Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Este trabajo fue posible por becas del Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5P20GM103427), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH)

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento de análisis de imagen y sistema de microfluidos discutidos aquí se centra en la ejecución de experimentos de biofilm microfluídicos para determinar propiedades morfológicas que no requieren la información completo tridimensional típicamente de confocal estudios de microscopio. Estos incluyen cobertura de sustrato microcolony (porcentaje cobertura), rugosidad de la superficie medida por el coeficiente de rugosidad y textura entropía. Un método para estimar la acumulación de biofilm relativa total de la célula se presenta también de que las tasas de crecimiento de registro de fase puede ser calculada.
Hay varios pasos pequeños pero significativos que destacar en este método. Limpiar la interfaz con el alcohol ayuda a evitar la contaminación de otras bacterias en ir de un experimento a experimento pero también de bien a bien en un experimento. Cebado y siembra son también muy importantes ya cebado permite al usuario determinar los canales que permiten que los medios de comunicación que fluya a través de los canales sin interferencias u obstrucción. Canales también no deben ser perturbado (es decir, que deben ser constantemente llenos de medios de comunicación) después de cebado para aumentar las posibilidades de un experimento exitoso con sin burbujas de aire o de obstrucción. El paso de siembra puede variar según el tipo de bacterias y así debe optimizarse para el accesorio de la célula. Por ejemplo, si las células no parecen conectar, pueden tener modificaciones superficiales que ocurren en la placa microfluídica antes de la siembra o tiempos de incubaciones más largos pueden ser necesario. También es importante asegurarse de que el microscopio está configurado correctamente para obtener una imagen enfocada y debe controlarse periódicamente durante todo el experimento para asegurar que se obtienen imágenes de calidad. Si el foco está apagado, el microscopio puede y debe ser ajustado como el experimento continúa. Durante el tiempo de adquisición de imagen, la última longitud de onda debe establecerse en Todo cerrado para evitar la exposición de filtros e iluminación a un único canal durante el tiempo de espera que se produce entre la adquisición de la imagen. Además, el análisis de imágenes que determina el % de cobertura superficial fue diseñado en la casa porque el manual de software de montaje describen explícitamente el procedimiento. Además, con el fin de ampliar en el análisis de la imagen y determinar otras características tales como rugosidad, etcetera., abierta fuente código basado en Python45 fue desarrollado en la casa y compartida en el repositorio de gitHub. También hay limitaciones en la cantidad de datos puede almacenarse y gestionado en el disco duro, así que es necesario un disco duro externo o el uso compartido de datos en línea como CyVerse46.
Biorreactores convencionales, tales como el reactor de CDC y el reactor de flujo de goteo de34, requieren mucho de los medios de comunicación, proporcionan menos los tamaños de muestra y demandan una gran cantidad de esterilización de equipos. En cambio, las ventajas de esta plataforma de rendimiento más alto incluyen la capacidad de corte de control, las tasas de flujo, y la asunción que la vitro en experimentos de cerca se asemejan a condiciones en vivo . Desventajas del sistema incluyen los múltiples accesorios y software que requieren una meticulosa instalación debe realizarse en el orden correcto de los acontecimientos. Además, el manual que se proporciona para los equipos no explica completamente cada paso de los experimentos y los comandos del software, y por lo tanto, muchos errores se producen durante los experimentos, incluyendo la obstrucción de canales, falta de crecimiento o accesorio, o las imágenes de microscopía de alta calidad falta o películas. El propio instrumento y consumibles, como las placas de microfluidos, también son relativamente caros con un precio de más de $200 por placa y no son reutilizables. Así, mientras que la técnica da resultados de gran alcance, los conocimientos técnicos necesarios para su uso es relativamente alto y requiere entrenamiento repetido por expertos en la materia. Este informe intenta resolver este problema al proporcionar una guía para nuevos usuarios de estos biorreactores para estudiar las características de los biofilms.
El sistema de microfluidos, que es capaz de realizar análisis celular, ha ganado considerable atención para diversas modalidades científicas, tales como en microbiología, Inmunología, hematología, oncología y célula de vástago investigación. Más específicamente, la tecnología ha dado lugar a numerosas publicaciones que describen temas que son altamente relevantes para aplicaciones médicas37,47, incluyendo adherencia oral microbiana48, determinar los efectos de la biosurfactantes en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus49,50, sede de las interacciones patógeno de e. coli51, Streptococcus adherencia52y el tratamiento de fibrosis quística53. Dado que este sistema de microfluidos es muy versátil, se prevé que los sistemas cada vez más se distribuirán en todo el mundo.
Algunos pasos de protocolo específico se deben considerar cuidadosamente. Los medios de comunicación se pueden diluir al 50% con dH2O para ayudar a prevenir las burbujas y la obstrucción pero no era necesario en este caso. El valor específico de OD600 utilizado para la siembra debe ser determinado usando pistas de prueba de un experimento de crecimiento para ver qué funciona mejor para el conjunto particular de condiciones. Burbujas en los pocillos antes de sellado pueden conducir a burbujas en los canales de microfluidos y deben ser retiradas por estallar o aspirado hacia fuera con una punta de pipeta. Es importante mantener las bacterias fuera de los canales pequeños del serpentín. Al tener volúmenes iguales de los medios en la entrada y salida durante el proceso de transferencia, flujo debido a la presión del volumen líquido será controlado por flujo es solamente debido a la presión aplicada al sistema. Las distancias de calibración deben establecerse durante la instalación por el representante de la empresa. Estos ajustes son específicos para cada cámara.
Hay varios desafíos que se presentan al encontrar el umbral más representativo para una imagen. Establecer valores de umbral máximo puede ser difícil si no es coherente la intensidad promedio de píxeles en todas las regiones del fondo causado seleccionando una posición que no está en el centro del canal o de suciedad en la placa. Bajo MM estándar, haga clic en procesoy seleccione herramienta de fondo y corrección de sombreado a la corrección de estas inconsistencias. Sin embargo, esta herramienta generalmente sólo es útil si el usuario ha tomado imágenes de los canales antes de sembrar que pueden utilizar como imágenes de referencia. O, si el fondo/sombreado referencia imágenes no están disponibles, el usuario deberá usar su juicio para establecer un valor umbral que cubre más área de celular sin incluir el fondo de la imagen. Como alternativa, seleccione áreas representativas a medida que excluyen a las regiones de inconsistencia por haga clic en Región Rectangular, Elipse regióno Región de rastro que seleccione una región y Región activa en lugar de entero Imagen en la ventana Mostrar región estadística (en Herramientas de análisis). Si se utiliza una región representativa de umbral la imagen de campo claro, la misma región pueden usarse para la medición de la imagen correspondiente de FITC. Es útil grabar la específica estadística espacial (izquierda, arriba, ancho, altura, área, perímetro) asociada con la región representativa para la misma región se encuentra y medida sobre la imagen correspondiente de FITC.
Para evitar la acumulación de datos en el disco duro que hará que el equipo reducir la velocidad, se puede comprar un disco duro externo para almacenamiento de datos. Otra opción para el almacenamiento de datos y facilitar intercambio de información es la plataforma de Bioinformática de CyVerse. Crear una cuenta en el sistema de CyVerse por ir a http://www.cyverse.org/. Una vez conectado, inicie el entorno de descubrimiento luego seleccione "Registro en CyVerse". Seleccionamos "datos" y vaya que tienes la carpeta. Si la pila de la imagen está en el equipo local luego seleccionar "subir" y luego "Upload Simple desde el escritorio". Encontrar el archivo de imagen de la pila y seleccione subir. El archivo o carpeta puede compartirse con colaboradores si tienen una cuenta de CyVerse y se otorga el permiso. Uso compartido de la carpeta de datos al público en general requiere agregar que los metadatos para cada archivo con CyVerse aprobado normas. Este procedimiento no se discutirán aquí porque esto no está dentro del alcance de este trabajo.

Aquí le mostraremos un método para medir el efecto de la tensión de esquileo en la formación de fluorescente Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa) PA01 biopelículas usando un sistema automatizado de un mayor rendimiento de microfluidos.
Los biofilms son comunidades de microorganismos, como bacterias, organizadas por una sustancia polimérica extracelular que se unen a un soporte y normalmente se encuentran en la interfase entre un líquido y un sólido superficie1. Estas comunidades biofilm pueden ser beneficiosas para el medio ambiente, tales como mejorar la calidad del agua en las líneas de suministro de agua y biorremediación de recalcitrantes compuestos2,3. Sin embargo, los biofilms también puede ser altamente perjudiciales para la salud humana con consecuencias indeseables. Por ejemplo, dispositivos médicos, tales como implantes de cadera y rodilla, son un tipo de superficie donde la acumulación de biofilm ha sido un desafío y causa severas complicaciones médicas4,5. Biofilms puede también entrar en los sistemas naturales de agua, como ríos y lagos e infiltrarse en tuberías de abastecimiento de agua conduciendo a contaminación por bacterias en agua potable, dando por resultado infecciones6,7,8. Biofilms formados en ambientes marinos se adhieren a los barcos y otros sustratos artificiales y presentan un grave problema económico y ambiental como aumento de la fricción conduce a aumentar el consumo de combustible9,10. Recubrimientos antimicrobianos, como el tributilestaño, se han desarrollado para prevenir estos problemas pero son tóxicos para la vida marina11.
P. aeruginosa es una bacteria gram negativa con alta capacidad próspera en una variedad de condiciones ambientales y nutrimental12. P. aeruginosa es una causa común de infecciones comunitarias y nosocomiales y a estar estrechamente asociadas a lesiones, como quemaduras graves y los anfitriones immunocompromised, tales como en la fibrosis quística (CF)5,12, 13, SIDA y cáncer pacientes5,13. La formación de biofilms de p. aeruginosa se ha conectado más seriamente a CF, donde infecciones pulmonares crónicas son la principal causa de muerte por esta enfermedad5.
Una cepa de referencia de p. aeruginosa, PA01, es utilizada en este informe y es genéticamente modificada para expresar una proteína verde fluorescente mejorada (PA-EGFP). EGFP representa una forma mutante de GFP con mayores propiedades de fluorescencia que permite en situ biofilm análisis mediante microscopía de fluorescencia14,15,16. Este tipo de análisis de la fluorescencia es ventajoso para el estudio de biofilms porque GFP no interfiere significativamente con el crecimiento de la célula y función17. Por ejemplo, las células de Escherichia coli que fueron marcadas con GFP crecieron bien y continuamente sin haber sufrido ningún efecto tóxico en comparación con la de las bacterias de control17. Otros informes corroborar esta afirmación18,19,20. Además, el uso de un reportero fluorescente como EGFP es rápida y sencilla, sin embargo, células vivas sólo se medirán porque las células muertas rápidamente dejan de emitir fluorescencia21.
Biofilms puede crecer bajo diferentes condiciones ambientales los caudales diferentes incluidos. Por ejemplo, las películas pueden crecer en alta tensión de esquileo, como en los ríos, donde las condiciones de flujo de agua conducen a una mayor diversidad microbiana22. Por el contrario, agua en estanques o biofilms orales experimentan una mucho más baja del esquileo fuerza23. Además de flujo, existen otros factores que influyen en la adherencia de biofilm, rugosidad de la superficie como hidrofobicidad, composición de los medios de comunicación, y aún el bacteriano de la célula superficie1,4,7, 24. condiciones también pueden causar variación en la estructura espacial o la morfología de un biofilm. Esto incluye condiciones ambientales como la tensión de esquileo ejercida por un líquido móvil o gradientes en la disponibilidad de nutrientes y factores biológicos como las especies presentan en el sistema, la motilidad de las células y las proteínas específicas presentes en el medio extracelular sustancia polimérica25,26,27. Bajo ciertas condiciones, el biofilm será como césped (lisa y plana), mientras que bajo otras condiciones el biofilm será áspero, esponjoso, o incluso hongos como28. Mientras que la diferencia cualitativa entre biofilm céspedes y seta se aprecia claramente en imágenes microscópicas, entender la relación entre la estructura de la película y los procesos biológicos dentro de la película requiere sistemática y cuantitativa métodos de descripción de la morfología. Propiedades morfológicas sugeridos para el estudio por los investigadores incluyen porosidad, longitud difusional, dimensión fractal, área microcolony en el sustrato, microcolony volumen, coeficiente de rugosidad y textura entropía29,30 .
Biorreactores se utilizan en el estudio de biofilms para imitar la vida real las condiciones31. Reactores de flujo de goteo (DFR) representan un ambiente de baja cizalladura donde nutrientes en medios de comunicación fluyen lentamente a través de las células que están sujetando a una superficie con el tiempo para formar un biofilm con un celular alta densidad32. Reactores de CDC son Biorreactores que crean un ambiente de alta tensión de esquileo líquido por el control de una varilla que gira continuamente dentro de los medios de comunicación llenado tanque33. Estos tipos de biorreactores son fáciles de configurar, pero están limitados en alcance debido al tamaño de muestra relativamente baja, el alto consumo de medios de comunicación, grandes cantidades de desechos con riesgo biológico producido a partir de los medios de comunicación corrientes de goteo desde 125 μl/minuto para reactores de flujo de goteo a más de 1 mL/min para reactores de CDC y la necesidad de grandes cantidades de autoclave de material de vidrio y residuos de los medios de comunicación34. Biofilms no crecen uniformemente por toda la superficie en un reactor de flujo de goteo porque el bajo cizallamiento de los medios de comunicación provoca que se arrastra a lo largo de los más grandes conglomerados de bacterias p. aeruginosa por lo tanto, el crecimiento del biofilm no es muy suave y las muestras desiguales no pueden ser fácilmente analizados con microscopía de fluorescencia35,36 .
Algunas limitaciones comunes del biorreactor se superan mediante el uso de un biorreactor de rendimiento medio de microfluidos, donde sólo mililitros de los medios de comunicación son necesarios, y las placas de reacción son pequeñas y fácilmente desechable después de autoclavar37. Además, dependiendo del número de pozos, se pueden realizar muchas repeticiones en un reactor de ejecutar, que proporciona la cantidad suficiente de datos para llevar a cabo análisis estadístico significativo. En la figura 1, se muestran los diferentes componentes del sistema de microfluidos-microscopía que permiten condiciones controladas, incluyendo temperatura y fluyen tasa38,39,40. El biorreactor es junto con microscopía de fluorescencia para visualizar la fluorescencia de la etiqueta EGFP en PA01 bajo aplicado bajo condiciones de alta cizalladura que imitará a escenarios más realistas que se encuentran en el ambiente o en el campo biomédico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figura 1 : Los componentes individuales del sistema de microfluidos. Los componentes individuales se enumeran de izquierda a derecha: 1. cámara CCD, 2. alta resolución invertido microscopio automatizado etapa, módulo de fluorescencia automatizada y módulo de enfoque automático, 3. fase de placa, 4: imágenes de sistema de interfaz, 5: Manual de platina del microscopio Control, 6: Trampa de Vapor, 7: sistema controlador (controlador de temperatura incluyendo), 8 de imagen: Controladores de Hardware, 9: regulador de fluorescencia, 10: fuente de alimentación ininterrumpida, 11: disco duro externo para almacenamiento de imágenes, 12: estaciones de trabajo PC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Un fragmento de la placa de microfluidos se muestra en la figura 2. Las placas más utilizadas consisten en 48 pozos. Un experimento requiere una entrada y una salida pozos, un total de 2 pozos. Esto permite 24 experimentos simultáneos que se pueden realizar con diversas condiciones experimentales, tales como cepas de bacterias, tratamientos antimicrobianos y los medios de comunicación variaron de canal a canal y controlado flujo de corte para cada columna de seis canales. También se controla la temperatura experimental con un ajuste de temperatura a lo largo de la placa. Los canales de microfluidos muestran que cada canal tiene una región serpentina para proporcionar suficiente presión y cizallamiento controlado.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figura 2: visualización de los canales de microfluidos y ventana. Se destacan dos pozos de entrada y salida con los canales de microfluidos conectarlos con colorantes rojos y verdes. El tinte hace visible una región serpentina en cada canal que crea suficiente presión y cizallamiento controlado durante el flujo de fluidos. Cada canal de visualización (dentro del círculo rojo) puede ser reflejada con longitudes de onda deseadas. Campo claro (arriba) y fluorescentes (abajo) se muestran imágenes de microscopía de un solo canal con una biopelícula de PA01-EGFP mediante objetivo 20 X. Barra de escala = 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Una guía paso a paso se proporciona para permitir a los usuarios de biorreactores de microfluidos que se juntan con microscopía de fluorescencia para llevar a cabo experimentos biofilm novela corte diferentes ambientes. Este método permitirá la expansión de los experimentos que implican otros microorganismos además de bacterias como hongos y algas, que tienen aplicaciones médicas y ambientales41,42,43. El enfoque detallado describe cómo cultura PA01-EGFP, inocular una placa de 48 pozos y configurar el dispositivo de microfluidos y el software, configurar el microscopio fluorescente y demostrar el análisis de software para obtener la cobertura de biofilm, la tasa de crecimiento, y características morfológicas como la rugosidad de la superficie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Un mayor rendimiento microfluídicos en vitro biorreactor juntado con microscopía de fluorescencia se ha utilizado para el estudio de crecimiento del biofilm bacteriano y la morfología, incluyendo aeruginosa de los Pseudomonas (p. aeruginosa). Aquí, vamos a describir cómo el sistema se puede utilizar para estudiar la cinética de crecimiento y las características morfológicas tales como la rugosidad de la superficie y textura entropía de p. aeruginosa cepa PA01 que expresa una proteína verde fluorescente mejorada (PA01-EGFP ). Un protocolo detallado describe cómo crecer y sembrar cultivos PA01-EGFP, cómo ajustar el microscopio y el autorun y realizar el análisis de imagen para determinar la tasa de crecimiento y propiedades morfológicas usando una variedad de fuerzas de cizalla que son controlados por el dispositivo de microfluidos. Este artículo proporcionará una descripción detallada de una técnica para mejorar el estudio de biofilms PA01-EGFP que eventualmente puede aplicarse a otras cepas de biofilms de bacterias, hongos o algas utilizando la plataforma de microfluidos.

Figura 4 una muestra la zona thresholded por ciento con el tiempo de una 24 h en corrientes de corte de 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2. El biofilm cobertura o por ciento superficie área del umbral (C [%]) fue diferente para todos los valores de tres del esquileo. La cobertura de biopelícula fue el más rápida en el esquileo de 1,0 Dina/cm2 , donde el área del umbral mayor de 2-5% a 100% después de 200 min de crecimiento y llegado a una fase estacionaria después de 400 minutos. En 0,5 Dina/cm2, la cobertura de biofilm se retrasó y comenzó a aumentar a 400 min llegar a 100% de cobertura de después de 800 min. La corte más baja en 0,2 Dina/cm2 demostró claramente el aumento más lento de biofilm cobertura, donde cobertura porcentaje comenzó a aumentar a 500 minutos pero nunca llegó más allá del umbral de 65%. Estos resultados indicaron que la corte tuvo una influencia directa en la cobertura superficial de biofilm. La cizalla mayor parece ser una condición más óptima para el crecimiento de la biopelícula, posiblemente debido a que los medios de comunicación proporcionan las bacterias con más nutrientes para que el biofilm puede proliferar más rápido.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figura 4: porcentaje umbral zona acumulación de biofilm total, coeficiente de rugosidad y textura entropía. área del umbral un) por ciento (C [%]) con el tiempo usando 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2 durante 24 h período de tiempo. Se obtuvieron datos de un canal para cada condición de corte. b) total de acumulación de biofilm (medida relativa) como una función del tiempo utilizando 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2 durante 24 h período de tiempo. Las líneas negras son mínimos cuadrados se ajusta a un modelo exponencial. Se obtuvieron datos de un canal para cada condición de corte. c) coeficiente de rugosidad de la PA01-EGFP usando valores de tensión de esquileo de 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2 sobre 24 h. datos de seguimiento se obtuvo de un canal para cada condición de corte. d) textura entropía de PA01-EGFP usando valores de tensión de esquileo de 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2. Se obtuvieron datos de un canal para cada condición de esquileo (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura 4 b es consistente con los resultados que se muestra en la figura 4un. La acumulación de biofilm (N[rel]) se midió en base a la suposición de que la señal de la GFP en un punto en una imagen es proporcional a la densidad de células vivas en esa posición. Demuestra que la acumulación de biofilm de medición relativa total aumentó en función del tiempo utilizando 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2 durante 24 h período de tiempo, y la tasa de crecimiento disminuyó de más alta tensión de esquileo a menor tensión de esquileo. Hay un período de tiempo claro que un crecimiento exponencial de la que puede calcularse una tasa de crecimiento cuantitativo.
Figura 4 c se muestra el coeficiente de rugosidad (Ra) en los flujos del esquileo de 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2. Rugosidad de la superficie, cuantificada por el coeficiente de rugosidad, mide la variación en el perfil del grueso de la película. La definición formal es
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
donde T es la -ésima medición de espesores, Tun es el espesor medio, y N es el número de espesor medida30. El procedimiento descrito en esta investigación mide el espesor asociado con células vivas. Un arreglo plano de células produce un coeficiente de rugosidad de cero mientras que variaciones de espesor de la media dará como resultado un coeficiente de rugosidad mayor que uno. Similar a la influencia de la corte en la tasa de crecimiento y la cobertura de umbral por ciento de la película, los biofilms exhiben diferentes topografías en el tiempo. En general, Runa disminución en el tiempo para todas las condiciones de corte que indica que todas las superficies se hizo más suaves. Sin embargo, en comparación con el corte más bajo de 0,2 Dina/cm, la configuración de corte mayor de 0,5 y 1,0 Dina/cm2 dio lugar a una superficie más suave con el tiempo que indica que un rápido flujo de cizalla contribuyó a la superficie más suave y más uniforme y la más alta corte de 1,0 Dina/cm2 alcanzando por debajo de 0,2 Runa.
La finura, regularidad o aspereza de una superficie puede expresarse también en entropía textural (TE). TE es una propiedad utilizada en análisis de imágenes para medir el grado de aleatoriedad en una imagen bidimensional. Su cálculo se basa en la matriz de co-ocurrencia nivel gris, definido por Haralick et al., que analiza si los valores de píxeles en un lugar se correlacionan con los valores de píxeles a otra ubicación44. Un alto grado de correlación llevará a entropía baja. Figura 4 d representa el TE en los flujos del esquileo de 0,2, 0,5 y 1,0 Dina/cm2. El TE aumentó con el tiempo para todas las condiciones de corte, pero la tensión de esquileo máxima 1,0 dyne/cm alcanzada la máxima TE (1.0) antes que las tensiones de esquileo baja en 900 min. La corte menor de 0,2 Dina/cm2 tuvo la TE menor (0,8) llegando a su máximo después de 1.000 minutos. Sin embargo, la tensión de esquileo intermediaria de 0,5 Dina/cm2 alcanzó su máximo TE (1.2) mucho más tarde que las condiciones de alta o baja tensión de esquileo.
El coeficiente de rugosidad y TE miden distintas características. Mientras que una película plana tendría un coeficiente de rugosidad bajo y baja entropía, una película con una variación significativa en el espesor tendría un coeficiente de rugosidad alta pero todavía podría ser baja entropía si la variación es sinusoidal en lugar de al azar. En este caso, Run disminuyó con el aumento de esfuerzo cortante y momento mientras que las tendencias TE no pueden estar directamente relacionado con esquileo tensión aplicada a la formación de biofilm en el tiempo.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figura S1 : Captura de las ventanas de software de control de la imagen. Ventana con menú Multi Dimensional adquisición del software abierto (parte superior). Módulo de control para un archivo de AutoRun (abajo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figura S2 Captura del software de revisión de datos de la imagen. Ventana de la aplicación después de seleccionar el conjunto de datos de interés utilizando la herramienta De datos de múltiples dimensiones en el menú de Herramientas de análisis . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Aquí, describimos el uso de un biorreactor de microfluidos un mayor rendimiento juntado con un microscopio de fluorescencia para el análisis de los efectos de la tensión de esquileo de aeruginosa de los Pseudomonas biofilms expresando proteínas fluorescentes verdes, como instrumento establecido, la determinación de la cobertura de biofilm, tasa de crecimiento y características morfológicas.

Análisis de la célula de tensión de esquileo en vivo en Pseudomonas aeruginosa mediante un sistema de microfluidos superior rendimiento automatizado

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave, sobre el desarrollo de biopelículas, como cómo identificar condiciones ambientales clave, que afectan el crecimiento de biopelículas y las características de comportamiento durante el desarrollo. La principal ventaja de esta técnica, es que las placas micro-fluidas multicanal, permiten la rápida adquisición de resultados estadísticamente significativos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura del biofilm, también se puede aplicar al estudio de tratamientos antibióticos y biorremediación.Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque se necesita una atención cuidadosa a los detalles del protocolo y las habilidades meticulosas. Para evitar un error de conexión del instrumento al software, encienda primero la estación de trabajo del PC, seguida del módulo de fluorescencia. Asegúrese de que el obturador de fluorescencia esté encendido y encienda los controladores de hardware.A continuación, encienda el controlador del sistema de imágenes y la cámara CCD. A continuación, encienda la estación de imágenes. Cuando todo el equipo esté listo, inicie la aplicación de control e introduzca el número de placa, situado en la etiqueta en el lado de la placa.Para el cebado, primero retire la placa micro-fluida de 48 pozos del embalaje, sin tocar la superficie de vidrio en la parte inferior de la placa, y limpie el portaobjetos de vidrio en la parte inferior de la placa, con un tejido de lente. Para preparar los canales micro-fluidos, pipetear 200 microlitros de 37 grados celsius mínimo medio en el pozo de salida, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, coloque la placa en la etapa de la placa.Limpie la interfaz con etanol, sellándola en la etapa de la placa una vez que el etanol se haya secado. En el modo manual en el módulo de control, ajuste el fluido como caldo Luria-Bertani en 37 grados centígrados, y máximo como cinco dym por centímetro cuadrado. Haga clic en los pozos de salida para activar el flujo de la salida al pozo de entrada, para preparar los canales.Después de cinco minutos, detenga el flujo para prepararse para la siembra y retire cuidadosamente la placa del escenario. A continuación, aspirar cualquier medio residual de la salida bien sin eliminar ningún medio del círculo interno que conduce a los canales micro-fluidos. Para sembrar los canales experimentales, añadir 300 microlitros de medio mínimo en el pozo de entrada, seguido de la adición de 300 microlitros de cultivo bacteriano, en el pozo de salida.Vuelva a colocar la placa en la fase de imagen asegurándose de limpiar la interfaz con etanol antes de colocarla en la placa, y utilice la alimentación de la cámara en vivo para centrarse en un solo canal. Mientras monitorea visualmente la alimentación en vivo, reanude el flujo en 1 a 2 dym por centímetro cuadrado durante aproximadamente 2 a 4 segundos, Para permitir que las células entren en el canal experimental pero no en los canales de serpentina, y deje la placa en la etapa controlada por temperatura durante una hora, para permitir que las células se adhieran. Al final del período de fijación, retire cuidadosamente la placa de la etapa y aspire las bacterias de la salida bien sin alterar el canal.A continuación, utilice una nueva punta de pipeta para quitar el medio de los pozos de entrada. En el software, abra la adquisición de múltiples dimensiones para controlar la adquisición de imágenes del microscopio y seleccione lapso de tiempo, varias posiciones de etapa y varias longitudes de onda. En la pestaña Guardar, cree un nombre base simple, asegurándose de que el nombre base de la bandeja si existe el archivo está activado.Incluya los detalles esenciales del experimento en la descripción. Haga clic en Seleccionar directorio, para seleccionar la carpeta en la que se guardarán todos los archivos en la pestaña time lapse, ajuste la duración del tiempo experimental a 24 horas y establezca el intervalo de tiempo para adquirir imágenes cada cinco minutos a lo largo del experimento. Utilice la alimentación de la cámara en vivo y el objetivo 10x para establecer las posiciones del escenario, centrándose en el centro del canal, situado por encima o por debajo de los números de canal grabados en la placa.Cambie al objetivo 20x y localice el área de visualización óptima y el plano focal dentro del canal. A continuación, agregue la posición de la etapa a la lista con la nueva configuración. Bajo el menú de longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en 3, y establezca la primera longitud de onda en FITC 100%camera, con un tiempo de exposición de diez milisegundos, la segunda longitud de onda en brightfield 50%camera 50%visible, con un tiempo de exposición mínimo de 3 milisegundos y la tercera longitud de onda a todos cerrados, por lo que no queda luz en el último canal entre los tiempos de adquisición.En el menú de edición de AutoRun, abra la pestaña de configuración del protocolo y establezca un nuevo protocolo con una duración de 24 horas con el flujo establecido en la dirección de avance a la velocidad de cizallamiento experimental adecuada. Haga clic en Agregar y guardar como para guardar el protocolo y abrir la pestaña de configuración de secuencia. Para configurar una nueva secuencia, seleccione caldo Luria-Bertani a 37 grados, como fluido predeterminado para todos los canales.En la iteración de paso 1 para los canales 1 a 12, seleccione el protocolo con la primera velocidad de cizallamiento experimental y habilite todos los canales. Para los canales 13 a 24, seleccione el protocolo con la segunda velocidad de cizallamiento experimental y habilite todos los canales. A continuación, seleccione Aplicar y guardar como para guardar la secuencia y abra el menú Ejecución automática para seleccionar la secuencia guardada que se utilizará para la ejecución automática.Para configurar el experimento de biopelícula de crecimiento cronometilado, agregue hasta 1300 microlitros de medio mínimo estéril en el pozo de entrada de la placa micro-fluida, y devuelva la placa a la etapa de imagen. A continuación, limpie la interfaz con etanol y selle la placa. Confirme que los protocolos y secuencias están configurados correctamente.Seleccione inicio, para iniciar AutoRun, y haga clic inmediatamente en adquirir para iniciar la colección de imágenes del microscopio. Al final de la primera adquisición de imagen, haga clic en pausar y seleccione el modo de imagen en vivo en la longitud de onda de campo brillante. Seleccione ir a para ver cada posición de etapa y seleccione establecer en actual, para establecer los nuevos ajustes.A continuación, haga clic en reanudar, antes de comenzar la siguiente adquisición programada. En este experimento representativo de crecimiento de biopelícula cronometrando, la cobertura de biopelículas, o el porcentaje de superficie de umbral, fue diferente para los tres ajustes de cizallamiento, lo que indica que la cizalladura tuvo una influencia directa en la cobertura de la superficie del biofilm. La medición relativa total de la acumulación de biopelícula, aumentó en función del tiempo, con la tasa de crecimiento disminuyendo de la tensión de cizallamiento más alta a la tensión de cizallamiento más baja.En cada condición, también hubo un período claro de crecimiento exponencial a partir del cual se podía calcular una tasa de crecimiento cuantitativo. En general, el coeficiente de rugosidad disminuyó con el tiempo en todas las condiciones de cizallamiento, lo que indica que todas las superficies de biopelícula se volvieron más suaves. Sin embargo, en comparación con la cizalladura más baja, los ajustes de cizallamiento más altos resultaron en una superficie más suave con el tiempo, lo que indica que un flujo de cizallamiento más rápido contribuye a una superficie más suave y más uniforme.Además, la entropía textural, o la aleatoriedad en la morfología, aumentó con el tiempo para todas las condiciones de cizallamiento. Al realizar este procedimiento es importante recordar seguir la secuencia especificada y tomarse el tiempo para realizar cada paso con precisión. Las habilidades necesarias pueden tomar algunas carreras para dominar.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como HBLC o GCMS, para responder preguntas adicionales sobre las concentraciones de sustratos, como la glucosa, que se consume. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las biopelículas exploraran entornos de flujo general en tiempo real con condiciones experimentales controladas y muestreo de hidroterapia. No olvide que trabajar con cepas bacterianas BSL2 puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipos de protección adecuados y el uso de protocolos de residuos adecuados durante la realización de este procedimiento.

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