Name: rapid collection of floral fragrance volatiles using a headspace volatile collection technique for gc-ms thermal desorption sampling
Uploaded: 2019-12-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling at JoVE.com

USDA-ARS Proyecto de Investigación número 6036-22000-028-00D. El uso de nombres comerciales, de empresas o corporaciones en esta publicación es para la información y conveniencia del lector. Dicho uso no constituye un respaldo o aprobación oficial por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos o del Servicio de Investigación Agrícola de ningún producto o servicio, con exclusión de otros que puedan ser adecuados. Además, el Departamento de Biología de la Universidad de Florida-Lewis y Varina Vaughn Fellowship en Orchid Biology (2017), y una Beca de Investigación de Posgrado de la Universidad de Florida (2014-2018) también proporcionaron fondos. También agradecemos a Cindy Bennington de la Universidad de Stetson por la planta de orquídeas utilizada durante el rodaje de este video.

NOTA: Los perfumes o lociones y productos perfumados no deben usarse durante ninguno de estos procedimientos.
1. Selección de flores
NOTA: Las flores utilizadas pueden ser de crecimiento natural en el medio ambiente o mantenerse bajo condiciones ambientales artificiales. La temperatura, la humedad y el nivel de luz durante la recolección pueden variar en función de las especies de flores específicas utilizadas y del tipo de datos que se recopilan. Por ejemplo, se ...

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	<li>Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+scents-+A+checklist+of+volatile+compounds+isolated+by+head-space+techniques.">Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques.</a> Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).</li><li>Dudareva, N. A., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of floral scent. , (2006).</li><li>Altenburger, R., Matile, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythms+of+fragrance+emission+in+flowers.">Rhythms of fragrance emission in flowers.</a> Planta. 174, 242-247 (1988).</li><li>Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+active+compounds+in+orchid+fragrances.">Biologically active compounds in orchid fragrances.</a> Science. 164, 1243-1249 (1969).</li><li>Theis, N., Raguso, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pollination+on+floral+fragrance+in+thistles.">The effect of pollination on floral fragrance in thistles.</a> Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).</li><li>Heath, R. R., Manukian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+systems+to+collect+volatile+semiochemicals+from+insects+and+plants+using+a+charcoal-infused+medium+for+air+purification.">Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification.</a> Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).</li><li>Cancino, A., Damon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+floral+fragrance+components+of+species+of+Encyclia+and+Prosthechea+(Orchidaceae)+from+Soconusco,+southeast+Mexico.">Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico.</a> Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).</li><li>Cancino, A., Damon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragrance+analysis+of+euglossine+bee+pollinated+orchids+from+Soconusco,+south-east+Mexico.">Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico.</a> Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).</li><li>Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragrance+composition+of+Dendrophylax+lindenii+(Orchidaceae)+using+a+novel+technique+applied+in+situ.">Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ.</a> European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).</li><li>Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+fragrance+analysis+of+Prosthechea+cochleata+(Orchidaceae),+an+endangered+native,+epiphytic+orchid,+in+Florida.">Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida.</a> Plant Signaling and Behavior. , (2018).</li><li>. National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce Available from: <a target="_blank" href="https://www.nist.gov/">https://www.nist.gov/</a> (2019)</li></ol>

Aunque esta técnica es increíblemente valiosa por su velocidad de muestreo y portabilidad, una limitación es su uso para especies epífitas, o aquellos que crecen en los árboles y no desde el suelo. En el estudio original10,una de las flores muestreadas fue epífita. Debido a que la máquina es demasiado pesada para colgarlibremente, se debe hacer una base estable y elevada para el muestreo. Además, la máquina se puede conectar a una toma de corriente o alimentada por batería, por lo que si...

Las flores suelen producir una fragancia utilizada para atraer a los polinizadores. Estas fragancias se componen de muchos compuestos químicos que actúan juntos como una mezcla floral1,2,3. Sin estas fragancias, las flores serían menos propensas a transmitir su información genética usando polinizadores. La fragancia floral se ha documentado en muchas familias de plantas con flores, siendo Orchidaceae una de las familias más comunes estudiadas4. Para entender el papel de la fragancia floral en la polinización, es importante recoger y analizar de forma no destructiva los compuestos químicos emitidos por las flores en diferentes momentos del día y durante los días a semanas las flores florecen están abiertas, ya que la fragancia puede variar con el tiempo5.
Un protocolo temprano para este tipo de muestreo fue desarrollado por Heath y Manukian6. El objetivo de sus métodos de muestreo era reducir el estrés en el espécimen (por ejemplo, plantas, insectos) que se estaba estudiando. Documentos anteriores documentaron que se requerían procedimientos destructivos para la planta, como la eliminación de flores en flor para recoger la fragancia. Publicaciones más recientes de fragancias florales de Cancino y Damon7,8 utilizaron métodos similares. Este estudio puso las flores en cámaras de vidrio y pasó el aire purificado sobre ellas; luego, los compuestos de fragancia de la cámara se absorbieron sobre los adsorbentes de polímeros porosos en pipetas Pasteur claras. Las fragancias se recogieron durante al menos dos horas durante este estudio. 9 llevaron a cabo estudios florales de fragancias sobre una orquídea epífita en el sur de Florida, al igual que el estudio original10. Una vez más, este estudio requirió que las flores fueran muestreadas durante más de dos horas para recoger los volátiles de la fragancia, con fragancia recogida en el polímero poroso adsorbente. El documento aquí presenta un método no destructivo que permite un muestreo mucho más rápido, con una duración de solo 10 minutos. Además, en lugar de utilizar una cámara de vidrio se utilizan bolsas de horno para hornear, que permiten un movimiento más flexible de la cámara y reducir las posibilidades de daño a las flores. Estas bolsas vienen en varios tamaños, lo que permite la opción de seleccionar el tamaño de la bolsa que se ajustará fácilmente a muestras individuales sin dañar la muestra o el material circundante. El adsorbente utilizado en este estudio fue Tenax Porous Polymer Adsorbent. Esto difiere de Porapak, ya que la muestra se puede desorbiar térmicamente sobre la columna GC-MS para su análisis, eliminando el uso de un disolvente químico.
Los métodos de este estudio proporcionan una manera de muestrear rápidamente volátiles de fragancia producidos por flores y podrían utilizarse para muestrear volátiles de otros especímenes, como las feromonas de insectos, o los volátiles de setas. El tiempo reducido para el muestreo significa que hay menos estrés en la muestra y la capacidad de recoger muchas muestras en un corto período de tiempo. Por ejemplo, en Sadler et al.9, la flor sólo era fragante por la noche, por lo que sólo dos o tres muestras se podían recoger cada noche. Con el método aquí, las muestras se pueden tomar toda la noche a intervalos de 15-20 minutos de la misma flor. Además, mediante el uso de bolsas en lugar de cámaras de vidrio, el espacio de la cabeza se puede suspender más fácilmente para el muestreo en el campo para la recolección in situ en especies de plantas amenazadas o en peligro de extinción. Usando el método presentado aquí, pudimos probar flores de 1,5 a 2 metros sobre el suelo. Estos métodos son increíblemente útiles para la recolección de fragancias en el laboratorio y el campo, y proporciona a los investigadores una técnica de muestreo que es rápida y no destructiva para la muestra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bulkhead Union</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-06390-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-06407-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatography</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>6890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool, Silanized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet liner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5062-3587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td>5973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds oven bag</td>
			<td>Reynolds Consumer Products</td>
			<td>Turkey size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenax Porous Polymer Adsorbent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11982</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid collection of floral fragrance volatiles using a headspace volatile collection technique for gc-ms thermal desorption sampling

Se han muestreado fragancias de muchas familias de flores y se han analizado los volátiles. Conocer los compuestos que componen las fragancias puede ser un paso importante para la conservación de las flores que están amenazadas o en peligro de extinción. Debido a que la fragancia floral es fundamental para atraer polinizadores, este método podría utilizarse para comprender mejor o incluso mejorar la polinización. Presentamos un protocolo que utiliza un filtro de aire de carbón portátil y vacío para recoger volátiles de fragancias florales, que luego son analizados por un GC-MS. Mediante el uso de este método, los volátiles de fragancia se pueden muestrear utilizando un método no destructivo con una máquina que se transporta fácilmente. Esta metodología utiliza un procedimiento de muestreo rápido, reduciendo el tiempo de muestreo de 2-3 horas a aproximadamente 10 minutos. Usando GC-MS, los compuestos de fragancia se pueden identificar individualmente, sobre la base de estándares auténticos. Se presentan los pasos utilizados para recopilar datos de fragancia y control, desde la configuración del material hasta la recopilación de la salida de datos.

Los datos representativos del GC-MS se muestran como un cromatograma en la Figura 1. Además del cromatograma, también se proporciona un archivo de datos de resultados(Archivo suplementario 1). Este archivo de datos proporciona el tiempo de retención para cada pico (RT) y una identificación de qué compuesto es ese pico (Biblioteca/ID). Los picos entre las 10:00 y las 15:00 minutos son volátiles florales, debido al peso molecular de los compuestos10.</s...

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Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling

Aquí, presentamos un protocolo para recoger los volátiles de fragancia sorpresal de flores en flor, utilizando un procedimiento de muestreo no destructivo.

Colección Rápida de Volátiles de Fragancia Floral usando una Técnica de Colección Volátil del Espacio de Cabeza para muestreo de desorción térmica GC-MS

Fragrances of many flower families have been sampled and the volatiles analyzed. Knowing the compounds that make up the fragrances can be an important ...

Debido a que la fragancia floral es fundamental para atraer polinizadores, este método podría utilizarse para comprender mejor o incluso mejorar la polinización de las especies de flores nativas. Con este método, los volátiles de fragancia se muestrean utilizando un método no destructivo con una máquina de fácil transporte. Esta metodología utiliza un muestreo rápido, reduciendo el tiempo de muestreo de dos a tres horas a 10 minutos.Estos métodos proporcionan una manera de muestrear rápidamente los volátiles producidos por las flores y podrían utilizarse para muestrear volátiles de otros especímenes, como las feromonas de insectos. Para comenzar, seleccione una flor que inicialmente no esté abierta y marque la flor con cinta de bandera para asegurar el muestreo repetido de la misma flor. Hervir las bolsas del horno en agua durante 30 minutos para eliminar los compuestos plásticos residuales.Para secar, hornee en un horno a 175 grados Centígrados durante 60 minutos. Una vez que las bolsas se hayan secado, añadir una unión de mamparo de polipropileno a cada esquina del extremo cerrado de las bolsas del horno. Enjuague todas las bolsas y tubos con 75% de etanol y déjelos secar al aire.Luego, hornee las bolsas y los tubos en un horno a fuego lento, entre 74 y 85 grados Celsius durante 30 minutos. Dependiendo de la duración del tiempo de floración, si es posible espere al menos 24 horas después de la floración para recoger la muestra. Cubra la flor seleccionada con una bolsa de horno al horno.Aprieta la bolsa firmemente con una cremallera de plástico debajo de la flor para evitar que el aire no deseado fluya en la bolsa. El uso de guantes de neopreno estériles, conecte un tubo de la salida de aire del equipo de recogida y conéctelo a una de las uniones de mamparos en la bolsa del horno. En la otra unión de mamparo, coloque un cartucho de filtro de vidrio que contenga adsorbente de polímero poroso.Conecte un segundo tubo al equipo de recogida en la entrada de vacío. Conecte el extremo del segundo tubo al cartucho del filtro de recogida volátil de vidrio. Encienda la bomba de aire y el vacío al mismo tiempo y ajuste a 0,05 litros por minuto.El espacio de la cabeza alrededor de la flor está lleno de aire, pero no sobreinflado. El sistema extrae aire de la bolsa a través del filtro, atrapando los volátiles florales. Deje que la máquina funcione durante 10 minutos.Y luego apague la bomba de aire y el vacío. Desmonte los tubos y el cartucho del filtro de vidrio. Coloque el filtro en un vial de vidrio y atornille una tapa.Selle el vial con cinta adhesiva de PTFE. Almacene la muestra en un congelador hasta el análisis de GCMS. Repita este proceso con una bolsa de horno vacía para recoger una muestra de aire en blanco como control.Para replicaciones consistentes de los mismos volátiles, repita la recolección de muestras a la misma hora cada día, ya que algunas flores producen diferentes niveles de fragancia en el transcurso del día. En primer lugar, retire el cartucho de filtro de vidrio del congelador y colóquelo en un GCMS en el puerto del inyector. Para liberar los volátiles del espacio de la cabeza recogidos en el adsorbente de polímero poroso del adsorbente, caliente la trampa de recolección térmica a 220 grados Celsius durante ocho minutos dentro de un flujo de gas helio a 1,2 mililitros por minuto.Compare los cromatogramas de los volátiles recogidos para identificar picos recurrentes comunes. Después de identificar los volátiles pico, utilice Pherobase para determinar si han sido descritos previamente en fragancias florales. En este estudio, los datos representativos del GCMS se muestran como un cromatograma.Los picos entre 10 y 15 minutos son volátiles florales. Los volátiles recogidos fueron referenciados en Pherobase para determinar si han sido descritos previamente en una fragancia floral. Por ejemplo, el compuesto número 21, con un tiempo de retención de 10.311 se ha identificado como benzaldehído.El benzaldehído se puede buscar en Pherobase con una lista de todas las especies de flores, organizadas por familia de plantas, de las que se ha identificado ese compuesto de fragancia. Las especies de orquídeas se muestran aquí, a partir de la cual se ha determinado que el benzaldehído está presente en la fragancia floral. Los métodos anteriores tardaron de dos a cuatro horas por muestra.El uso de un disolvente para eliminar la muestra del filtro daría lugar a un pico de disolvente en el GCMS. Esto ocultaría los compuestos de cero a 3,5 minutos. Este método permite ver todos los compuestos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

Bioquímica

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Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

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