analisi della sollecitazione di taglio su Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema di microfluidica superiore-Throughput automatizzato

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, sullo sviluppo di biofilm, come come identificare le condizioni ambientali chiave, che influenzano la crescita del biofilm e le caratteristiche comportamentali durante lo sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che le piastre microli fluidiche multicanale consentono la rapida acquisizione di risultati statisticamente significativi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura del biofilm, può anche essere applicato allo studio dei trattamenti antibiotici e alla biorimediazione.In generale, gli individui nuovi a questo metodo faranno fatica, perché è necessaria un'attenta attenzione ai dettagli del protocollo e competenze meticolose. Per evitare un errore di connessione dello strumento al software, accendere prima la stazione di lavoro del PC, seguita dal modulo di fluorescenza. Assicurarsi che l'otturatore a fluorescenza sia accendente e accendere i controller hardware.Quindi, accendere il controller del sistema di imaging e la fotocamera CCD. Quindi accendi la stazione di imaging. Quando tutta l'apparecchiatura è pronta, avviare l'applicazione di controllo e inserire il numero di targa, situato sull'etichetta sul lato della piastra.Per l'adescamento, rimuovere prima la piastra microli fluidica a 48 po po' dalla confezione, senza toccare la superficie del vetro nella parte inferiore della piastra, e pulire lo scivolo di vetro sul fondo della piastra, con un tessuto dell'obiettivo. Per innescare i canali microli fluidici, pipettare 200 microlitri di 37 gradi celsius mezzo minimo nell'uscita bene, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi posizionare la piastra sul palco della piastra.Pulire l'interfaccia con l'etanolo, sigillarlo sullo stadio della piastra una volta che l'etanolo si è asciugato. In modalità manuale sul modulo di controllo, impostare il fluido come brodo Luria-Bertani a 37 gradi celsius e max pura come cinque dym per centimetro quadrato. Fare clic sui pozzi di uscita per attivare il flusso dall'uscita al pozzo di ingresso, per innescare i canali.Dopo cinque minuti, mettere in pausa il flusso per prepararsi alla semina e rimuovere con cura la piastra dal palco. Quindi, aspirare bene qualsiasi mezzo residuo dall'uscita senza rimuovere alcun mezzo dal cerchio interno che porti ai canali microli fluidici. Per seminare i canali sperimentali, aggiungere 300 microlitri di mezzo minimo nel pozzo di ingresso, seguito dall'aggiunta di 300 microlitri di coltura batterica, nel pozzo di uscita.Riportare la piastra alla fase di imaging assicurandosi di pulire l'interfaccia con l'etanolo prima di posizionarla sulla piastra e utilizzare il feed della fotocamera dal vivo per concentrarsi su un singolo canale. Durante il monitoraggio visivo del feed live, riprendere il flusso a 1-2 dym per centimetro quadrato per circa 2-4 secondi, Per consentire alle celle di entrare nel canale sperimentale ma non nei canali serpentini, e lasciare la piastra sullo stadio a temperatura controllata per un'ora, per consentire alle celle di attaccarsi. Alla fine del periodo di attacco, rimuovere con cura la piastra dallo stadio e aspirare bene i batteri dall'uscita senza disturbare il canale.Quindi, utilizzare una nuova punta di pipetta per rimuovere il supporto dai pozzi di ingresso. Nel software, apri l'acquisizione multidimensionale per controllare l'acquisizione dell'immagine del microscopio e seleziona il time lapse, le posizioni a più fasi e le lunghezze d'onda multiple. Nella scheda salvataggio creare un nome di base semplice, assicurandosi che il nome di base, se presente, sia selezionato.Includere tutti i dettagli essenziali dell'esperimento nella descrizione. Fare clic su seleziona directory, per selezionare la cartella in cui verranno salvati tutti i file Nella scheda Time Lapse, regolare la durata del tempo sperimentale, su 24 ore, e impostare l'intervallo di tempo per acquisire immagini ogni cinque minuti durante l'esperimento. Usa l'alimentazione della fotocamera dal vivo e l'obiettivo 10x per impostare le posizioni del palco, concentrandosi sul centro del canale, situato sopra o sotto i numeri di canale incisi sulla lastra.Passa all'obiettivo 20x e individua l'area di visualizzazione e il piano focale ottimali all'interno del canale. Aggiungere quindi la posizione del palco all'elenco con le nuove impostazioni. Sotto il menu delle lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda su 3 e impostare la prima lunghezza d'onda sulla fotocamera FITC al 100%, con un tempo di esposizione di dieci millisecondi, la seconda lunghezza d'onda sul campo luminoso 50% fotocamera 50% visibile, con un tempo di esposizione minimo di 3 millisecondi e la terza lunghezza d'onda a tutti chiusi, quindi nessuna luce rimane sull'ultimo canale tra i tempi di acquisizione.Nel menu modifica esecuzione automatica aprire la scheda di configurazione del protocollo e impostare un nuovo protocollo con una durata di 24 ore con il flusso impostato nella direzione in avanti alla velocità di taglio sperimentale appropriata. Fare clic su Aggiungi e salva con nome per salvare il protocollo e aprire la scheda di configurazione della sequenza. Per impostare una nuova sequenza, selezionate brodo Luria-Bertani a 37 gradi, come fluido predefinito per tutti i canali.Sotto l'iterazione del passaggio 1 per i canali da 1 a 12, selezionare il protocollo con la prima velocità di taglio sperimentale e abilitare tutti i canali. Per i canali da 13 a 24, selezionare il protocollo con la seconda velocità di taglio sperimentale e abilitare tutti i canali. Quindi selezionate Applica (Apply) e Salva con nome (Save As), per salvare la sequenza e aprite il menu Esecuzione automatica (AutoRun) per selezionare la sequenza salvata da utilizzare per l'esecuzione automatica.Per impostare l'esperimento del biofilm di crescita tempormente, aggiungere fino a 1300 microlitri di mezzo minimo sterile nel pozzo di ingresso della piastra microli fluidica e riportare la piastra allo stadio di imaging. Quindi, pulire l'interfaccia con l'etanolo e sigillare la piastra. Verificare che i protocolli e le sequenze siano impostati correttamente.Selezionare Start, per avviare AutoRun, quindi fare clic immediatamente su acquire per avviare la raccolta di immagini al microscopio. Al termine della prima acquisizione dell'immagine, fare clic su Pausa e selezionare la modalità immagine dal vivo nella lunghezza d'onda del campo luminoso. Selezionare Vai a per visualizzare ogni posizione della fase e selezionare Imposta su corrente per impostare le nuove impostazioni.Quindi, fare clic su riprendi, prima di iniziare l'acquisizione pianificata successiva. In questo esperimento rappresentativo di crescita del biofilm a tempo, la copertura del biofilm, o superficie di soglia percentuale, era diversa per tutte e tre le impostazioni di taglio, indicando che la cesoia aveva un'influenza diretta sulla copertura superficiale del biofilm. La misurazione relativa totale dell'accumulo di biofilm è aumentata in funzione del tempo, con il tasso di crescita che è diminuito dalla sollecitazione di taglio più elevata alla sollecitazione di taglio più bassa.In ogni condizione, vi è stato anche un chiaro periodo di crescita esponenziale da cui è stato possibile calcolare un tasso di crescita quantitativo. Nel complesso, il coefficiente di rugosità è diminuito nel tempo in tutte le condizioni di taglio, indicando che tutte le superfici del biofilm sono diventate più lisce. Tuttavia, rispetto al taglio più basso, le impostazioni di taglio più elevate hanno portato a una superficie più liscia nel tempo, indicando che un flusso di taglio più veloce contribuisce a una superficie più liscia e uniforme.Inoltre, l'entropia materale, o la casualità nella morfologia, aumentò nel tempo per tutte le condizioni di taglio. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare di seguire la sequenza specificata e di prendersi il tempo necessario per eseguire ogni passaggio con precisione. Le abilità necessarie possono richiedere alcune corse per padroneggiare.Seguendo questa procedura, altri metodi come HBLC o GCMS, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulle concentrazioni di sottostraights, come il glucosio, consumate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dei biofilm per esplorare ambienti di flusso generale in tempo reale con condizioni sperimentali controllate e campionamento idroterapetico. Non dimenticare che lavorare con ceppi batterici BSL2 può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare dispositivi di protezione adeguati e utilizzare protocolli di scarto appropriati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

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Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

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Ricerca

Bioingegneria

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