Name: live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system
Uploaded: 2019-01-16T14:15:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Detta arbete har gjorts möjlig genom bidrag från nationella institutet för allmän medicinsk vetenskap (NIGMS) (5P20GM103427), en komponent av National Institutes of Health (NIH)

1. Media förberedelse
<ol><li>Förbered minimal (MM) med 0,25% glukos. För att göra 1 L mm med 0,25% glukos, tillsätt 200 mL steril M9 saltlösning, 2 mL steril 1 M MgSO4, 100 µL sterilt 1 M CaCl2och 12,5 mL steril 20% (w/v) glukoslösning till en slutlig volym av 1 L. vatten (dH2O)</li>
	<li>Överföra önskade media till en steril flaska med steril teknik. Förbered det belopp som krävs beroende på antalet kanaler används. Vanligtvis kräver varje kanal 200 µL för grundning, 300 µL för sådd och 1300 µL för 24 h experimentet.</li>
	<li>Placera flaskan i en inkubator eller vattenbad inställd på experimentell temperatur. Media bör vid experiment temperatur innan användning för att undvika bubblor bildas i mikrokanaler.</li>
</ol>2. beredning av en övernattning och experimentell kultur av PA01-andra.
<ol><li>Häll 15 mL experimentella medier i en steril sidearm kolv och Inokulera med en eller två kolonier från en agarplatta med PA01-andra inslag. Expandera kulturen för 12-16 h på en inkubator/skakbord vid 37 ° C och 180-220 rpm.</li>
	<li>Mäta den OD600 övernattande kultur. När OD600 är större än 0,80, späd övernattning kulturen till den slutliga OD 0.8 använder färska MM. Placera den experimentella kulturen i en inkubator eller vattenbad vid 37 ° C tills den behövs för sådd mikroflödessystem kanalerna. Kontrollera den OD600 igen omedelbart före sådd för att säkerställa att det inte har ändrats betydligt från målet OD600, 0,8 i det här fallet.</li>
</ol>3. utrustning start
<ol><li>Ställa in systemet stationen enligt användarhandboken, liknande till setup i figur 1. För att undvika ett fel i anslutningen av instrumentet till programvaran, slå på instrumentet i följande ordning: PC-arbetsstation Fluorescens-modul. Kontrollera fluorescens slutaren är på (blått ljus av avtryckaren på) Hårdvara-styrenheter Tänkbar system Controller (se Tabell för material) CCD-kamera Imaging Station (Mikroskop) Obs: Temperaturen i den uppvärmda plattan bör justeras till önskad experimentella temperatur.</li>
	<li>Starta programmet kontroll och ange det registreringsnummer som finns på etiketten på sidan av plattan. Obs: När kontroll ansökan börjar finns det två separat programfönster, en för det program som styr den Mikroskop/imaging-programvaran och en för modulen som styr pumpen och gränssnittet väl-plattan. Detta visas i Figur S1, där ”Multi Dimensional förvärv” menyn är öppen på toppen och modulen är inställd för en autorun på botten.</li>
</ol>4. Primning och seedning mikroflödessystem plattan
Obs: Den priming, sådd, bakteriell fastsättning och tillväxten illustreras i figur 3.
<ol><li>Avlägsna 48-väl mikroflödessystem plattan från förpackningen se till att inte röra glasytan på botten av plattan. Ren glasskiva längst ned i plattan väl med en lins vävnad, en luddfri trasa eller en låg-lint torka.</li>
	<li>För att prime mikroflödessystem kanalerna, Pipettera 200 µL 37 ° C MM i produktionen väl, vara noga med att undvika bubblor. Placera plattan i plattan scenen och torka gränssnittet med etanol, så att torka, innan fjättrar det plattan scenen.</li>
	<li>I Manuellt läge på styrenheten, in vätska som LB vid 37 ° C och Max skjuvning på 5.00 dyn/cm2. Klicka på utdata brunnarna för att aktivera flödet från utdata till ingången, priming kanalerna. Efter 5 min grundning, pausa flödet till förbereda för sådd. Försiktigt bort plattan från scenen och Pipettera kvarstående media från utdata men inte ta bort någon av media från den inre cirkeln som leder till mikroflödessystem kanaler.</li>
	<li>För att frö de experimentella kanalerna, först Pipettera 300 µL av MM i ingång väl följt av pipettering 300 µL av den bakteriella kulturen i utdata långt in produktionen väl. Placera plattan tillbaka i plattan scenen se till att torka gränssnittet innan du placerar den på plattan.</li>
	<li>På styrenheten, fokusera på en enda kanal med hjälp av live kamera foder efter att placera plattan scenen på Mikroskop scenen. Samtidigt visuellt övervakning av levande foder, återuppta flöde på 1,00-2,00 dyn/cm2 för cirka 2-4 s tillåta celler för att ange den experimentella kanalen men inte i de slingrande kanalerna. Låt plattan på kontrollerad temperatur scenen för 1 h för cell fastsättning. Under 1 h ruvning, kan programvaran kontrollmodul och Montage inrättas för autorun (steg 5). Obs: Mängden tid som behövs för sådd varierar med media och organismen, så det bör övervakas noga av levande foder tills optimerad och används som en allmän tidsram. Sådd i hela plattan kan variera vilket skulle kräva mer tid av tillämpad flöde till vissa kolumner av kanaler för komplett sådd.</li>
	<li>Efter fastsättning, försiktigt avlägsna plattan från scenen och Pipettera bakterierna från utdata först undvika störande kanalen. Med en ny pipettspetsen, ta bort materialet från ingående brunnarna.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig3.jpg"> Figur 3 : Experimentell översikt över priming, sådd och fastsättning av PA01-andra kanaler på mikroflödessystem. Den priming, sådd och bilaga skisseras. Det första steget av priming kräver färska media introducerade till utdata. De sådd innebär lika volymer av media och bakteriella kulturen i indata och utdata brunnar, respektive. Kulturen bör inte passera segmentet visning av experimentell kanalen (röda linjen) att undvika igensättning serpentin kanalerna. Efter inkubationstiden är över, flödar färska media kontinuerligt från input, till avdelningen som visning och till vägguttaget. Detta initierar en fastsättning och tillväxt av den bakteriell biofilmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
5. Installera programvaran
<ol><li>Öppna ”Flera dimensionell förvärv” för att styra Mikroskop bild förvärv i programvaran. Under menyn ”Main”, Välj ”Timelapse”, ”Flera scenen positioner” och ”Flera våglängder” (Figur S1A).<ol>
<li>Ställa in sparar inställningarna, skapa en enkel Basnamn, att göra till att öka bas namn om filen finns är markerad. Klicka på Välj katalog Markera den mapp där alla filer kommer att sparas. Innehåller väsentliga uppgifter om experimentet i Beskrivning.</li>
		<li>Under fliken Timelapse , justera varaktighet av experimentella tiden till 24 h. För att kontrollera hur ofta bilder förvärvas, anger Tidsintervall så bilder förvärvas varje 5 min i hela experimentet. De Nummer av tidpunkter justerar automatiskt med de inställda parametrarna.</li>
		<li>Ställ in scenen positioner med hjälp av live kamera feed i mikroskopet ljusa fält, vilket möjliggör korrekt placering och fokus. Börjar med 10 X målet, fokus på mitten av kanalen, ligger ovanför eller nedanför kanalnummer ingraverat på plattan. Växla till syftet för 20 X, att hitta den optimala visningsfältet och fokalplan inom kanal. Lägga till positionen i listan eller ersätta förinställd kanal ställning med de nya inställningarna.</li>
		<li>Under menyn våglängder , ange antal våglängder till 3. För våglängden 1 (W1), Välj FITC 100% CAM med 10 ms exponeringstid. För våglängden 2 (W2), väljer du Brightfield 50% CAM 50% VIS med en minimal exponeringstid på 3 ms. för våglängden 3 (W3), som Alla stängda filtret så inget ljus förblir på den senaste kanalen mellan gånger förvärv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När du konfigurerar modulen ska du kontrollera att den manuella kör har stoppats.<ol>
<li>I menyn Redigera Autorun under fliken Protokoll Setup , ange ett nytt protokoll för 24 h varaktighet tid, flyter i riktning framåt i önskad skjuvning takt. Shear rate är varierat för att studera effekten av biofilm tillväxt med shear rate. Klicka på Lägg till och Spara som protokoll.</li>
		<li>Skapa en ny sekvens under fliken Sekvens inställningar genom att välja LB@37degrees som standard vätska för alla kanaler. Under Steg Iteration 1, för kanalerna 1-12, Välj protokollet med önskad shear rate och Aktivera alla kanaler. För kanaler 13-24, Välj protokollet med andra önskad shear rate och Aktivera alla kanaler. Välj Verkställ och Spara som sekvens.</li>
		<li>Från Autorun -menyn, Välj sparade sekvensen som ska användas för autorun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. tidsbestämda Biofilm tillväxt Experiment Setup
<ol><li>Pipettera högst 1 300 µL sterilt mm i ingång väl mikroflödessystem plattan. Placera plattan tillbaka på plattan scenen och torka gränssnittet med etanol, vilket gör att etanol torka helt, innan den Tätplåt.</li>
	<li>Placera plattan stage på Mikroskop scenen, och vara säker på att den ett eller flera protokoll och sekvens är korrekt konfigurerade. Välj Starta starta autorun följde snabbt genom att klicka på Skaffa starta samlingen Mikroskop bild.</li>
	<li>Justera fokus och placeringen av alla skede positioner mellan bilden har. Välj paus och använda live-avbilden läget i ljusa fält våglängden, Välj Gå till Visa varje skede positioner. Ange nya inställningar genom att välja inställd på aktuellt. Klicka på återuppta före nästa schemalagda förvärv.</li>
</ol>7. granska och analysera bildsekvenser efter tidsinställda Biofilm tillväxt experimentet
<ol><li>Om du vill granska varje kanal efter 24 h autorun, i programvaran, öppna Granska flerdimensionella Data, ligger under Analysverktyg. Klicka på Välj bas Arkiv | Välj katalog navigera till mappen med bildsekvenser för experiment av intresse. I listan över datauppsättningar i den mapp som visas, Välj huvudnamnet för data av intresse.</li>
	<li>När data av intresse är vald, klicka på Visa om du vill granska informationen. Välj en våglängd att granska data under våglängd fönster (Figur S2).</li>
	<li>Recension den bildsekvens för varje kanal genom att välja kanalnummer under Scenen Position och använda videokontrollerna för att analysera data för 289 tiden pekar (förutsatt att bilder erhålls varje 5 min över en 24 h tid ram). Ta del av användbara tillväxtdata. Obs: I varje kanal, se för utvecklingen av luftbubblor och träskor som kommer att störa biofilm tillväxten inom kanalen, som påverkar data. Men om dessa förekomma senare i kör, data innan dessa omständigheter återfinns användbar.</li>
	<li>Granska och välj önskade data för analys, skapa högar av bilderna för varje kanal. Under Arkiv -menyn väljer du Öppna särskilda | Bygga skorsten | Numrerade namn. I fönstret Bygga Stack , Välj knappen Välj första bilden sedan den första bilden för stacken i mappen fil. Välj knappen Välj sista bild och välj sedan den fil som motsvarar till den sista bilden i stacken. Klicka på OK att öppna stacken med alla bilder av kanalen i kronologisk ordning. Stackar kan sparas under menyn Arkiv , Spara som tiff-filer. Obs: Skapa inte travar med tummen bilderna. Dessa filer är inte mycket användbara och kan tas bort för att spara utrymme på hårddisken. Även sparas bildfiler som följande: BAS NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #. 07062018_W1FITC 100_s12_t112 är exempelvis för kanal 12, tidpunkt 112, bild i första våglängd-FITC 100% Kameradata med huvudnamnet ”07062018”.</li>
	<li>Slutligen, Välj Spara som från nedrullningsbara filmenyn Spara sekvensen som en tiff-stack . Stackar kan också vara överlagrat och sparas som en film. Detta behandlas i steg 9.</li>
	<li>Innan kvantifiera den % yttäckning, kalibrera bilden avstånden. Klicka på Kalibrera avståndunder Analysverktyg. Välj lämplig kalibrering mätningen och klicka på Använd på alla öppna bilder.</li>
	<li>Medan stacken är på den första bilden i sekvensen, klicka på knappen tröskel . Använda Auto tröskelvärde för ljus objekt att tröskeln för fluorescerande signal (FITC våglängd) och Auto tröskeln för mörka objekt tröskel i ljusa fält. Justera tröskeln till täckningen som representerar täckningen av bilden.<ol>
<li>Fluorescerande tröskelvärden, utnyttja en kanal med icke-fluorescerande celler att upprätta någon bakgrund signal och uppsättning minsta tröskelvärdet att utesluta signal detekteras i kanaler som innehåller dessa icke-fluorescerande celler att säkerställa signal mätningen gör inte överskatta området av fluorescens. Detta kan vara olika från kör och kör så det är en bra idé att använda minst en, om inte mer, kanallåsspakarna för icke-fluorescerande kontroller.</li>
		<li>Ljusa fält tröskelvärden, om alla celler inte omfattas av orange tröskel signaturen, justera högsta tröskelvärdet antingen via verktygsfältet skjutbara eller använda den Tröskel bild (hittas under Analysverktyg) så att alla celler är omfattas, men någon bakgrund är uteslutet. Obs: Medan dessa tröskelvärden idealiskt skulle användas för alla bilder i en stack och för alla kanaler, tröskelvärden som valts för en bild/kanal kanske inte är lämpliga för andra bilder eller kanaler, därför användaren kan behöva justera tröskel mätområdet med jämna mellanrum. Av denna anledning är det en bra idé att spela alltid in högst och lägsta tröskelvärden som används bör data behöver ses över senare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicka på Visa Region statistikför att kvantifiera täckningen, under Analysverktyg. Kontrollera att Använd tröskelvärde kontrolleras, Hela bilden är markerad och kontrollera önskade mätningar/inställningar är markerad under Erhållna Data, (tröskelområdet, medelvärde, standardavvikelse, min, max och % tröskel område). Klicka på Öppna logg och kontrollera DDE-fil är markerad innan du klickar på OK. Välj Microsoft Excel och klicka på OK. I kalkylbladet som öppnas, klicka på Loggdata för att automatiskt registrera mätningar av bilden analyseras.</li>
	<li>Lämnar detta kalkylblad öppet, att använda samma ark för att samla alla bilddata analys för en enda stack. I högen, gå till den fjärde bilden och tröskel till de optimala inställningarna. Klicka på Loggdata på skärmen Visa Region statistik och loggas värdena i kalkylbladet. Upprepa detta för analys av bilder varje 15 min.</li>
</ol>8. andra analys inklusive morfologi och yta täckning åtgärd använder Python skript från Biofilm morfologi Suite
<ol><li>Installera en fördelning av Python 3.6 som innehåller vetenskapliga standardmoduler med hjälp av en standard vetenskapliga Python distribution såsom Anaconda, tillgänglig på https://www.anaconda.com/download.</li>
	<li>Erhålla Biofilm morfologi sviten från GitHub i en webbläsare genom att navigera till https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, Välj klon eller ladda ner (grön knapp) och välj Hämta Zip. Packa upp filen och flytta mapparna koden till en arbetskatalog.</li>
	<li>Mäta procent thresholded täckning genom att kopiera en bildstapel till mappen ”täckning”. Använda ett terminalfönster för att navigera till mappen och sedan köra skriptet med kommandot python bfCoverage.py tiffStackName.tif från kommandoraden gränssnittet, där tiffStackName.tif är namnet på den fil som innehåller tiff stacken bilder. En textfil som innehåller täckning mätningarna vid varje tidpunkt kommer att skapas med det namn tiffStackName.txt och en bildfil med en tomt på täckning som funktion av tiden kommer att skapas med namnet tiffStackName.png.
</li>
	<li>Använd samma förfarande anges i steg 8,3 för att mäta övriga morfologiska egenskaper: biofilm ackumulering, koefficient för strävhet och textural entropi. Använd skriptet bfAcc.py för ackumulering mätning, skriptet roughCoef.py för ojämnheter koefficient mätning och skriptet TEvsTime.py för textural entropi mätning.</li>
</ol>9. andra program - att göra överlägg och filmer
<ol><li>Om flera våglängder används, skapa överlägg högar inklusive dessa våglängder. Öppna alla staplar av intresse och kalibrerar distansen som gjort steg 7,6.<ol>
<li>Välj Overlay bilderunder Analysverktyg. Ange källorna som högarna med intresse. I FITC högen, klicka på rainbow cirkeln och välj gröna färg filter som ska läggas till för att belysa denna våglängd.</li>
		<li>Använda bal justera överlägget så att FITC stacken framgår i bilderna. Efter alla justeringar har gjorts, Välj Alla plan för båda stackar och klicka på Verkställ. Spara överlägg på samma sätt som stackar som beskrivs i steg 7,5 eller som en film som beskrivs i steg 9,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om du vill spara stackar eller överlägg som en timelapse-film, under MM Standard och Stack, klicka på Skapa film. Välj källan som stack eller överlägg som önskas. Klicka på Spara och Spara som en Microsoft Video 1 med en kvalitet som ligger mellan 70-80.</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

Förfarandet mikroflödessystem system och bild analys diskuteras här fokuserar på genomförandet av mikrofabricerade biofilm experiment att bestämma morfologiska egenskaper som inte kräver full tredimensionell information normalt återfinns från confocal mikroskopet studier. Dessa inkluderade microcolony underskikt täckning (procent täckning), ytans strävhet mäts av koefficient för strävhet och textural entropi. En metod för att uppskatta totala relativa biofilm cell ackumulering presenteras också som tillväxttakten i loggen fas kan beräknas.
I området i närheten finns det flera små men viktiga steg som bör belysas i denna metod. Torka av gränssnittet med alkohol hjälper till att undvika kontaminering av andra bakterier i kommer från experiment till experiment, men också från brunn till brunn i ett experiment. Grundning och sådd är också mycket viktigt eftersom priming tillåter användaren att avgöra vilka kanaler tillåter media att flöda genom kanaler utan några störningar eller igensättning. Kanaler bör heller inte vara störd (dvs. de bör vara ständigt full av media) efter grundning för att öka chanserna för ett lyckat experiment med inga luftbubblor eller igensättning. Det sådd steget kan varieras enligt typen av bakterier och så bör optimeras för cell fastsättning. Till exempel om celler inte verkar bifoga, kan ytmodifieringar uppstå på mikroflödessystem plattan före sådd eller längre inkubationer gånger kan behövas. Det är också viktigt att kontrollera att mikroskopet är korrekt inställd en bilden är i fokus och ska övervakas regelbundet under hela försöket att säkerställa att kvalitetsbilder erhålls. Om fokus är avstängd, mikroskopet kan och bör justeras eftersom experimentet fortsätter. Under bild förvärv, ska sista våglängden anges till Alla stängda för att undvika exponering av filter och belysning till endast en kanal under väntetiden som uppstår mellan bild förvärv. Också, den bildanalys som bestämmer den % yttäckning ritades i huset eftersom Montage programvara manualen inte uttryckligen beskrev förfarandet. Dessutom för att expandera på bildanalys och bestämmer andra egenskaper såsom ytjämnhet etc., öppen källa Python-baserad kod45 utvecklades i huset och delade på databasen gitHub. Det finns också begränsningar på hur mycket data kan lagras och hanteras på den lokala hårddisken, så behövs en extern hårddisk eller dela online data såsom CyVerse46.
Konventionella bioreaktorer, såsom CDC reaktorn och det dropp flöde reaktor34, kräver en hel del media, ger färre urvalsstorlekar och kräver en stor mängd sterilisering av utrustning. Däremot fördelarna med denna högre genomströmning plattform inkluderar möjligheten att kontroll skjuvning, flöden, och antagandet att in vitro experiment nära liknar i vivo villkor. Nackdelar med systemet inkluderar flera tillbehör och programvara som kräver en noggrann inställning som måste utföras i rätt ordning av händelser. Dessutom handboken som tillhandahålls för utrustningen fullt förklara inte varje steg av experiment och kommandona programvara, och följaktligen många misstag inträffa under experimenten, inklusive igensättning av kanaler, brist på tillväxt eller fastsättning, eller brist på högkvalitativa mikroskopi bilder eller filmer. Det instrumentet konsumtionsvaror såsom mikroflödessystem plattorna, och är också relativt dyr med en prislapp på över $200 per platta är inte återanvändbara. Således, medan tekniken lånar kraftfulla resultat, den tekniska expertis som krävs för dess användning är relativt hög och kräver upprepade utbildning av experter på området. Detta betänkande försöker att lösa problemet genom att tillhandahålla en guide för nya användare av dessa bioreaktorer för att studera biofilmer egenskaper.
Mikroflödessystem systemet, som är kompetent att utföra cellulära analyser, har fått stor uppmärksamhet för olika vetenskapliga metoder, såsom i mikrobiologi, immunologi, hematologi, onkologi och stamcellsforskning. Mer specifikt, har tekniken resulterat i många publikationer som beskriver ämnen som är mycket relevanta för medicinska tillämpningar37,47, inklusive mikrobiell muntliga vidhäftning48, att fastställa effekterna av biosurfactants på Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus49,50, värd patogen interaktioner i E. coli51, Streptococcus följsamhet52och behandling cystisk fibros53. Tanke på att detta mikroflödessystem system är mycket mångsidig, räknar man med att fler och fler system kommer att fördelas över hela världen.
Vissa specifika protokollstegen bör övervägas noggrant. Media kan spädas 50% med dH2O för att förhindra bubblor och igensättning men var inte krävs i detta fall. Det specifika värdet av OD600 används för sådd måste bestämmas med rättegång körningar av en tillväxt experiment för att se vad som fungerar bäst för en viss uppsättning villkor som används. Bubblor i brunnarna före tätning kan leda till bubblor i ultrakalla kanaler och bör avlägsnas genom antingen dök eller sugs ut med en pipettspetsen. Det är viktigt att hålla bakterier ur de små slingrande kanalerna. Genom att ha lika stora volymer av media i indata och utdata under sådd, kommer kassaflödet på grund av påtryckningar från den flytande volymen att kontrolleras så flödet beror endast på den tillämpade trycket från systemet. Kalibrering avstånden bör inrättas under installationen av en företagsrepresentant. Dessa inställningar är specifika för varje kamera.
I området i närheten finns det flera utmaningar som uppstår när att hitta den mest representativa tröskeln för en bild. Fastställa maximala gränsvärden kan vara svårt om den genomsnittliga pixel intensiteten över regioner i bakgrunden inte överensstämmer orsakats antingen genom att välja en scen ställning som inte är i mitten av kanalen eller från skräp på plattan. Under MM Standard, klicka på processenoch välj sedan bakgrunden och skuggning korrigering verktyg till korrigering för dessa inkonsekvenser. Detta verktyg är dock generellt bara användbar om användaren har tagit bilder av kanalerna innan sådd som de kan använda som referensbilder. Eller, om bakgrundsskuggning referens bilder är inte tillgänglig, måste användaren att använda sitt omdöme för att fastställa ett tröskelvärde som täcker de mest cellområde utan inklusive bakgrund för hela bilden. Alternativt kan du välja representativa områden att mäta som utesluter regioner av inkonsekvens genom att klicka på Rektangulärt område, Ellips Regioneller Spåra regionen att välja en region och välj Aktiva regionen i stället för att hela Bild på fönstret Visar statistik för regionen (under Analysverktyg). Om en representativ region utnyttjas för tröskelvärde bildens ljusa fält, samma region bör användas för mätning av motsvarande FITC bilden. Det är bra att spela in den specifika geografisk statistik (vänster, topp, Bredd, höjd, område, omkrets) är associerad med representanten regionen så samma region kommer att hittas och mätt på motsvarande FITC bilden.
För att förhindra en ansamling av data på hårddisken som kommer att orsaka datorn att sakta ner, kan en extern hårddisk köpas för datalagring. Ett annat alternativ för datalagring och underlätta datadelning är den CyVerse bioinformatik plattformen. Skapa ett konto på CyVerse systemet genom att gå till http://www.cyverse.org/. När du loggat in, starta Discovery miljö och välj sedan ”logga i CyVerse”. Välj ”Data” och navigera till du mappen. Om en bildstapel är på den lokala datorn väljer du ”Ladda upp” och sedan ”Enkelt ladda upp från skrivbordet”. Hitta stack bildfilen och välj för uppladdning. Fil eller mapp kan delas med medarbetare om de har ett CyVerse konto och behörighet. Delning av datamappen till allmänheten kräver att metadata läggas till för varje fil med CyVerse godkända standarder. Detta förfarande kommer inte att diskuteras här eftersom detta inte omfattas av detta arbete.

Här kommer vi att visa en metod att mäta effekten av shear stress på bildandet av fluorescerande Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 biofilmer använder ett automatiserat högre genomströmning mikroflödessystem system.
Biofilmer är samhällen av mikroorganismer, såsom bakterier, anordnas av ett extracellulära polymera ämne som är kopplade till ett stöd, och finns normalt på gränssnittet mellan en flytande och en fast yta1. Dessa biofilm samhällen kan vara fördelaktigt för miljön, som att förbättra vattenkvaliteten i vattenförsörjning linjer och bioremediering av terapiresistent föreningar2,3. Biofilmer kan dock också vara mycket skadliga för människors hälsa med oönskade följder. Medicintekniska produkter, såsom höft- och implantat, är exempelvis en typ av yta där biofilm ackumulering har varit en utmaning och orsakar allvarliga medicinska komplikationer4,5. Biofilmer kan också ange naturliga vattensystem, såsom floder och sjöar, och infiltrera vattenförsörjning rör leder till bakteriesmitta i dricksvatten vilket resulterar i infektioner6,7,8. Biofilmer bildas i marina miljöer följer fartyg och andra konstgjorda substrat och presentera ett större ekonomiska och miljömässiga problem som ökad friktion leder till öka bränsle förbrukning9,10. Antimikrobiella beläggningar, som tributyltenn, har utvecklats för att förhindra dessa problem men är giftigt för marina livet11.
P. aeruginosa är en gramnegativ bakterie med höga blomstrande funktioner i en mängd miljöfaktorer och nutrimental12. P. aeruginosa är en vanlig orsak till gemenskapen - och vårdrelaterade infektioner och fann att vara nära associerade skador, exempelvis svåra brännskador och immunsupprimerade värdar, såsom vid cystisk fibros (CF)5,12, 13, AIDS och cancer patienter5,13. Bildandet av P. aeruginosa biofilmer har varit mest allvarligt ansluten till CF, där kronisk lunginfektioner är den ledande dödsorsaken för denna sjukdom5.
En referensstam av P. aeruginosa, PA01, används i denna rapport och är genetiskt modifierad för att uttrycka en förbättrad grönt fluorescerande protein (PA-andra). ANDRA representerar en muterad form av GFP med större fluorescens egenskaper som möjliggör i situ biofilm analys med hjälp av fluorescence mikroskopi14,15,16. Denna typ av fluorescens analys är fördelaktiga för studien av biofilmer eftersom GFP inte stör betydligt cellernas tillväxt och funktion17. Till exempel växte Escherichia coli celler som var märkta med GFP väl och kontinuerligt utan att ha lidit några toxiska effekter i jämförelse med den kontroll bakterier17. Andra rapporter underbygga detta påstående18,19,20. Dessutom användningen av en fluorescerande reporter som andra är snabb och enkel, men ändå bara levande celler kommer att mätas eftersom döda celler snabbt upphöra att fluorescera21.
Biofilmer kan växa under olika miljöförhållanden inklusive dem med olika flöden. Exempelvis kan filmer växa i hög shear stress, såsom i floderna, där de höga vatten flödesförhållanden leda till en större mikrobiell mångfald22. I motsatts stående vatten i dammar eller oral biofilm uppleva en mycket lägre skjuvning kraft23. Utöver flöde, finns det andra faktorer som påverkar biofilm vidhäftning, inklusive ytjämnhet och vattenavvisande egenskaper, media sammansättning, och även bakteriella cell surface1,4,7, 24. villkor kan också orsaka variationer i rumslig struktur eller morfologi av en biofilm. Detta inkluderar miljöförhållanden som skjuvspänning som utövas av en rörlig vätska eller lutningar i näringsämnen tillgänglighet och biologiska faktorer såsom arterna som finns i systemet, motilitet av celler och de specifika proteinerna som finns i den extracellulära polymera ämne25,26,27. Under vissa förhållanden, biofilmen blir gräsmatta-liknande (slät och plan), medan andra villkor i biofilm kommer att vara grov, fluffiga, eller ens svamp-liknande28. Medan den kvalitativa skillnaden mellan biofilm gräsmattor och svamp strukturer kan ses tydligt i mikroskopiska bilder, kräver förstå sambandet mellan film struktur och biologiska processer inom filmen systematisk och kvantitativa metoder för att beskriva morfologi. Morfologiska egenskaper som föreslås för studie av forskare inkluderar porositet, fraktala dimensionen, tröghetsseparation längd, microcolony område på underlaget, microcolony volym, koefficient för strävhet och textural entropi29,30 .
Bioreaktorer används i studien av biofilmer för att efterlikna verkliga förhållanden31. DROPP flöde reaktorer (DFR) representerar en låg-skjuvning miljö där näringsämnen i media flödar långsamt över celler som knutna till en yta med tiden bildar en biofilm med hög cell densiteten32. CDC reaktorer är bioreaktorer som skapar en hög skjuvspänning flytande miljö genom kontroll av en omrörningsanordning stång som roterar kontinuerligt inom media fylld tank33. Dessa typer av bioreaktorer är enkel att konfigurera, men de är begränsade i omfång på grund av den relativt låga provstorleken, hög konsumtion av media, stora mängder biologiskt farligt avfall som produceras från media dropp flöden från 125 µL per minut för dropp flöde reaktorer till mer än 1 mL/min för CDC reaktorer, och behovet av att autoklav stora mängder glas och avfall media34. Biofilmer växer inte jämnt över ytan i ett dropp flöde reaktorn eftersom den låga skjuvning av media orsakar avslutande längs de största konglomerat av P. aeruginosa bakterier därför, biofilm tillväxten inte är mycket smidig och ojämn proverna kan inte vara enkelt analyseras med fluorescence mikroskopi35,36 .
Vissa gemensamma bioreaktor begränsningar är överbryggas med en medium-genomströmning mikroflödessystem bioreaktor, där endast milliliter av media som krävs, och reaktion plattorna är små och lätt disponibla efter autoklavering37. Dessutom, beroende på antalet brunnar, många replikeringar kan utföras i en reaktor köras, vilket ger tillräcklig mängd data att genomföra meningsfulla statistisk analys. I figur 1visas de olika komponenterna i systemets mikroflödessystem-mikroskopi som medger kontrollerade förhållanden, inklusive temperatur och flöde klassar38,39,40. Bioreaktor är tillsammans med fluorescensmikroskopi att visualisera fluorescensen av andra taggen i PA01 under tillämpas låg genom hög skjuvning förhållanden som kommer att efterlikna mer realistiska scenarier som påträffas i miljön eller i det biomedicinska fältet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig1.jpg"> Figur 1 : Enskilda komponenter i systemet simuleras. De enskilda komponenterna anges från vänster till höger: 1. CCD-kamera, 2. hög upplösning inverterade Mikroskop med automatiserad scenen, automatiserad fluorescens modul och autofokus modul, 3. plattan scenen, 4: Imaging system gränssnitt, 5: manuell Mikroskop scenen Kontroll, 6: Vapor fälla, 7: Imaging system Controller (inklusive temperatur Controller), 8: hårdvara Controllers, 9: fluorescens Controller, 10: Uninterruptible Power Supply, 11: extern hårddisk för bildlagring, 12: PC arbetsstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Ett utdrag av mikrofabricerade plattan visas i figur 2. De vanligaste plattorna består av 48 brunnar. Ett experiment kräver ett inlopp och ett utlopp brunnar, sammanlagt 2 borrningar. Detta möjliggör 24 samtidiga experiment som kan utföras med olika experimentella villkor, såsom bakteriestammar, antimikrobiella behandlingar och media varierade från kanal till kanal och kontrollerade skjuvning flöde för varje kolumn i sex kanaler. Experimentell temperaturen kontrolleras även med en temperaturinställning under hela plattan. Mikroflödessystem kanalerna visar att varje kanal har en serpentin region att tillhandahålla tillräcklig mottryck och kontrollerade skjuvning.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig2.jpg"> Figur 2: visualisering av mikrofabricerade kanaler och synglas. Två inlopp och utlopp brunnar med mikroflödessystem kanaler ansluter dem är markerade med röda och gröna färgämnen. Färgämnet synliggör en serpentin region för varje kanal vilket skapar tillräcklig mottryck och kontrollerade skjuvning under vätskeflöde. Varje visningskanal (inom den röda cirkeln) kan avbildas med önskad våglängder. Visas är ljusa fält (överst) och lysrör (nederst) mikroskopi bilder av en enda kanal med en PA01-andra biofilm med ett 20 X-objektiv. Skalstapeln = 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
En steg för steg guide tillhandahålls användarna av mikrofabricerade bioreaktorer som kopplas ihop med fluorescensmikroskopi att utföra roman biofilm experiment använder olika skjuvning miljöer. Denna metod möjliggör en utbyggnad av experiment med andra mikroorganismer förutom bakterier, till exempel svampar och alger, som har medicinska och miljörelaterade program41,42,43. Den detaljerade strategin beskriver hur du kultur PA01-andra, Inokulera ett 48-väl plattan och Ställ mikroflödessystem enhet och programvara, ställa in fluorescerande mikroskopet och demonstrera den programvara analysen för att få den biofilm täckning, tillväxttakt, och morfologiska egenskaper såsom ytjämnhet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:800px;" width="801">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Ammonium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9208-500G</td>
			<td style="width:304px;">Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000 48 Well Low Shear Plate</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>910-0047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging System</td>
			<td style="width:115px;">Fluxion Biosciences</td>
			<td>BF 1000Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride Dihydride, ACD Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose, Anhydrous, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>EM-MX0070-1</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Potassium Phosphate Monobasic, ACS Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>BDH9268-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Pseudomonas Aeurginosa GFP</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">15692GFP</td>
			<td style="width:304px;">Pseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sodium Chloride, ACS</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH9286-500G</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:263px;">Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent Grade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td>97061-942</td>
			<td>Part of the minimal media composition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell analysis of shear stress on pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system

Ett högre dataflöde mikroflödessystem in vitro- bioreaktor tillsammans med fluorescensmikroskopi har använts för att studera bakteriell biofilm tillväxt och morfologi, inklusive Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Här kommer vi att beskriva hur systemet kan användas för att studera tillväxten kinetik och morfologiska egenskaper såsom ytjämnhet och textural entropi av P. aeruginosa stam PA01 som uttrycker en förbättrad grönt fluorescerande protein (PA01-andra ). Ett detaljerat protokoll kommer att beskriva hur att växa och utsäde PA01-andra kulturer, hur man ställer upp Mikroskop och autorun, och genomföra den bild analysen för att fastställa tillväxttakt och morfologiska egenskaper med hjälp av en mängd skeva styrkor som styrs av den mikroflödessystem enhet. Denna artikel kommer att ge en detaljerad beskrivning av en teknik för att förbättra studien av PA01-andra biofilmer som så småningom kan tillämpas mot andra stammar av bakterier, svampar eller alger biofilmer använder mikroflödessystem plattformen.

Figur 4 en visar procent thresholded området över tiden från ett 24 h kör vid skjuvning flöden av 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2. Biofilm täckning eller procent tröskelvärde yta (C [%]) var annorlunda för alla tre skjuvning inställningar. Biofilm täckningen var snabbast på 1,0 dyn/cm2 skjuvning, där tröskelområdet ökade från 2-5% till 100% efter 200 min tillväxt och nådde en stationär fas efter 400 min. På 0,5 dyn/cm2, biofilm täckningen försenades och började öka på 400 min att nå 100% täckning efter 800 min. Den lägsta skjuvning vid 0.2 dyn/cm2 tydligt den långsammaste ökningen av biofilm täckning, där procentuella täckningen börjat öka på 500 min men aldrig nådde bortom tröskelvärdet för 65% området. Dessa resultat visade skjuvning hade ett direkt inflytande i biofilm yttäckning. Den högsta skjuvning tycktes vara en mer optimal förutsättning för biofilm tillväxt, möjligen på grund av att media som tillhandahålls bakterierna med mer näring så att biofilmen kan föröka snabbare.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58926/58926fig4.jpg"> Figur 4: procent tröskelområdet, totala biofilm ackumulering, koefficient för strävhet, och textural entropi. a) procent tröskelvärde område (C [%]) över tiden med 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2 över en 24 h tidsperiod. Data erhölls från en kanal för varje skeva villkor. (b) total biofilm ansamling (relativt mått) som en funktion av tiden med 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2 över en 24 h tidsperiod. De svarta linjerna är minstakvadratmetoden passar till en exponentiell modell. Data erhölls från en kanal för varje skeva villkor. (c) ojämnheter koefficient PA01-andra med skjuvspänningen värden av 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2 övervakas över 24 h. Data erhölls från en kanal för varje skeva villkor. (d) textural entropi PA01-andra använder skjuvspänningen värdena 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2. Data erhölls från en kanal för varje skeva villkor (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Figur 4 b är i överensstämmelse med resultaten visas i figur 4en. Biofilm ansamling (N[rel]) mättes baseras på antagandet att GFP signalen på en punkt i en bild är proportionell mot levande cell densiteten på den positionen. Det visar att totalt relativ mätning biofilm ackumulering ökat som en funktion av tiden med 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2 över en 24 h tidsperiod, och tillväxttakten minskade från högsta skjuvspänningen till lägsta skjuvspänning. I området i närheten finns det en tydlig tidsperiod ger exponentiell tillväxt som en kvantitativ tillväxt kan beräknas.
Figur 4 c visar den ojämnheter koefficienten (Ren) vid skjuvning flöden av 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2. Ytjämnhet, kvantifieras av koefficienten för strävhet, mäter variationen i tjocklek profilen av filmen. Den formella definitionen är
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926eq1.jpg">
där Tjag är den jag-th tjockleksmätning, Ten är den genomsnittliga tjockleken, och N är antalet tjocklek mätning30. Det förfarande som beskrivs i denna undersökning mäter tjockleken är associerad med levande celler. En platt arrangemang av celler kommer att ge en koefficient för strävhet noll medan betydande variationer i tjocklek från genomsnittet kommer att ge en koefficient för strävhet som är större än ett. Liknar den skjuvning påverkan på tillväxten och procent tröskelvärde täckningen av filmen, biofilmer uppvisade olika kretsmönster över tid. Sammantaget Rett minskat över tiden för alla skeva villkor som anger att alla ytor blev jämnare. I jämförelse med den lägsta skjuvning av 0.2 dyn/cm resulterade högre skjuvning inställningarna för 0,5 och 1,0 dyn/cm2 dock i en jämnare yta med tiden som anger att ett snabbare flöde i skjuvning bidragit till slätare och jämnare yta, och den högsta skjuvning av 1,0 dyn/cm2 nå nedanför 0,2 Ren.
Den jämnhet, korrekthet eller råhet av en yta kan också uttryckas i textural entropi (TE). TE är en fastighet som används i bildanalys för att mäta graden av slumpmässighet i en tvådimensionell bild. Beräkningen är baserad på matrisen grå nivå samtidig förekomst definieras av Haralick et al., som undersöker huruvida pixelvärden på en plats är korrelerade med pixelvärden på en annan plats44. En hög grad av korrelation kommer leda till låg entropi. Figur 4 d skildrar TE vid skjuvning flöden av 0,2, 0,5 och 1,0 dyn/cm2. VÄVNADSINRÄTTNINGEN ökat över tiden för alla skeva förhållanden men högsta skjuvspänningen vid 1.0 dyn/cm nått den maximala TE (1,0) tidigare än de lägre skjuvspänningar vid 900 min. Den lägsta skjuvning av 0.2 dyn/cm2 hade den lägsta TE (0,8) når sitt maximum efter 1000 min. Men nått mellanliggande skjuvspänningen 0,5 dyn/cm2 sin maximala TE (1,2) mycket senare än de höga eller låga skjuvspänning.
Den koefficient för strävhet och TE mäta olika funktioner. Samtidigt en platt film skulle ha en låg ojämnheter koefficient och låg entropi, en film med betydande variation i tjocklek skulle ha en hög ojämnheter koefficient men fortfarande kan vara låg entropi om variationen är sinusformad snarare än slumpmässiga. I detta fall Rett minskat med ökad skjuvspänning och tid medan TE trenderna inte kan vara direkt relaterade till shear stress tillämpas på biofilm bildning över tid.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS1.jpg"> Figur S1 : Image capture av kontroll programvara windows. Programvara öppnas med Multi Dimensional förvärv-menyn (överst). Modul för en AutoRun (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58926/58926figS2.jpg"> Figur S2 Image capture av programvaran för att granska data. Programfönstret när du har valt datauppsättningen sevärdheter med verktyget Granska Multi dimensionella Data från menyn Verktyg . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58926/58926figS2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System at JoVE.com

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Här, beskriver vi användningen av ett högre dataflöde mikroflödessystem bioreaktor tillsammans med ett fluorescerande Mikroskop för analys av shear stress effekter på Pseudomonas aeruginosa biofilmer uttrycker grön fluorescerande proteiner, inklusive instrument ställa in, bestämning av biofilm täckning, tillväxttakt och morfologiska egenskaper.

Levande Cell analys av Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa använder ett automatiserat System för högre genomströmning mikrofabricerade

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor, om biofilmutveckling, till exempel hur man identifierar viktiga miljöförhållanden, som påverkar biofilmtillväxt och beteendemässiga egenskaper under utveckling. Den största fördelen med denna teknik, är att de multi-channeled, mikro-fluidic plattor, möjliggör snabb anskaffning av statistiskt signifikanta resultat. Även om denna metod kan ge insikt i biofilm struktur, det kan också tillämpas på studier av antibiotikabehandlingar, och bioremediering.Generellt kommer individer nya till denna metod kamp, eftersom noggrann uppmärksamhet på detaljerna i protokollet och noggranna färdigheter, behövs. För att undvika ett fel på instrumentets anslutning till programvaran, slå på PC-arbetsstationen först, följt av fluorescensmodulen. Se till att fluorescensluckan är på, och slå på hårdvarustyrenheterna.Därefter slår du på bildsystemstyrenheten och CCD-kameran. Slå sedan på bildstationen. När all utrustning är klar, starta kontroll ansökan, och ange plattans nummer, som finns på etiketten på sidan av plattan.För priming, ta först bort 48 väl mikro-fluidic plattan från förpackningen, utan att vidröra glasytan längst ner på plattan, och rengör glaset skjut i plattan botten, med en lins vävnad. För att prime de mikro-fluidiska kanaler, pipetter 200 mikroliter av 37 grader celsius minimalt medium i utmatnings väl, var noga med att undvika bubblor. Placera sedan plattan på plattan scenen.Torka av gränssnittet med etanol, försegla det på plattan scenen när etanol har torkat. I manuellt läge på styrmodulen, ställ in vätskan som Luria-Bertani buljong på 37 grader celsius, och max ren som fem dym per kvadratcentimeter. Klicka på utgångs brunnarna för att aktivera flödet från utgången till ingången väl, att prime kanalerna.Efter fem minuter, pausa flödet för att förbereda för sådd, och försiktigt ta bort plattan från scenen. Därefter aspirera något restmedium från utmatningsstälten utan att avlägsna något medium från den inre cirkeln som leder till mikro-fluidiska kanalerna. För att så de experimentella kanalerna, tillsätt 300 mikroliter av minimalt medium i insatsen väl, följt av tillägg av 300 mikroliter av bakteriekultur, i produktionen väl.Återgå plattan till bildframställning skede se till att torka gränssnittet med etanol innan du placerar den på plattan, och använda den levande kameran foder för att fokusera på en enda kanal. Medan visuellt övervaka live-matning, återuppta flödet vid 1 till 2 dym per kvadratcentimeter i ungefär 2 till 4 sekunder, För att tillåta cellerna att komma in i den experimentella kanalen men inte serpentinkanalerna, och lämna plattan på temperaturkontrollerad etapp i en timme, för att tillåta cellerna att fästa. Vid slutet av fästperioden, försiktigt ta bort plattan från scenen och aspirera bakterierna från utmatningen väl utan att störa kanalen.Använd sedan en ny pipettspets för att ta bort mediet från ingångs brunnarna. I programvaran öppnar du flerfaldiga dimensionellt förvärv för att styra uppköpet av mikroskopet, och välj tidsförlopp, flera scenpositioner och flera våglängder. I fliken spara, skapa ett enkelt basnamn, se till att incroments basnamn om filen finns, kontrolleras.Inkludera eventuella väsentliga detaljer i experimentet i beskrivningen. Klicka på Välj katalog, för att välja den mapp som alla filer kommer att sparas Under fliken tidsförlopp, justera varaktigheten av försökstiden, till 24 timmar, och ställa in tidsintervallet för att skaffa bilder var femte minut under hela experimentet. Använd den levande kameramatningen och 10x-målsättningen för att ställa in scenpositionerna, med fokus på mitten av kanalen, som ligger ovanför eller under kanalnumren som är ingraverade på plattan.Byt till 20x-målsättningen och lokalisera det optimala visningsområdet och fokalplanet inom kanalen. Lägg sedan till scenens position i listan med de nya inställningarna. Under våglängdmenyn ställer du in antalet våglängder till 3, och ställer in den första våglängden på FITC 100%-kamera, med en tio millisekkunders exponeringstid, den andra våglängden till Brightfield 50%kamera 50%-syns, med en minimal exponeringstid på 3 millisekunder och den tredje våglängden till alla stängda, så inget ljus finns kvar på den sista kanalen mellan förvärvstiderna.Öppna fliken för autorun för redigera autorun och ange ett nytt protokoll med 24 timmars varaktighet med flödet inställt i framåtriktningen med lämplig experimentell skjuvhastighet. Klicka på Lägg till och spara som för att spara protokollet och öppna fliken för sekvensinställning. För att ställa in en ny sekvens väljer du Luria-Bertani-buljong vid 37 grader, som standardvätska för alla kanaler.Välj protokollet med den första experimentella skjuvningshastigheten och aktivera alla kanaler under steg iteration 1 för kanalerna 1 till 12. För kanalerna 13 till 24 väljer du protokollet med den andra experimentella skjuvhastigheten och aktiverar alla kanaler. Välj sedan Använd och Spara som, för att spara sekvensen och öppna AutoRun-menyn för att välja den sparade sekvens som ska användas för AutoRun.För att ställa in den tidsinställda tillväxt biofilm experiment, lägga till upp till 1300 mikroliter av sterila minimalt medium i ingången väl av mikro-fluidic plattan, och returnera plattan till avbildning skede. Torka sedan av gränssnittet med etanol, och försegla plattan. Bekräfta att protokollen och sekvenserna är korrekt inställda.Välj start, för att starta AutoRun, och omedelbart klicka på förvärva för att starta mikroskop bildsamling. I slutet av den första bildförvärvet klickar du på Paus och väljer livebildsläget i våglängden i Brightfield. Välj gå till för att visa varje etappposition, och välj inställd på aktuell, för att ställa in de nya inställningarna.Klicka sedan på återuppta, innan du påbörjar nästa schemalagda förvärv. I detta representativa tidsanerade biofilmtillväxtexperiment var biofilmtäckningen, eller procenttröskans yta, annorlunda för alla tre skjuvningsinställningarna, vilket indikerar att skjuvningen hade ett direkt inflytande på biofilmens yttäckning. Den totala relativa mätningen av biofilmansamlingen, ökade som funktion av tiden, med tillväxttakten som sjönk från den högsta skjuvningsstressen till den lägsta skjuvningsstressen.Under varje villkor fanns det också en tydlig period av exponentiell tillväxt från vilken en kvantitativ tillväxttakt kunde beräknas. Totalt sett minskade ojämnhetskoefficienten med tiden under alla skjuvningsförhållanden, vilket indikerar att alla biofilmytor blev jämnare. Jämfört med den lägsta skjuvningen resulterade dock de högre skjuvningsinställningarna i en jämnare yta över tiden, vilket indikerar att ett snabbare skjuvflöde bidrar till en jämnare och jämnare yta.Vidare ökade den texturala entropin, eller slumpmässigheten i morfologin, med tiden för alla skjuvningsförhållanden. Medan du utför den här proceduren är det viktigt att komma ihåg att följa den angivna sekvensen och att ta sig tid att utföra varje steg exakt. De bekövade färdigheterna kan ta några körningar för att bemästra.Efter denna procedur kan andra metoder som HBLC eller GCMS, utföras för att svara på ytterligare frågor om koncentrationerna av substraights, såsom glukos, som konsumeras. Efter sin utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom biofilmer att utforska allmänna flödesmiljöer i realtid med kontrollerade experimentella förhållanden och hydroterapiprovtagning. Glöm inte, att arbeta med BSL2 bakteriestammar kan vara extremt farligt, och att försiktighetsåtgärder såsom bär korrekt skyddsutrustning och använda lämpliga avfallsprotokoll bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Mikroflödesbaserade Electrotaxis för On-demand kvantitativ analys av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &quot;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter Bioreaktor för Microbial Encelliga Analys: Fabrication, Systeminställningar, och Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Med hjälp av en platta med flera brunnar mikroflödessystem

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Använda Lim Mönstring att konstruera 3D Paper Mikrofluidikanordningar

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Utforma mikroflödessystem enheter för att studera cellulära svaren Under Singel eller samexisterande Chemical / Elektrisk / Shear stresstimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Snabb Subtraktiv Mönstring av levande cellskikt med en mikroflödessystem Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatiserad bild Scanning och segmentering i Fluorescently-märkt vävnader Widefield High-innehåll analyssystem med

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En ultrahög kapacitet mikroflödessystem plattform för Single-cell Genomsekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...