Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
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这项工作得到了法国国家癌症研究所 (PLBIO15-256)、anr (tie-leot 跳过) 和 itmo 癌症 (mm & tt) 的资助。

该议定书遵循《赫尔辛基宣言》和蒙彼利埃大学生物资源医院中心的协议。
1. 体外正常血浆细胞分化模型
请注意:pc 是通过 11、12、13的四步文化生成的。
<ol><li>
b 细胞扩增和分化
	<ol>
<li>使用健康志愿者的外周血细胞进行记忆 b 细胞纯化。</li>
		<li>用 rpmi 1640...

在人类中, pc 是罕见的细胞, 分化阶段发生在解剖的地方, 妨碍充分的生物表征。我们已经开发了一个体外 b 到 pc 分化模型使用多步骤培养系统, 其中激活分子和细胞因子的各种组合随后应用, 以再现发生在体内不同的器官组织 11,12,13。
其他有效的体外 b 对 pc 分化模型报告为18,<sup ...

b 细胞与血浆细胞 (pc) 的分化对体液免疫和保护宿主免受感染至关重要1。b 至 pc 分化与转录能力和代谢的主要变化有关, 以适应抗体分泌。对控制 b 到 pc 分化的转录因子进行了广泛的研究, 揭示了包括 b-和 pc 特异性转录因子 (tf)2在内的专属网络。在 b 细胞中, pox5、bcl6 和 bach2 tf 是 b 细胞身份2、3 的监护人。irf4、 prdm1编码 blimp1 和xbp1 pc tf 的诱导将消灭 b 细胞基因, 并诱导一个协调的抗体分泌细胞转录程序 3,4,5。这些协调的转录变化与 ig 基因转录激活以及从膜结合形式到免疫球蛋白重链 2,3的分泌形式的转换有关,4. b 至 pc 分化与内质网和 golgi 仪器功能相关的基因诱导, 同时进行展开的蛋白质反应 (upr) 激活, 已知通过适应合成分泌免疫球蛋白6,7。tf xbp1 在这种细胞适应 8,9,10中起着重要作用。
b 细胞和 pc 是体液免疫的关键参与者。了解控制正常血浆细胞产生和存活的生物过程对于需要确保有效免疫反应和防止自身免疫或免疫缺陷的治疗干预至关重要。pc 是罕见的细胞, 早期分化阶段发生在解剖位置, 妨碍充分的生物表征, 特别是在人类。利用多步培养系统, 我们报告了一个体外 b 到 pc 分化模型。该模型再现了体内不同器官中发生的顺序细胞分化和成熟11、 12、13。第一步, 记忆 b 细胞首先被 cd40 配体、寡核苷酸和细胞因子结合激活四天, 并分化为前质体 (prepbs)。第二步, 通过去除 cd40l 和寡核苷酸刺激并改变细胞因子组合, 诱导前质体分化为质粒 (pbs)。第三步, 通过改变细胞因子组合11,12,诱导血浆 ab面体分化为早期 pc。第四步是用骨髓基质细胞条件培养基或选定的生长因子13培养这些早期的 pc, 从而获得完全成熟的 pc。这些成熟的 pc 可以在体外存活数月, 并分泌大量免疫球蛋白 (图 1)。有趣的是, 我们的体外模型重述了可在体内检测到的不同 b 到 pc 阶段的协同转录变化和表型11、12、13、14 ,15。pc 是稀有细胞, 我们的体外分化模型可以研究人的 b 到 pc 分化。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

血浆细胞 (pc) 分泌大量抗体, 并从被激活的 b 细胞中产生。pc 是位于骨髓或粘膜中的罕见细胞, 可确保体液免疫。由于其频率和位置较低, 对个人电脑的研究在人类中很困难。我们报告了 b 到 pc 体外分化模型使用选定的细胞因子和活化分子的组合, 允许重现发生在体内的细胞分化。在这个体外模型中, 记忆 b 细胞 (mbc) 将分化为前血浆 ab面 (前 pbs)、血浆 abc (pbs)、早期 pc, 最后, 分化为长寿 pc, 表型接近健康个体中的对应基因。我们还构建了一个开放访问生物信息学工具, 以分析与 pc 分化有关的 gep 数据中最突出的信息。这些资源可用于研究人 b 对 pc 分化, 在目前的研究中, 我们研究了人 b 到 pc 分化过程中表观遗传因子的基因表达调控。

体外正常 pc 分化的总体过程如图 1所示。利用这里提出的协议, 我们可以产生足够数量的细胞, 而这些细胞无法从体内人体样本中获得。尽管研究了复杂的转录因子网络在 pc 分化中的作用, 但调节关键 pc 分化转录网络的机制仍然鲜为人知。细胞分化主要是由表观遗传和转录的变化驱动的。利用我们的体外模型和 b 到 pc gep 图集, 研究了表观遗传因子在?...

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In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

利用多步培养系统, 我们报告了体外 b 细胞对血浆细胞分化模型。

人正常记忆 b 细胞与长寿浆细胞体外分化模型

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

血浆细胞是罕见的细胞，在解剖位置发生30个分化阶段，损害完整的生物特征，特别是在人类。我们的体外B2血浆细胞分化模型再现了体内不同器官中发生的连续细胞分化和成熟。此体外模型回顾了在体内可以检测到的不同 B2 血浆细胞阶段的协调转录变化和表型。我们还构建了一个开放访问生物信息工具，用于分析与等离子细胞分化相关的勘探数据中最突出的信息。演示程序将是胡格斯德布萨克，一个博士后从我的实验室。首先，从健康志愿者获得外周血细胞，用于记忆B细胞纯化。用 24.5 毫升的 RPMI 1640 介质稀释 7.5 毫升血液。接下来，将12.5毫升室温密度梯度添加到无菌的50毫升锥形管中。轻轻覆盖密度梯度与32毫升稀释的血液，确保尽量减少两个阶段的混合。在制动器关闭时，在 500 倍重力下离心 20 分钟。从稀释的血浆和密度梯度界面收集外周血单核细胞。将细胞转移到无菌的50毫升管中，用汉克的平衡盐溶液填充高达45毫升的管子。在500倍重力下离心5分钟。小心地取出上一液，并保留颗粒。然后，加入45毫升的RPMI 1640介质，辅以10%FCS。在500倍重力下离心5分钟。小心地取出上一液，并保留颗粒。加入30毫升PBS，辅以2%FCS。使用防CD磁珠去除CD2阳性细胞，为一个目标细胞添加四个磁珠。在4摄氏度下孵育30分钟。使用磁铁进行细胞分离应用，将珠状细胞与未绑定的细胞分离。收集未结合的细胞，用抗CD19 APC和抗CD27PE抗体孵育，在4摄氏度下孵育15分钟。在含有10%山羊血清的PBS中清洗细胞两次。然后，使用细胞分拣机将记忆B细胞净化到95%的纯度。在此之后，加入可溶性CD40配体和抗多石丁单克隆抗体，用于记忆B细胞激活。用白细胞间-2、白细胞-10和白细胞-15将纯化记忆B细胞在六孔培养板中镀4天。对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第四天纯化CD38阴性CD20阴性前细胞。在第四天，通过向每孔添加两毫升细胞悬浮液，计算细胞数，并在每毫升25万个细胞密度的细胞密度的12孔培养板中镀入细胞。为了诱导分化，去除CPG寡核苷酸和可溶性CD40配体，并添加含有新的细胞因子鸡尾酒的培养基，包括白细胞素-2、白细胞素-6、白细胞素-10和白细胞素-15。在37摄氏度下培养细胞三天。对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第七天纯化CD38阳性、CD20阴性血浆细胞。第七天，数一数细胞。通过向每孔添加两毫升细胞悬浮液，将12孔培养板中的细胞以每孔50万个细胞密度进行镀。使用含有白细胞间素-6、白细胞-15和干扰素-α的新鲜培养基将血浆细胞分化成早期血浆细胞，在37摄氏度下连续三天。对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第10天纯化CD20阴性、CD38阳性、CD138-阳性的早期血浆细胞。首先，培养细胞用培养媒介五天。使用 0.2 微升过滤器过滤频闪细胞培养上清液，以获得频闪细胞条件介质并冻结，直到准备好使用。接下来，培养12孔培养板中的早期血浆细胞，使用先前获得的白细胞间-6和S四月（APRIL）的频闪细胞培养基，每孔细胞密度为50万细胞，向每孔添加两毫升细胞悬浮液。在37摄氏度下孵育，每周更新频闪细胞条件介质。然后，测量流细胞分类的血浆细胞中的免疫球蛋白分泌。以每毫升一百万个细胞的密度培养血浆细胞24小时，收获培养上一升。使用ELISA试剂盒，测量免疫球蛋白G和免疫球蛋白A.第一，启动基因组Scape开放访问生物信息学网络工具。在浏览数据菜单中，选择名为"人类 B 细胞"的数据集到血浆单元。使用分析工具中的表达/表达报告工具，可对独特基因或基因列表的基因表达配置文件进行可视化。接下来，选择分析工具 webSAM 以加载 SAM 工具。选择人类B细胞到血浆细胞数据集，并选择要比较的样本组。使用不同的筛选器来应用感兴趣的筛选选项。要将基因表达配置文件与 SAM 工具进行比较，请修改筛选选项，包括折叠更改、排列数、错误发现率和比较类型。该软件将计算分析，并提供所选组之间的不同表达的基因。本研究对正常血浆细胞分化中表观遗传因子的表达变化进行了调查。使用多类 SAM 分析，71 个基因在记忆 B 细胞之间明显有差异地表达， 前脑细胞、血浆细胞、早期血浆细胞和假发现率低于5%的骨髓血浆细胞记忆B细胞阶段的特点是23个表观遗传播放器基因过度表达，包括39.13%的组蛋白乙酰转移酶，30.43%的组蛋白甲基代转酶，21.74%的组蛋白脱脂酶，4.35%的甲基结合蛋白，4.35%的组蛋白去乙酰酶。14个表观遗传播放器基因在前细胞阶段被显著过度表达，包括50%的组蛋白甲基转移酶，14.28%的DNA甲基转移酶，21.43%的组蛋白去乙酰胺，7.14%的组蛋白解乙酰酶，和17.14%的组蛋白丙酰转移酶。按照此过程，可以进行多项分析，以识别和了解在这些 B2 等离子细胞分化期间染色质结构和结构的修改。这种体外分化模型将允许生成足够的细胞来完成这一分子分析，以揭示整个建模所涉及的通路及其在B2血浆细胞分化期间的下游转录影响。从这项研究中获得的这些知识可以指导和指导血浆细胞疾病的诊断和治疗策略，例如多发性骨髓瘤，一种没有明确治愈的癌症，为此迫切需要更好的预后和改进的治疗策略。在B2等离子细胞分化期间，描述和理解影响染色质的表观遗传重塑结构和结构变化将特别令人感兴趣。这可以通过基因测序、ERRBS、ATAC测序、IC和RNA测序完成。根据健康供体的血液，在用于记忆B细胞纯化的活性B细胞、前细胞、血浆细胞和血浆细胞的百分比中可以观察到中度异质性。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

从排序的永生B细胞产生的重组人IgG单克隆抗体

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

由腺病毒感染正常细胞分离病毒复制车厢富集亚核分数

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

的分离，分化和人类的定量分泌抗体的B细胞从血液：酶联免疫斑点作为体液免疫的功能读出

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

在从幼稚的CD4 + T细胞的人CD4 + FOXP3 +诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的体外分化

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...