Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra fransk INCA (Institut nasjonale du kreft) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) og ITMO kreft (MM & TT).

Protokollen følger retningslinjene i henhold til erklæringen i Helsinki og avtalen av Montpellier University Hospital for biologiske ressurser.
1. i Vitro Normal Plasma celle differensiering modell
Merk: PCer er generert gjennom en fire-trinns kultur11,12,13.
<ol><li>
B celle forsterkning og differensiering
	<ol>
<li>Bruk perifert blod ...

I menneskelige, PC er sjeldne celler differensiering stadier foregår anatomiske steder som hemmer full biologiske karakterisering. Vi har utviklet et i vitro B PC differensiering modellen bruker flertrinns kultur systemer der ulike kombinasjoner av aktivisering molekyler og cytokiner brukes deretter for å reprodusere sekvensiell celledifferensiering forekommer i den forskjellige organer/vev i vivo11,12,13.
<p class="jove_c...

Differensiering av B-celler til plasma celler (stk.) er avgjørende for humoral immunitet og beskytte verten mot infeksjoner1. B å PC differensiering er forbundet med store endringer i transkripsjon kapasitet og metabolisme å imøtekomme til antistoff sekret. Transkripsjonsfaktorer som kontrollerer B til PC differensiering har vært grundig studert og avdekket eksklusive nettverk inkludert B - og PC-spesifikke transkripsjon faktorer (TFs)2. B celler er PAX5, BCL6 og BACH2 TFs voktere av B celle identitet2,3. Induksjon av IRF4, PRDM1 koding BLIMP1 og XBP1 PC TF vil slukke B celle gener og indusere en koordinert antistoff-sekresjon celle transcriptional programmet3,4,5. Koordinerte transcriptional endringene er forbundet med Ig gener transkripsjon aktivisering med en bryter fra skjemaet membran-bundet til secreted form av immunglobulin tunge kjeden2,3, 4. B til PC differensiering er knyttet til induksjon i gener involvert i endoplasmatiske retikulum og Golgi apparatet fungerer samtidig med oppslåtte protein svar (UPR) aktivisering kjent for å spille en nøkkelrolle i PC ved imøtekommende syntesen av utskilles immunglobuliner6,7. TF-XBP1 spiller en viktig rolle i denne mobilnettet tilpasning8,9,10.
B-celler og PCer er sentrale aktører i humoral immunitet. Forstå biologiske prosesser som kontrollerer produksjonen og overlevelse av normale plasma celler er kritisk i terapeutiske tiltak som skal sikre effektiv immunreaksjoner og forhindre autoimmunitet eller uimottakelig mangel. PC er sjeldne celler differensiering-tidligfasen som finner sted i anatomisk steder som hemmer full biologiske karakterisering, spesielt i menneskelig. Bruker flertrinns kultur systemer, har vi rapportert en i vitro B PC differensiering modellen. Denne modellen reproduserer den sekvensielle celledifferensiering og modning forekommer i forskjellige organer i vivo11,12,13. I et første skritt, minne B-celler er først aktivert for fire dager av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides og cytokin kombinasjon og differensiere i preplasmablasts (PrePBs). Under det andre trinnet hjulpet preplasmablasts til å skille ut plasmablasts (PBs) ved å fjerne CD40L og oligodeoxynucleotides stimulering og endre cytokin kombinasjonen. I en tredje trinnet er plasmablasts overtalt til å skille ut tidlig PCer ved å endre de cytokin kombinasjon11,12. En fjerde trinnet ble innført for å få fullt ut modne PCer ved dyrking disse tidlige PCs med benmarg stromal celler betinget medium eller valgt vekstfaktorer13. Disse eldre PCer kan overleve flere måneder i vitro og skiller ut store mengder immunglobulin (figur 1). Interessant, viser vår i vitro modell koordinerte transcriptional endringene og fenotypen av ulike B til PC stadier som kan være oppdaget i vivo11,12,13,14 ,15. PCer er sjeldne cellene våre i vitro differensiering modellen kan studere human B til PC differensiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

Plasma celler (stk.) skiller ut store mengder av antistoffer og utvikle fra B-celler som har blitt aktivert. PCer er sjeldne celler finnes i benmarg eller mucosa og sikre humoral immunitet. Deres lav frekvens og plassering, studiet av PCer er vanskelig i menneskelig. Vi rapporterte en B til PC i vitro differensiering modellen med valgte kombinasjoner av cytokiner og aktivisering molekyler som kunne reprodusere sekvensiell celledifferensiering forekommer i vivo. I denne i vitro modellen, minne B-celler (MBCs) vil skille ut før plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidlig PCer og til slutt i varige nær PCer, med en fenotypen sine kolleger i friske individer. Vi har også bygget en åpen tilgang Bioinformatikk verktøy for å analysere den mest fremtredende informasjonen fra GEP data relatert til PC differensiering. Disse ressursene kan brukes til å studere human B til PC differensiering og i denne studien, vi undersøkt genet uttrykk regulering av epigenetic faktorer i human B til PC differensiering.

Den generelle prosedyren av i vitro normal PC differensiering er representert i figur 1. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, kan vi generere tilstrekkelig mengde celler som ikke kunne hentes med ex vivo prøver fra mennesker. Selv om rollen av komplekse nettverk av transkripsjonsfaktorer involvert i PC differensiering har blitt undersøkt, fortsatt mekanismer regulere nøkkel PC differensiering transkripsjon nettverk lite kjent. Differensiering er h...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Bruker flertrinns kultur systemer, rapportere vi en i vitro B-celle til plasma celle differensiering modell.

I Vitro differensiering modell av menneskelig Normal minne B-celler til lang levetid Plasma celler

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Plasmaceller er sjeldne celler med 30 differensieringsstadier som finner sted på anatomiske steder som svekker full biologisk karakterisering, spesielt hos mennesker. Vår in vitro B2 plasmacellediensieringsmodell gjengir sekvensiell cellediensiering og modning som forekommer i de forskjellige organene in vivo. Denne in vitro-modellen rekahaler de koordinerte transkripsjonsendringene og fenotypen til de forskjellige B2 plasmacellestadiene som kan oppdages in vivo.Vi bygget også et bioinformatisk verktøy for åpen tilgang for å analysere de mest fremtredende informasjonene fra letedata relatert til plasmacelledilatering. Å demonstrere prosedyren vil være Hugues de Boussac, en postdoktor fra laboratoriet mitt. For å begynne, få perifere blodlegemer fra friske frivillige for minne B celle rensing.Fortynn 7,5 milliliter blod med 24,5 milliliter RPMI 1640 medium. Deretter legger du til 12,5 milliliter romtemperaturtetthetsgradient til et sterilt konisk rør på 50 milliliter. Legg forsiktig tetthetsgradienten med de 32 milliliter fortynnet blod, og sørg for å minimere blandingen av de to fasene.Sentrifuge i 20 minutter ved 500 ganger tyngdekraften med bremsen av. Samle perifere blod mononukleære celler fra fortynnet plasma og tetthet gradient grensesnitt. Overfør cellene til et sterilt 50-milliliter rør og fyll røret opp til 45 milliliter med Hanks balanserte saltløsning.Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften i fem minutter. Fjern forsiktig overnatanten og hold pelleten. Deretter legger du til 45 milliliter RPMI 1640 medium, supplert med 10% FCS.Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften i fem minutter. Fjern forsiktig overnatanten og hold pelleten. Legg til 30 milliliter PBS, supplert med 2% FCS.Bruk anti-CD magnetiske perler for å fjerne CD2-positive celler ved å legge til fire perler for en målcelle. Inkuber ved fire grader Celsius i 30 minutter. Ved hjelp av en magnet for celleseparasjonsapplikasjon, skill de perlebundne cellene fra de ubundne cellene.Samle de ubundne cellene og inkuber dem med anti-CD19 APC og anti-CD27 PE antistoffer i femten minutter ved fire grader Celsius. Vask cellene to ganger i PBS som inneholder 10% geiteserum. Deretter bruker du cellesorteringsfilen til å rense minne B-cellene til en 95% renhet.Etter dette, legge oppløselig CD40 ligand og anti-polyhistidine monoklonalt antistoff for minne B celle aktivering. Plate renset minne B celler i seks-brønns kultur plater i fire dager med interleukin-2, interleukin-10 og interleukin-15. For profilering av genuttrykk bruker du en cellesortering til å rense CD38-negative CD20-negative preplasmablaster på dag fire.På dag fire teller du cellene og belagt dem i 12-brønns kulturplater med en celletetthet på 250 000 celler per milliliter ved å legge til to milliliter cellesuspensjon i hver brønn. For å indusere differensiering, fjern CPG oligonucleotides og løselig CD40 ligand og legge til nye kulturmedium som inneholder en ny cytokin cocktail inkludert interleukin-2, interleukin-6, interleukin-10 og interleukin-15. Kultur cellene i tre dager ved 37 grader Celsius.For profilering av genuttrykk bruker du en cellesortering til å rense CD38-positive, CD20-negative plasmablaster på dag sju. På dag sju teller du cellene. Plate cellene i 12-brønns kulturplater med en celletetthet på 500 000 celler per brønn, ved å legge til to milliliter cellesuspensjon til hver brønn.Differensier plasmablastene i tidlige plasmaceller ved hjelp av ferskkulturmedium som inneholder interleukin-6, interleukin-15 og interferon-alfa i tre dager ved 37 grader Celsius. For profilering av genuttrykk bruker du en cellesortering til å rense CD20-negative, CD38-positive, CD138-positive tidlige plasmaceller på dag 10. Først kultur stromal celler i fem dager med kultur medium.Bruk et 0,2-mikroliterfilter til å filtrere denstromale cellekulturen supernatant for å oppnå stromal cellebetinget medium og fryse til den er klar til bruk. Deretter kultur de tidlige plasmacellene i 12-brønns kulturplater, ved hjelp av det tidligere oppnådde stromalcellemediet med interleukin-6 og APRIL med en celletetthet på 500.000 celler per brønn, ved å legge til to milliliter cellesuspensjon til hver brønn. Inkuber ved 37 grader Celsius, fornyer stromal celle betinget medium hver uke.Deretter måler du immunoglobulinsekresjonen fra strømningscytometrisorterte plasmaceller. Kultur plasmacellene med en tetthet på en million celler per milliliter i 24 timer og høst kulturen supernatant. Bruk et ELISA-sett til å måle immunglobulin G, og immunglobulin A.First, lanserer GenomicScape open access bioinformatikk webverktøy.I bla gjennom datamenyen velger du datasettet kalt humane B-celler til plasmaceller. Visualisering av genuttrykksprofilen til et unikt gen eller en liste over gener er tilgjengelig ved hjelp av verktøyet Uttrykk/samekspressionrapport i analyseverktøyene. Deretter velger du Analyseverktøy webSAM for å laste inn SAM-verktøyet.Velg de menneskelige B-cellene til plasmaceller datasett og velg gruppen av prøver å sammenligne. Bruk de forskjellige filtrene som er tilgjengelige for å bruke filtreringsalternativene av interesse. Hvis du vil sammenligne genuttrykksprofiler med SAM-verktøyet, endrer du filtreringsalternativene, inkludert endring av brett, antall permutasjoner, falsk oppdagelsesfrekvens og sammenligningstypen.Programvaren vil beregne analysen og gi gener differensialt uttrykt mellom de valgte gruppene. I denne studien undersøkes uttrykksendringene i de epigenetiske faktorene i normal plasmacelledilatering. Ved hjelp av samanalyse i flere klasse anses 71 gener å være signifikant differensialt uttrykt mellom minne B-cellene, preplasmablastene, plasmablastene, de tidlige plasmacellene og benmargsplasmacellene med en falsk oppdagelsesfrekvens på under 5%Minnet B cellestadiet er preget av overuttrykk av 23 epigenetiske spillergener, inkludert 39,13% av histone acetyltransferaser, 30,43% av histonemetyltransferaser , 21,74% av histone demetylaser, 4,35% av metylbindende proteiner og 4,35% av histone deacetylases.14 epigenetiske spillergener er overuttrykt betydelig på preplasmablaststadiet, inkludert 50% av histonmetyltransferaser, 14,28% av DNA metyltransferaser, 21,43% av histone deacetylases, 7,14% av histone demetyler, og 17,14% av histone acetyltransferaser. Etter denne prosedyren kan flere analyser for å identifisere og forstå endringer i kromatinstruktur og arkitektur under disse B2 plasmacelledilatering utføres. Denne in vitro differensieringsmodellen vil tillate å generere nok celler til å fullføre denne molekylære analysen for å avsløre både banene som er involvert i hele modelleringen og deres nedstrøms transkripsjonspåvirkning under B2 plasmacelledilatering.Denne kunnskapen stammer fra denne forskningen kan informere og instruere om diagnostiske og terapeutiske strategier for plasmacelleforstyrrelser, for eksempel i tilfelle av myelomatose, en kreft uten en definitiv kur, som bedre prognose og forbedrede terapeutiske strategier er kritisk nødvendig. Karakterisering og forståelse av epigenetisk ombygging strukturelle og arkitektoniske endringer som påvirker kromatin under B2 plasmacelle differensiering vil være av spesiell interesse. Dette kan gjøres ved hjelp av gensekvensering, ERRBS, ATAC sekvensering, IC og RNA sekvensering.En moderat heterogenitet kan observeres i prosentandelen av aktiverte B-celler, preplasmablaster, plasmablaster og plasmaceller, avhengig av sunn donors blod, som brukes til minne B cellerensing.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generasjon av rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra udødelig Ordnet B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolering av Viral Replication Kammer-beriket Sub-atom Fraksjoner fra Adenovirus-infiserte Normal humane celler

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro Differensiering av Menneskelig CD4 + foxp3 + Induced regulatoriske T-celler (iTregs) fra naive CD4 + T-celler under anvendelse av et TGF-β holdige Protocol