Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
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この作品はフランスのインカ (Institut 国立デュがん) からの助成金によって支えられた研究所 (PLBIO15-256)、ANR (ネクタイ スキップ)、機械がん (ミリ ・ TT)。

ヘルシンキ宣言と生物資源のモンペリエ大学病院センターの契約に基づきガイドラインをプロトコルに従います。
1. 培養正常形質細胞分化のモデルで
注:Pc は、4 つのステップ文化11,12,13を通じて生成されます。
<ol><li>
B 細胞の増幅と分化
	<ol>
<li>記憶 B ?...

人間で PC は稀な細胞分化段階を完全に生物学的特性を妨げる解剖学的場所で行われています。体外 B 活性化分子とサイトカインのさまざまな組み合わせは、その後で発生した連続細胞分化を再現するために適用される多段階培養システムを用いた PC 分化モデルを開発した、異なる臓器・組織 vivo11,12,13。
<p class="jove_cont...

B 細胞の形質細胞 (Pc) への分化は、体液性免疫に欠かせない感染症1に対してホストを保護します。PC 分化する B 抗体の分泌に合わせて転写能力と代謝に大きな変化に関連付けられます。B を PC の分化を制御する転写因子が広く研究されているし、明らかに排他的なネットワーク B および PC 特異的転写因子 (TFs)2。B 細胞の PAX5、BCL6 および BACH2 TFs が B 細胞アイデンティティ2,3の保護者です。IRF4、 PRDM1エンコード BLIMP1 およびXBP1 PC TF の誘導が B 細胞遺伝子を消すし、調整された抗体分泌細胞転写プログラム3,4,5を誘発します。これら協調的な転写変更は膜結合型フォームから免疫グロブリン重鎖2,3,の分泌された形態への切り替えと Ig 遺伝子転写活性化に関連付けられています。4. PC 分化する B が小胞体に関与する遺伝子の誘導とリンクされ、ゴルジ装置関数の合成を収容し PC で重要な役割を再生する知られている小胞体ストレス応答 (UPR) アクティベーションを併用免疫グロブリンは、6、7を分泌します。TF XBP1 は、この細胞の適応8,9,10の主要な役割を果たしています。
B 細胞と Pc は、体液性免疫の主要選手です。生物学を理解する生産と通常のプラズマ細胞の生存効率的な免疫応答を確保し、自己免疫疾患や免疫不全を防止する必要がある治療上の介在の重要ですコントロールを処理します。PC は、完全生物学的特性、特に人間を妨げる解剖位置で行われる初期の分化段階で希少な細胞です。多段階培養システムを使用して、PC の差別化モデルに体外 B を報告した.このモデルを再現した連続細胞分化と成熟 vivo11,12,13.別の臓器に発生します。最初のステップでメモリー B 細胞は最初に 4 日間の CD40 リガンド、オリゴデオキシヌクレオチドおよびサイトカインの組み合わせによってアクティブ化され、preplasmablasts (PrePBs) に分化します。2 番目のステップでは、preplasmablasts plasmablasts (PBs) に分化する CD40L とオリゴデオキシヌクレオチド刺激の取り外しとサイトカインの組み合わせを変更することによって引き起こされます。3 番目のステップでは、plasmablasts は、初期 Pc にサイトカイン組み合わせ11,12を変更することによって区別するために引き起こされます。4 番目のステップは、培養骨髄間質細胞のエアコンの中でこれらの初期の Pc によって完全に成熟した Pc を取得する導入されたか、成長因子13を選択しました。これらの成熟した Pc 数ヶ月体外を生き残るため、免疫グロブリン (図 1) を大量に分泌します。興味深いことに、私たちの in vitro モデルを繰り返す、協調的な転写変更と検出された生体内で11,12,13,14 をすることができます PC の段階に別の B の表現型 ,15。Pc は、希少な細胞と in vitro 分化モデル PC 分化ヒト B を勉強することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

形質細胞 (Pc) 抗体の大量分泌し、活性化されている B 細胞から発生します。Pc は骨髄や粘膜に位置する希少な細胞、体液性免疫を確保します。それらの低周波と場所のため Pc の研究が困難な人間に。我々 は PC に B を報告選択した生体内で発生した連続細胞分化を再現することができるサイトカインや活性化の分子の組み合わせを用いた in vitro 分化モデル。この in vitro モデル、メモリー B 細胞 (MBCs) が前の plasmablasts (prePBs) plasmablasts に (PBs)、早く Pc を区別するために、最終的に、長命に Pc、表現型を閉じる健常者.の対応するまた、オープン アクセス バイオインフォマティクス PC 分化に関連する GEP データから最も顕著な情報を分析するためのツールを建てた。PC 分化し現在の研究ではヒトの B を勉強するこれらのリソースを使用することができます、PC 分化ヒト B 中に後成の要因の遺伝子発現制御を検討しました。

生体外で通常 PC 分化の全体的な手順は、図 1で表されます。ここで提示されたプロトコルを使用して、ex vivo ひと試料で得られなかった細胞の十分な量を生成可能性があります。PC の分化に関与する転写因子の複雑なネットワークの役割を行ったキー PC 分化の転写ネットワークを規定しているメカニズムのあまり知られていないままです。細胞?...

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In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

In vitro における B 細胞を形質細胞分化モデルに報告多段階培養システムを使用して。

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

形質細胞は、特にヒトにおいて完全な生物学的特性評価を損なう解剖学的位置で行われている30の分化段階を有する稀な細胞である。インビトロB2の血漿細胞分化モデルは、生体内の異なる器官で起こる逐次細胞の分化と成熟を再現しています。このin vitroモデルは、協調転写変化と、生体内で検出できる異なるB2形質細胞段階の表現型を再現する。また、プラズマ細胞の分化に関連する探査データから最も顕著な情報を分析するためのオープンアクセスバイオインフォマティクスツールを構築しました。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるユーグ・ド・ブサックです。まず、健常なボランティアから末梢血細胞を得て、メモリB細胞を精製する。7.5ミリリットルの血液をRPMI 1640培地24.5ミリリットルで希釈する。次に、無菌の50ミリリットルの円錐管に12.5ミリリットルの室温密度勾配を加えます。濃度勾配を32ミリリットルの希釈血液で優しく重ね、2つの相の混合を最小限に抑えます。ブレーキをオフにして500倍の重力で20分間遠心分離機。希釈された血漿および密度勾配界面から末梢血単核細胞を収集する。細胞を無菌50ミリリットルチューブに移し、ハンクのバランス塩溶液で最大45ミリリットルのチューブを充填します。5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。その後、RPMI 1640培地の45ミリリットルを加え、10%FCSを添加する。5分間の500倍の重力で遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを保管します。PBSの30ミリリットルを追加, で補います 2%FCS.1つのターゲットセルに4つのビーズを加えることでCD陽性細胞を除去するために、抗CD磁気ビーズを使用してください。摂氏4度で30分間インキュベートします。細胞分離アプリケーションに磁石を使用して、ビーズ結合細胞を非結合セルから分離します。非結合細胞を収集し、抗CD19 APCおよび抗CD27 PE抗体を摂氏4度で15分間インキュベートします。10%ヤギの血清を含むPBSで細胞を2回洗浄します。次いで、細胞選別機を用いて、メモリB細胞を純度95%まで精製する。この後、可溶性CD40リガンドと抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を追加して、メモリーB細胞活性化を行います。精製したメモリB細胞をインターロイキン-2、インターロイキン-10、インターロイキン-15で4日間、6ウェル培養プレートにプレートします。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞選別機を使用して、4日目にCD38陰性CD20陰性プレプラズマ芽細胞を精製します。4日目に、細胞を数え、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって、1ミリリットル当たり250,000個の細胞密度で12ウェル培養プレートにプレートします。分化を誘導するには、CPGオリゴヌクレオチドおよび可溶性CD40リガンドを除去し、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-10およびインターロイキン-15を含む新しいサイトカインカクテルを含む新しい培養培地を添加する。37°Cで3日間細胞を培養します。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、7日目にCD38陽性、CD20陰性プラズマ芽細胞を精製します。7日目に、セルを数えます。12ウェル培養プレートに細胞を12ウェル培養プレートに500,000個の細胞密度でプレートし、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。インターロイキン-6、インターロイキン-15、インターフェロンアルファを含む新鮮な培地を摂氏37度で3日間使用して、プラズマ芽細胞を初期の形質細胞に分化する。遺伝子発現プロファイリングの場合、細胞ソーターを使用して、CD20陰性、CD38陽性、CD138陽性初期の形質細胞を10日目に精製します。まず、培養液で5日間の間質細胞を培養する。0.2マイクロリットルフィルターを使用して、間質細胞培養上清を濾過し、間質細胞コンディショナー培地を得て、使用できる状態になるまで凍結します。次に、初期の形質細胞を12ウェル培養プレートで培養し、前に得られた間質細胞培地をインターロイキン-6およびAPRILで、ウェル当たり500,000個の細胞密度で使用し、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えた。摂氏37度でインキュベートし、毎週間質細胞調節培地を更新する。次に、フローサイトメトリーソート血漿細胞からの免疫グロブリン分泌を測定する。1ミリリットル当たり100万個の密度で24時間、形質細胞を培養し、培養上清を収穫する。ELISAキットを用いて、免疫グロブリンG、および免疫グロブリンA.Firstを測定し、GenomicScapeオープンアクセスバイオインフォマティクスウェブツールを起動します。データの参照メニューで、ヒト B 細胞という名前のデータセットを、形質細胞に選択します。分析ツールの発現/共発現レポートツールを使用して、ユニークな遺伝子の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子リストの可視化が可能です。次に、分析ツール webSAM を選択して SAM ツールをロードします。ヒトB細胞から形質細胞へのデータセットを選択し、比較するサンプルのグループを選択します。使用できるさまざまなフィルターを使用して、対象のフィルター・オプションを適用します。SAM ツールで遺伝子発現プロファイルを比較するには、フォールド変更、順列数、偽発見率、比較の種類などのフィルタリングオプションを変更します。ソフトウェアは分析を計算し、選択したグループ間で遺伝子を差し出して提供します。本研究では、正常な形質細胞分化におけるエピジェネティック因子の発現変化を調べる。多クラスSAM分析を用いて、71個の遺伝子が、5%以下の偽発見率を有するメモリB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および骨髄形質細胞の間で有意に差が発現することが分かる。、ヒストンデメチル酵素の21.74%、メチル結合タンパク質の4.35%、ヒストンデアセチラーゼの4.35%。14エピジェネティックプレーヤー遺伝子は、ヒストンメチルトランスレシエーアーゼの50%、DNAメチルトランスレシエーアーゼの14.28%、ヒストンデアセチラーゼの21.43%、ヒストンデメチル酵素の7.14%、ヒストンアセチルトランス酵素の17.14%を含むプレプラズマ芽細胞段階で有意に過剰発現している。この手順に従って、これらのB2血漿細胞分化中にクロマチン構造およびアーキテクチャにおける修飾を同定し、理解するためのいくつかの分析が行われる。このin vitro分化モデルは、この分子解析を完了するのに十分な細胞を生成し、この全体のモデリングに関与する経路とB2血漿細胞分化中の下流転写影響の両方を明らかにすることを可能にする。この研究から得られたこの知識は、より良い予後と改善された治療戦略が非常に必要とされる決定的な治療法のない癌である多発性骨髄腫の場合のような形質細胞疾患の診断および治療戦略を知らせ、指導することができる。B2血漿細胞分化中にクロマチンに影響を与えるエピジェネティックリモデリング構造および建築変化を特徴付け、理解することは特に興味深いものです。これは、遺伝子シーケンシング、ERRBS、ATACシーケンシング、IC、およびRNAシーケンシングを使用して行われます。中程度の異質性は、健常ドナーの血液に応じて、活性化されたB細胞、プレプラズマ芽細胞、プラズマ芽細胞および形質細胞の割合で観察され、記憶B細胞の精製に使用される。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

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初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

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An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

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定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

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An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

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Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol