Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Эта работа стала возможной благодаря субсидии от национального института для общей медицинской науки (NIGMS) (5P20GM103427), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ)

Авторы не имеют ничего сообщать.

Процедура анализа системы и изображения microfluidic обсуждали здесь сосредоточена на исполнение microfluidic биопленки экспериментов для определения морфологических свойств, которые не требуют полной трехмерной информации, обычно встречаются от конфокальной Микроскоп исследования. К ним относятся microcolony субстрат покрытия (процент охвата), шероховатость поверхности измеряется коэффициент шероховатости и текстурные энтропии. Метод оценки накопления клеток всего относительной биопленки также представлены от которого темпы роста в журнале фаза может быть рассчитана.
Есть некоторые небольшие, но важные шаги, которые должны быть выделены в этом методе. Вытирая интерфейс с алкоголем помогает избежать заражения других бактерий происходит от эксперимента к эксперимент, но также из скважины в одном эксперименте. Грунтование и заполнения также очень важно, потому что грунтовки позволяет пользователю определить, какие каналы позволяют средства массовой информации через каналы без каких-либо помех или засорения. Каналы также не должна быть нарушена (то есть они должны быть постоянно заполнены СМИ) после грунтования увеличить шансы на Успешный эксперимент без воздушных пузырей или засорения. Высева шаг может изменяться согласно тип бактерий и поэтому должны быть оптимизированы для клеток вложения. Например если ячейки не похоже чтобы прикрепить, поверхностных модификаций придется происходят на пластину microfluidic до посева или может потребоваться более длительное время инкубаций. Важно также, чтобы убедиться, что Микроскоп правильно настроен для получения изображения в фокусе и должно периодически контролироваться на протяжении эксперимента, чтобы заверить, что качество изображения получаются. Если фокус находится вне, Микроскоп могут и должны быть скорректированы, как эксперимент продолжается. Во время приобретения изображений последней волны должно быть присвоено Все закрыты для того, чтобы избежать воздействия фильтров и освещение, чтобы только один канал во время ожидания, что происходит между изображения приобретений. Кроме того анализ изображений, который определяет % поверхности покрытия была разработана в доме, потому что монтаж программное обеспечение руководства явно не излагается процедура. Кроме того с тем чтобы расширить анализ изображений и определить другие характеристики, такие как шероховатости поверхности и др., открытого исходного кода Python45 была разработана в доме и общей на хранилище gitHub. Существуют также ограничения на сколько данных может храниться и управляемых на локальном жестком диске, так как CyVerse46необходим внешний жесткий диск или совместного использования данных в сети.
Обычные биореакторов, как CDC реактора и капельного потока реактор34, требуют много средств массовой информации, предоставляют меньше размера выборки и требуют большого количества стерилизации оборудования. В противоположность этому преимущества этой более высокой пропускной способности платформы включают в себя способность управления сдвига, скорости потока, и предположение, что в пробирке экспериментов тесно напоминают в vivo условий. Недостатки системы включают в себя несколько аксессуары и программное обеспечение, которое требует тщательной настройки, которые необходимо выполнить в правильном порядке событий. Кроме того в руководстве, для оборудования полностью не объяснять каждый шаг экспериментов, и программного обеспечения команд, и следовательно, многие ошибки возникают во время экспериментов, в том числе закупорку каналов, отсутствие роста или вложения, или отсутствие высокого качества микроскопии изображений или фильмов. Сам инструмент и расходные материалы, такие как microfluidic пластины, также являются относительно дорогими с ценой более $ 200 за тарелку и не являются многоразовыми. Таким образом в то время как техника одалживает весомых результатов, технического опыта, необходимых для его использования является относительно высоким и требует повторного обучения экспертов в области. В настоящем докладе предпринимается попытка решить эту проблему, предоставляя руководство по новым пользователям этих биореакторов для изучения характеристик биопленки.
Microfluidic системы, которая способна выполнять клеточного анализа, получила значительное внимание для различных научных методов, таких как в микробиологии, иммунологии, гематологии, онкологии и исследования стволовых клеток. Говоря более конкретно технология привела во многих публикациях, описание темы, которые весьма актуальны для медицинских применений37,47, включая микробной устные адгезии48, определение последствий biosurfactants на синегнойной палочки и золотистого стафилококка49,50, принимающей возбудителя взаимодействий в E. coli51, Streptococcus присоединение52и лечение кистозный фиброз53. Учитывая тот факт, что эта система microfluidic является очень гибким, предполагается, что все больше и больше систем будут распространены во всем мире.
Следует тщательно рассмотреть некоторые конкретные протокол шаги. Средства массовой информации может быть разбавлен до 50% с dH2O, чтобы помочь предотвратить пузыри и засорение, но не требуется, в данном случае. Конкретное значение ОД600 используется для заполнения должны определяться с помощью суда работает роста эксперимента чтобы увидеть, что работает лучше всего для конкретного набора условий. Пузыри в скважинах до уплотнения может привести к пузырей в каналах microfluidic и должны быть удалены путем выскочил или сосать вне с кончиком пипетки. Важно сохранить бактерии из небольшой серпантином каналы. Имея равные объемы средств массовой информации в ввода и вывода во время процесса инициализации, поток из-за давления от объема жидкости будет контролироваться так поток только благодаря приложенное давление из системы. Калибровка расстояния следует настроить во время установки представителем компании. Эти параметры являются специфическими для каждой камеры.
Существует несколько проблем, которые возникают, когда нахождение порог наиболее представительных для изображения. Установка максимального порогового значения может быть трудно, если интенсивность средняя пикселей по регионам фона согласуются не вызвало выбрав стадии позицию, которая не находится в центре канала или от мусора на плите. Мм стандартнажмите на процесс, а затем выберите фон и коррекции затенения инструмент для коррекции этих несоответствий. Однако этот инструмент является как правило только полезно, если пользователь принял изображения каналов перед посевом, которые они могут использовать в качестве исходных образов. Или, если фон/затенение ссылкой изображения недоступен, пользователю будет нужно использовать свои грехи, чтобы задать пороговое значение, которое охватывает наиболее область ячейки без включая фоном для всего изображения. Кроме того выберите представителя областей для измерения, которые исключает регионы несоответствие нажмите Прямоугольную область, Эллипс регионаили Региона трассировки выберите регион и выберите Активную область , вместо того, чтобы весь Изображение на окне Показать область статистики (под Инструменты анализа). Если представитель региона используется для порога светлые области изображения, того же региона должны использоваться для определения соответствующего изображения FITC. Это полезно для записи конкретных пространственная статистика (слева, сверху, Ширина, Высота, площадь, периметр), связанные с представителем региона так же региона будут найдены и измерено на соответствующее изображение FITC.
Для предотвращения накопления данных на жестком диске, что приведет к компьютеру замедляться, можно приобрести внешний жесткий диск для хранения данных. Еще один вариант для хранения данных и облегчения обмена данными является платформой биоинформатики CyVerse. Создайте учетную запись в системе CyVerse, перейдя в http://www.cyverse.org/. После входа в систему запуск обнаружения среды, а затем выберите «Журнал в CyVerse». Выберите «данные» и перейдите к ты папке. Если стек изображений на локальном компьютере, выберите «загрузить», то «Простой загрузки от настольного компьютера». Найдите файл изображения стека и выберите для загрузки. Файл или папка может совместно с сотрудниками, если они имеют CyVerse счета и предоставляются разрешения. Совместное использование папки данных для широкой общественности требует, что метаданные добавлен для каждого файла с помощью CyVerse утвержденных стандартов. Эта процедура не будет обсуждаться здесь, потому что это не в рамках этой работы.

Здесь мы покажем способ измерить эффект касательное напряжение на формирование люминесцентные синегнойной палочки (P. aeruginosa) PA01 биоплёнки с помощью автоматизированных microfluidic более высокую пропускную способность системы.
Биоплёнки являются общины микроорганизмов, таких как бактерии, организованный внеклеточного полимерные вещества, которые прикреплены к поддержке и обычно находятся на уровне интерфейса между жидкой и твердой поверхности1. Эти общины биопленки может быть полезным для окружающей среды, такие, как улучшение качества воды в водопроводных линий и биоремедиации непокорных соединений2,3. Однако биоплёнки также может быть очень вредны для здоровья человека с нежелательными последствиями. К примеру медицинских устройств, таких как бедра и колена имплантатов, являются одним из видов поверхности где накопление биопленки был вызов и вызывает серьезные осложнения4,5. Биопленки можно также ввести природных водных систем, таких как реки и озера и проникнуть трубы водоснабжения, ведущих к загрязнению бактерий в питьевой воде, что приводит к инфекции6,,78. Биопленки, образованная в морской среде придерживаться судов и других искусственных субстратов и представить основных экономических и экологических проблем, как увеличение трения приводит к увеличению потребления топлива9,10. Антимикробных покрытий, например трибутилолова, были разработаны для предотвращения этих проблем, но токсичен для морских обитателей11.
P. aeruginosa это грамотрицательные бактерии с высокими возможностями процветает в различных условиях окружающей среды и nutrimental12. P. aeruginosa является распространенной причиной сообщества и внутрибольничных инфекций и нашли, чтобы быть тесно связанных травм, таких, как тяжелые ожоги и ослабленным хостов, таких как в кистозный фиброз (CF)5,12, 13, СПИД и рак пациентов5,13. Образование биопленки P. aeruginosa наиболее серьезно соединен CF, где хронические легочные инфекции являются основной причиной смерти для этой болезни5.
Ссылка штамм P. aeruginosa, PA01, используется в настоящем докладе и генетически модифицированных выразить расширенной зеленого флуоресцентного белка (ПА-EGFP). EGFP представляет собой мутант форму GFP с большей флуоресценции свойств, которая позволяет в situ биопленки анализа с помощью флуоресцентной микроскопии14,,1516. Этот тип анализа флуоресценции выгодно для изучения биоплёнки потому что GFP не вмешиваться значительно функции17и рост клеток. Например клетки Escherichia coli , которые были помечены с GFP росла непрерывно и хорошо не испытав каких-либо токсических эффектов по сравнению с контроля бактерий17. Другие доклады обоснования этой претензии по18,19,20. Кроме того использование флуоресцентных репортер например EGFP является быстрый и простой, но только живые клетки будут оцениваться, потому что мертвые клетки быстро прекратить флуоресцировать21.
Биопленки можно растут в различных экологических условиях, в том числе с различными ставками. К примеру фильмы могут расти в высокое напряжение сдвига, такие как в реках, где высокая вода потока условия ведут к большей микробного разнообразия22. Наоборот стоячей воды в прудах или устные биоплёнки опыт гораздо ниже сдвига силы23. В дополнение к скорости потока, существуют другие факторы, которые влияют биопленки адгезии, включая шероховатости поверхности и гидрофобность, состав средств массовой информации, и даже бактериальных клеток поверхности1,4,7, 24. условия могут также вызвать изменения в пространственной структуре или морфология биопленки. Это включает в себя экологических условий, таких как напряжение сдвига, оказываемое движущейся жидкости или градиентов в наличия питательных веществ и биологических факторов, таких как вид присутствует в системе, подвижности клеток и специфических белков, присутствующих в внеклеточного полимерные вещества25,,2627. При некоторых условиях, биофильмов будет газон как (гладкая и плоская), хотя в других условиях биопленки будет грубой, пушистые, или даже гриб как28. В то время как качественная разница между биопленки газоны и грибов структур можно ясно увидеть в микроскопических изображений, понимание взаимосвязи между структурой фильм и биологические процессы в фильме требует систематических и количественных методы описания морфологии. Морфологические особенности, предложенная исследователями для изучения включают пористость, фрактальная размерность, диффузионных длина, microcolony района на субстрат, microcolony объем, коэффициент шероховатости и текстурные энтропии29,30 .
Биореакторы используются в исследовании биоплёнки для имитации реальных условий31. Капельного потока реакторов (DFR) представляют собой низкий-при сдвиге среду, где питательные вещества в СМИ медленно потока через клетки, которые придают поверхности со временем сформировать биопленки с высоким клетки плотность32. CDC реакторы являются биореакторов, которые создают высокое напряжение сдвига жидкости среды управления перемешивания стержень, который непрерывно вращается в СМИ заполнены танк33. Эти типы биореакторов проста в настройке, но они ограничены в области из-за относительно низкой выборки, высокое потребление средств массовой информации, большое количество зараженные отходы, образующиеся из СМИ капельного потоков, начиная от 125 мкл в минуту для капельного потока реакторов для более чем 1 мл/мин для CDC реакторов и необходимость в автоклаве большое количество посуды и отходов СМИ34. Биопленок не растут равномерно по всей поверхности в реакторе потока капельного потому что низкий наклон СМИ причины скользящий вдоль крупных конгломератов бактерий P. aeruginosa поэтому, биопленки рост не очень гладко и не может быть неравномерным образцы легко проанализирован с флуоресцентной микроскопии35,36 .
Некоторые общие ограничения биореактор преодолеваются с помощью средне-пропускная способность microfluidic биореактора, где требуются только миллилитров средства массовой информации, и реакция пластины являются небольшими и легко одноразовые после автоклавирования37. Кроме того в зависимости от количество скважин, многие репликации могут быть выполнены в только один реактор, запуска, которая обеспечивает достаточное количество данных для проведения конструктивного статистического анализа. На рисунке 1различных компонентов системы microfluidic микроскопия, которые позволяют контролируемых условиях, в том числе температуры и потока скорость38,,3940, показываются. Реактор в сочетании с микроскопии флуоресцирования визуализировать флуоресценции EGFP тега в PA01 под низко применяется через высокого сдвига условия, которые будут имитировать более реалистичных сценариев, которые встречаются в окружающей среде или в области биомедицины.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Рисунок 1 : Отдельные компоненты системы Microfluidic. Отдельные компоненты перечислены слева направо: 1. CCD камера, 2. высокой резолюции инвертированный микроскоп с автоматизированной стадии, автоматизированный модуль флуоресценции и автофокусировки модуль, 3. плита этап, 4: Imaging системы интерфейс, 5: руководство микроскопа Управления, 6: Пара ловушку, 7: Imaging системы контроллер (включая температуры), 8: аппаратные контроллеры, 9: флуоресценции контроллер, 10: источники бесперебойного питания, 11: внешний жесткий диск для хранения изображений, 12: ПК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Отрывок из плиты microfluidic показано на рисунке 2. Наиболее часто используемые плиты состоят из 48 скважин. Один эксперимент требует один вход и один выход скважин, в общей сложности 2 скважин. Это позволяет для 24 одновременных экспериментов, которые могут быть выполнены с различных экспериментальных условиях, таких как бактериальных штаммов, антимикробного лечения и средства массовой информации варьируется от канал и контролируемых сдвига потока для каждого столбца из шести каналов. Экспериментальный температура контролируется также с одной температуры по всей пластине. Microfluidic каналы показывают, что каждый канал имеет змеевик региона оказать достаточное давление задней и контролируемых сдвига.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Рисунок 2: визуализация microfluidic каналов и окно просмотра. Два впускных и выпускных скважин с microfluidic каналов, связывающих их выделяются красные и зеленые красители. Краситель делает видимыми серпантином региона в каждом канале, который создает достаточное давление задней и контролируемых сдвига во время потока жидкости. Каждый канал просмотра (внутри красный круг) может быть imaged с желаемой длины волн. Изображены яркие области (вверху) и люминесцентные (внизу) микроскопии изображений одного канала с биопленки PA01-EGFP, используя объектив 20 X. Шкалы бар = 80 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Шаг за шагом руководство предоставляется пользователям microfluidic биореакторов, которые соединены с флуоресцентной микроскопии для проведения Роман биопленки экспериментов с использованием различных сдвига сред. Этот метод позволит для расширения экспериментов с участием других микроорганизмов, помимо бактерий, грибов и водорослей, которые имеют медицинские и экологические приложения41,42,43. Детальный подход описывает культура PA01-EGFP, прививать 48-ну тарелку и microfluidic устройство и программное обеспечение, настроить флуоресцентный микроскоп и продемонстрировать анализ программного обеспечения для получения покрытия биопленки, темпы роста, и морфологических свойств, таких как шероховатость поверхности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Более высокая пропускная способность microfluidic в vitro биореактора, в сочетании с микроскопии флуоресцирования был использован для изучения роста бактериальные биопленки и морфологии, включая синегнойной палочки (P. aeruginosa). Здесь мы будем описывать, как система может использоваться для изучения кинетики роста и морфологических свойств, таких как шероховатость поверхности и текстурные энтропии штамм P. aeruginosa PA01, который выражает расширенной зеленого флуоресцентного белка (PA01-EGFP ). Подробный протокол будет описывать как расти и семян культур PA01-EGFP, как установить микроскоп и автозапуска и проводить анализ изображений для определения темпов роста и морфологических свойств, с помощью различных сдвига, которые находятся под контролем microfluidic устройство. Эта статья даст подробное описание методики для улучшения деятельности по изучению биоплёнки PA01-EGFP, который в конечном итоге может быть применен к другим штаммов бактерий, грибов и водорослей биопленки, используя microfluidic платформа.

Рисунок 4 показывает процент показатели области со временем от 24 h на сдвиг потоков 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2. Биопленки покрытия или % порог площадь поверхности (C [%]) был различных настроек для всех трех сдвига. Биопленки охват был быстрейшим на сдвиг2 1.0 Дин/см, где порог области возросла с 2-5% до 100% после 200 мин роста и достиг стационарной фазы после 400 мин. На 0,5 дин/см2биопленки освещение было отложено и начал расти в 400 мин, достигнув 100% покрытия после 800 мин. Низкие сдвига на 0.2 Дин/см2 четко продемонстрировали медленное увеличение охвата биопленки, где процент охвата начал расти на 500 мин, но никогда не выходит за пределы области 65% порог. Эти результаты показали, что сдвиг имел непосредственное влияние в биопленки поверхности покрытия. Более высокие сдвига, как представляется, быть более оптимальные условия для роста биопленки, возможно, с тем, что средства массовой информации представил бактерий с больше питательных веществ, так что биопленки могут размножаться быстрее.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Рисунок 4: пороговое значение % площади, накопление всего биопленки, коэффициент шероховатости и текстурные энтропии. ) Процент порога области (C [%]) с течением времени, используя 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2 над 24 h период времени. Данные были получены из одного канала для каждого условия сдвига. b) всего биопленки накопления (относительная мера) как функцию от времени, с помощью 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2 над 24 h период времени. Черные линии являются наименьших квадратов подходит к экспоненциальной модели. Данные были получены из одного канала для каждого условия сдвига. c) шероховатости коэффициент PA01-EGFP с использованием значений напряжения сдвига 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2 наблюдение за более чем 24 h. данных был получен из одного канала для каждого условия сдвига. d) Текстурные энтропии PA01-EGFP значениями напряжения сдвига 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2. Данные были получены из одного канала для каждого условия сдвига (Valquier-Флинн, H., Sutlief, а.л., Уэнтуорт, ПД, 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Рисунок 4 b согласуется с выводами, показано на рисунке 4. Биопленки накопления (N[рел]) был измерен основаны на предположении, что GFP сигнала в точке изображения пропорциональна плотности живой клетки в этой позиции. Это показывает, что общее относительное измерение биопленки накопления увеличились как функцию от времени, с помощью 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2 над 24 h период времени, а темпы роста снизился с высокого напряжения сдвига для низкого напряжения сдвига. Существует четкое время период, давая экспоненциальный рост, от которого темпы количественного роста могут быть рассчитаны.
Рисунок 4 c демонстрирует коэффициент шероховатости (R) на сдвиг потоков 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2. Шероховатость поверхности, количественно коэффициент шероховатости, измеряет дисперсию в профиль толщины пленки. Официальное определение
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
где T,я - я-го измерения толщины, Т -средняя толщина, а N — это количество измерений толщины30. Процедура, описанная в этом расследовании измеряет толщину, связанные с живых клеток. Плоского расположения клеток даст коэффициент шероховатости нуля, хотя значительные вариации толщины от среднего даст больше, чем один коэффициент шероховатости. Аналогично при сдвиге влияние на темпы роста и процент порога освещение фильма, биоплёнки выставлены различных топологий с течением времени. В целом R уменьшилось со временем для всех условий сдвига, указав, что все поверхности стала гладкой. Однако по сравнению с низким сдвига 0.2 Дин/см, более высокие параметры сдвига 0,5 и 1,0 Дин/см2 привело к гладкой поверхности с течением времени, указывающее, что быстрее потока сдвига способствовали более гладкой и более даже поверхность и высокие сдвига 1.0 Дин/см2 опускается ниже 0.2 R.
Гладкость, регулярность или грубость поверхности может также выражаться в текстурные энтропии (TE). TE-это свойство, используемое в анализе изображений для измерения степени случайности в двумерное изображение. Его расчет основан на серый уровне совместного появления матрицы, определяется Хараликом и др., который смотрит на ли значения пикселов в одном месте коррелируются с значений пикселов в другом месте44. Высокая степень корреляции приведет к низкой энтропии. Рисунок 4 d изображает TE на сдвиг потоков 0,2, 0,5 и 1,0 Дин/см2. TE увеличилось со временем для всех условий сдвига, но высоким касательное напряжение в достиг максимальной TE (1.0) раньше, чем нижняя касательные напряжения в 900 мин 1.0 Дин/см. Низкие сдвига 0.2 Дин/см2 имели низкие TE (0,8), достигнув своего максимума после 1000 мин. Однако промежуточные касательное напряжение 0.5 дин/см2 достиг своей максимальной TE (1.2) намного позже, чем условия, высокое или низкое напряжение сдвига.
Коэффициент шероховатости и TE измеряют различные функции. В то время как плоская пленка будет иметь коэффициент низкой шероховатости и низкой энтропии, фильм с значительные различия в толщине будет иметь высокий шероховатости коэффициент, но может все еще быть низкой энтропии, если колебания синусоидального, а не случайных. В этом случае R сократилась с повышенной касательное напряжение и время TE тенденции не связаны непосредственно с сдвига стресс, применяется к биопленки со временем.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Рисунок S1 : Изображение захват управления программным обеспечением windows. Программное обеспечение окно с мерной приобретения мульти меню (вверху). Модуль управления для автозапуска (внизу). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> На рисунке С2 Образ захвата программного обеспечения для обзора данных. Окно приложения после выбора набора данных интерес, используя средство Обзора Multi многомерных данных из меню Инструменты анализа . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Здесь мы описывают использование биореактор microfluidic более высокой пропускной способности в сочетании с флуоресцентный микроскоп для анализа воздействия касательное напряжение на биоплёнки Pseudomonas aeruginosa , выражая зеленый флуоресцентных белков, включая инструмент Настройка, определение охвата биопленки, темпы роста и морфологических свойств.

Жить анализа клеток касательное напряжение на синегнойной палочки с помощью автоматизированной системы Microfluidic высшее-пропускная способность

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, о развитии биопленки, такие как, как определить ключевые условия окружающей среды, которые влияют на рост биопленки и поведенческие характеристики во время развития. Основным преимуществом этой техники является то, что многоканаленные, микрожидкие пластины, позволяют быстро обзадать статистически значимые результаты. Хотя этот метод может дать представление о структуре биопленки, он также может быть применен к изучению лечения антибиотиками, и биовосстановления.Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что пристальное внимание к деталям протокола и дотошные навыки, необходимы. Чтобы избежать ошибки при подключении прибора к программному обеспечению, сначала включите рабочую станцию ПК, а затем модуль флуоресценции. Убедитесь, что флуоресценция затвора на, и включите аппаратные контроллеры.Затем включите контроллер системы визуализации и камеру CCD. Затем включите станцию визуализации. Когда все оборудование будет готово, запустите контрольное приложение и введите номер, расположенный на этикетке на боковой стороне пластины.Для грунтовки, сначала удалите 48 хорошо микро-жидкой пластины из упаковки, не касаясь стеклянной поверхности в нижней части пластины, и очистить стеклянную горку на дне пластины, с ткани объектива. Для подготовки микрожидких каналов, пипетки 200 микролитров 37 градусов по Цельсию минимальной среде в выход хорошо, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Затем поместите пластину на сцену пластины.Протрите интерфейс этанолом, запечатав его на сцене пластины, как только этанол высохнет. В ручном режиме на модуле управления установите жидкость, как бульон Лурия-Бертани при 37 градусах по Цельсию, и максимум как пять дым на квадратный сантиметр. Нажмите на выходные скважины, чтобы активировать поток от выхода к входной скважине, чтобы загрунтовать каналы.Через пять минут приостановить поток, чтобы подготовиться к посевной, и тщательно удалить пластину со сцены. Затем аспирировать любую остаточную среду из вывода хорошо, не удаляя никакой среды из внутреннего круга, что приводит к микро-жидкостных каналов. Чтобы посеять экспериментальные каналы, добавьте 300 микролитров минимальной среды в входной колодец, а затем добавление 300 микролитров бактериальной культуры, в выход хорошо.Верните пластину на этап изображения убедившись, что протрите интерфейс этанолом, прежде чем поместить его на тарелку, и использовать живой канал камеры, чтобы сосредоточиться на одном канале. При визуальном мониторинге живого корма, возобновить поток на 1 до 2 дым на квадратный сантиметр в течение примерно 2 до 4 секунд, чтобы клетки, чтобы войти в экспериментальный канал, но не серпантинные каналы, и оставить пластину на стадии контроля температуры в течение одного часа, чтобы клетки, чтобы прикрепить. В конце периода крепления, тщательно удалить пластину со сцены и аспирировать бактерии из выходных хорошо, не нарушая канал.Затем используйте новый наконечник пипетки, чтобы удалить среду из входных скважин. В программном обеспечении откройте многомерное приобретение для управления получением изображения микроскопа и выберите промежуток времени, несколько этапных позиций и несколько длин волн. В вкладке сохранения, создать простое базовое имя, убедившись, что incroments базовое имя, если файл существует, проверяется.Включите в описание любые существенные детали эксперимента. Нажмите выберите каталог, чтобы выбрать папку, в которой все файлы будут сохранены под вкладкой промежуток времени, настроить продолжительность экспериментального времени, до 24 часов, и установить интервал времени для получения изображений каждые пять минут в течение эксперимента. Используйте живой канал камеры и 10x цель установить положение сцены, сосредоточив внимание на центре канала, расположенный выше или ниже номера канала выгравированы на пластине.Переключитесь на цель 20x и найдите оптимальную зону обзора и фокусную плоскость внутри канала. Затем добавьте положение этапа в список с новыми настройками. В меню длин волн установите количество длин волн до 3 и установите первую длину волны FITC 100%-камеры, с десятими миллисекундной экспозицией, второй длиной волны до яркого поля 50%камеры 50% видимой, с минимальным временем экспозиции 3 миллисекунды и третьей длиной волны до всех закрытых, так что свет не остается на последнем канале между временем приобретения.В меню редактирования AutoRun откройте вкладку настройки протокола и установите новый протокол с 24-часовой продолжительностью с потоком, установленным в форвардном направлении при соответствующей экспериментальной скорости снопы. Нажмите добавить и сохранить, чтобы сохранить протокол и открыть вкладку настройки последовательности. Чтобы создать новую последовательность, выберите бульон Лурия-Бертани при 37 градусах, как жидкость по умолчанию для всех каналов.В соответствии с этапом итерации 1 для каналов 1 до 12, выберите протокол с первой экспериментальной скоростью стрижки и включите все каналы. Для каналов с 13 по 24 выберите протокол со второй экспериментальной скоростью снора и включите все каналы. Затем выберите Apply and Save As, чтобы сохранить последовательность и откройте меню AutoRun, чтобы выбрать сохраненную последовательность, которая будет использоваться для AutoRun.Чтобы настроить эксперимент по биопленки при росте, добавьте до 1300 микролитров стерильной минимальной среды в входной колодец микрожидкой пластины и верните пластину на стадию визуализации. Затем протрите интерфейс этанолом и загерметив тарелку. Подтвердите правильное настройку протоколов и последовательностей.Выберите старт, чтобы начать AutoRun, и сразу же нажмите приобрести, чтобы начать сбор изображений микроскопа. В конце первого приобретения изображения нажмите паузу и выберите режим живого изображения в длине волны яркого поля. Выберите перейдите для просмотра каждой позиции этапа и выберите набор для текущего, чтобы установить новые настройки.Затем нажмите резюме, прежде чем начать следующее запланированное приобретение. В этом репрезентативном эксперименте по росту биопленки покрытие биопленки, или процентная пороговая площадь поверхности, отличалось для всех трех параметров стрижки, что указывает на то, что слэйр оказал непосредственное влияние на покрытие поверхности биопленки. Общее относительное измерение накопления биопленки, увеличено как функция времени, при темпы роста склоняясь от самого высокого напряжения стрижки к самому низкому стрессу стрижки.При каждом условии существует также четкий период экспоненциального роста, на основе которого можно рассчитать количественные темпы роста. В целом коэффициент шероховатости со временем снижался при всех условиях стрижки, что свидетельствует о том, что все поверхности биопленки стали более гладкими. Однако, по сравнению с самым низким сливом, более высокие параметры слэра привели к более гладкой поверхности с течением времени, что указывает на то, что более быстрый поток стрижки способствует более гладкой и равномерной поверхности.Кроме того, текстурная энтропия, или случайность в морфологии, увеличилась с течением времени для всех условий стрижки. При выполнении этой процедуры важно помнить, чтобы следовать указанной последовательности и взять время, чтобы выполнить каждый шаг точно. Необходимые навыки могут занять несколько работает освоить.После этой процедуры, другие методы, такие как HBLC или GCMS, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о концентрациях подстроек, таких как глюкоза, потребляется. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биопленок для изучения общих условий потока в режиме реального времени с контролируемыми экспериментальными условиями и гидротерапии выборки. Не забывайте, что работа с бактериальными штаммами BSL2 может быть чрезвычайно опасной, и что такие меры предосторожности, как ношение надлежащего защитного оборудования и использование соответствующих протоколов отходов, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; &#39;Передвижение

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Систематический анализ<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Сотовый Роллинг Использование нескольких хорошо Plate микрофлюидных системы

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

С помощью клея паттернирования Построить 3D бумаги микрожидком устройств

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Проектирование микрожидком устройств для исследования клеточных реакций по разовым или сосуществующих Chemical / Electrical / касательное напряжение раздражители

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...