Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por concessões do INCA francês (Institut National du Cancer) Instituto (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e câncer ITMO (MM & TT).

O protocolo segue as diretrizes em conformidade com o acordo do Centro Hospital Universidade de Montpellier para recursos biológicos e a declaração de Helsinque.
1. no modelo de diferenciação de células plasmáticas Vitro Normal
Nota: PCes são gerados através de uma cultura de quatro etapas11,12,13.
<ol><li>
Diferenciação e amplificaçã...

Em humanos, PC são raras células com estágios de diferenciação, ocorrendo em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica. Nós desenvolvemos um B in vitro para PC modelo de diferenciação usando sistemas de cultura de várias etapas onde várias combinações de moléculas de ativação e citocinas posteriormente são aplicadas a fim de reproduzir a diferenciação celular sequencial ocorrendo na diferentes órgãos/tecidos em vivo11,12<...

A diferenciação das células B para células plasmáticas (PCs) é essencial para a imunidade humoral e proteger o hospedeiro contra infecções1. B a diferenciação de PC está associado com grandes mudanças na capacidade de transcrição e metabolismo para acomodar a secreção de anticorpos. Os fatores de transcrição que controlam a B para diferenciação de PC têm sido muito estudados e revelou redes exclusivas incluindo transcrição B PC-específicas e fatores (TFs)2. Em células B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs são os guardiães das células B identidade2,3. Indução de IRF4, PRDM1 , BLIMP1 e XBP1 PC TF de codificação irá extinguir genes de células B e induzir uma coordenada desegregação celular programa transcriptional3,4,5. Essas alterações transcricionais coordenadas estão associadas com a ativação de transcrição de genes de Ig juntamente com um interruptor de forma a membrana-limite para a forma secretada da imunoglobulina cadeia pesada2,3, 4. B para diferenciação de PC está relacionada com a indução de genes envolvidos no retículo endoplasmático e complexo de Golgi funções concomitante com ativação de resposta (UPR) unfolded da proteína conhecida por desempenhar um papel-chave no PC por acomodar a síntese de secretado imunoglobulinas6,7. A XBP1 de TF desempenha um papel importante nesta adaptação celular8,9,10.
As células B e PCs são jogadores-chave da imunidade humoral. Noções básicas sobre o biológico processos que controlam a produção e a sobrevivência das células de plasma normais é crítico em intervenções terapêuticas que precisam assegurar eficientes respostas imunes e prevenir auto-imunidade ou deficiência imunológica. PC são raras células com estágios iniciais de diferenciação que ocorrem em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica, particularmente em humanos. Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, registramos um B in vitro para PC modelo de diferenciação. Este modelo reproduz a diferenciação celular sequencial e maturação ocorrendo em diferentes órgãos em vivo11,12,13. Numa primeira fase, as células de memória B são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts (PrePBs). Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts (PBs) removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidos a se diferenciar em PCs cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter PCs totalmente maduros pelo cultivo destes primeiros PCs com meio condicionados de células do estroma de medula óssea ou selecionado de fatores de crescimento13. Estes PCs maduros podem sobreviver vários meses in-vitro e secretam quantidades elevadas de imunoglobulina (Figura 1). Curiosamente, o nosso modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo do B diferente fases de PC que pode ser detectado em vivo11,12,13,14 ,15. PCs são células raras e nosso modelo de diferenciação in vitro permite estudar B humano para diferenciação de PC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

Os plasmócitos (PCs) secretam grandes quantidades de anticorpos e desenvolver a partir de células B que foram ativadas. PCs são raras células localizadas na medula óssea ou mucosa e garantir imunidade humoral. Devido à sua baixa frequência e localização, o estudo dos PCs é difícil em humanos. Nós relatamos um B para PC modelo de diferenciação in vitro usando combinações selecionadas de citocinas e a ativação de moléculas que permitem reproduzir a diferenciação de células sequenciais ocorrem in vivo. Neste modelo in vitro, células B (MBCs) irão diferenciar em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), cedo PCes de memória e, finalmente, em Long-lived PCs, com um fenótipo perto de suas contrapartes em indivíduos saudáveis,. Também construímos uma acesso aberto bioinformática ferramentas para analisar as informações mais importantes de dados GEP relacionados à diferenciação de PC. Esses recursos podem ser usados para estudar B humano para diferenciação de PC e no atual estudo, investigamos a regulação da expressão gênica de fatores epigenéticos durante B humano para diferenciação de PC.

O procedimento geral de diferenciação in vitro de PC normal é representado na Figura 1. Usando o protocolo apresentado aqui, nós poderia gerar uma quantidade adequada de células que não pode ser obtido com ex vivo amostras humanas. Embora o papel da rede complexa de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação do PC tem sido investigado, os mecanismos de regulação principais redes de transcrição de diferenciação de PC permanecem pouco co...

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In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

As células plasmáticas são células raras com 30 estágios de diferenciação que ocorrem em locais anatômicos que prejudicam a caracterização biológica completa, particularmente no ser humano. Nosso modelo de diferenciação de células plasmáticas B2 in vitro reproduz a diferenciação e maturação celular sequencial que ocorrem nos diferentes órgãos in vivo. Este modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo dos diferentes estágios das células plasmáticas B2 que podem ser detectados in vivo.Também construímos uma ferramenta bioinformática de acesso aberto para analisar as informações mais proeminentes de dados de exploração relacionados à diferenciação de células plasmáticas. Demonstrando o procedimento será Hugues de Boussac, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, obtenha células sanguíneas periféricas de voluntários saudáveis para purificação celular da memória B.Diluir 7,5 mililitros de sangue com 24,5 mililitros de RPMI 1640 médio. Em seguida, adicione 12,5 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente a um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Sobreponha suavemente o gradiente de densidade com os 32 mililitros de sangue diluído, certificando-se de minimizar a mistura das duas fases.Centrífuga por 20 minutos a 500 vezes a gravidade com o freio desligado. Coletar as células mononucleares de sangue periféricos da interface de plasma diluído e gradiente de densidade. Transfira as células para um tubo estéril de 50 mililitros e encha o tubo até 45 mililitros com a Solução de Sal Balanceado da Hank.Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Em seguida, adicione 45 mililitros de RPMI 1640 médio, complementado com 10% de FCS.Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Adicione 30 mililitros de PBS, complementados com 2%de FCS.Use contas magnéticas anti-CD para remover células CD2 positivas adicionando quatro contas para uma célula alvo. Incubar a 4 graus Celsius por 30 minutos. Usando um ímã para aplicação de separação celular, separe as células ligadas às contas das células desvinculadas.Colete as células desvinculas e incuba-as com anticorpos anti-CD19 APC e anti-CD27 PE por quinze minutos a quatro graus Celsius. Lave as células duas vezes em PBS contendo 10% de soro de cabra. Em seguida, use o classificador de células para purificar as células B da memória a uma pureza de 95%.Depois disso, adicione ligante CD40 solúvel e anticorpo monoclonal anti-polihistidina para ativação celular B de memória. Plaque as células B de memória purificada em placas de cultura de seis poços durante quatro dias com interleucina-2, interleucina-10 e interleucina-15. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os préplasmablasts CD38 negativos CD38-negativos no quarto dia.No quarto dia, conte as células e as emplaque em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 250.000 células por mililitro adicionando dois mililitros de suspensão celular em cada poço. Para induzir a diferenciação, remova os oligonucleotídeos CPG e o ligante CD40 solúvel e adicione um novo meio de cultura contendo um novo coquetel de citocina, incluindo interleucina-2, interleucina-6, interleucina-10 e interleucina-15. Cultue as células por três dias a 37 graus Celsius.Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os plasmablastos de plasma CD38 positivos e CD20 negativos no sétimo dia. No sétimo dia, conte as células. Plaque as células em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço.Diferencie os plasmablastos em células plasmáticas precoces usando meio de cultura fresco contendo interleucina-6, interleucina-15 e interferon-alfa por três dias a 37 graus Celsius. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar as células plasmáticas iniciais CD20-negativas, CD38-positivas, CD138 no dia 10. Primeiro, as células estrogonais da cultura por cinco dias com o meio da cultura.Use um filtro de 0,2 microliter para filtrar a cultura celular escrumal para obter o meio econsciente condicionado à célula estromada e congelar até estar pronto para usar. Em seguida, cultue as primeiras células plasmáticas em placas de cultura de 12 poços, usando o meio de células estromicinas previamente obtidas com interleucina-6 e ABRIL a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço. Incubar a 37 graus Celsius, renovando o meio condicionado de células estromas a cada semana.Em seguida, meça a secreção de imunoglobulina a partir de células plasmáticas classificadas por citometria de fluxo. Cultue as células plasmáticas a uma densidade de um milhão de células por mililitro por 24 horas e colmeia a cultura sobrenatária. Usando um kit ELISA, meça a imunoglobulina G e a imunoglobulina A.First, inicie a ferramenta web de bioinformática de acesso aberto GenomicScape.No menu de dados de navegação, selecione o conjunto de dados chamado células B humanas para células plasmáticas. A visualização do perfil de expressão genética de um gene ou lista de genes únicos está disponível usando a ferramenta Expression/Coexpression Report nas Ferramentas de Análise. Em seguida, selecione Ferramentas de análise webSAM para carregar a ferramenta SAM.Escolha as células B humanas para o conjunto de dados das células plasmáticas e selecione o grupo de amostras para comparar. Use os diferentes filtros disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse. Para comparar perfis de expressão genética com a ferramenta SAM, modifique as opções de filtragem, incluindo alteração de dobra, número de permutações, taxa de detecção falsa e o tipo de comparação.O software calculará a análise e fornecerá genes expressos diferencialmente entre os grupos selecionados. Neste estudo, são investigadas as alterações de expressão dos fatores epigenéticos na diferenciação normal das células plasmáticas. Usando a análise sam multi-classe, 71 genes são vistos como significativamente expressos diferencialmente entre as células B da memória, os preplasmablasts, os plasmablastos, as células plasmáticas primitivas e as células plasmáticas da medula óssea com uma falsa taxa de descoberta de menos de 5%O estágio da célula B da memória é caracterizado pela superexpressão de 23 genes de jogadores epigenéticos, incluindo 39,13% de acetiltransferases histonas, 30,43% de histona metiltransferases , 21,74% das demetiláases de histona, 4,35% das proteínas de ligação de metila e 4,35% das deacetilases de histona.14 genes de reprodução epigenética são superexpressos significativamente na fase pré-plasmablast, incluindo 50% das histonas metiltransferases, 14,28% das metiltransferases de DNA, 21,43% das deacetillases histonas, 7,14% das demetilases de histona e 17,14% das acetiltransferases de histona. Após este procedimento, várias análises para identificar e entender modificações na estrutura e arquitetura da cromatina durante essas diferenciações de células plasmáticas B2 poderiam ser realizadas. Este modelo de diferenciação in vitro permitirá gerar células suficientes para completar esta análise molecular para revelar tanto os caminhos envolvidos em toda essa modelagem quanto seu impacto transcricional a jusante durante a diferenciação de células plasmáticas B2.Esse conhecimento derivado desta pesquisa poderia informar e instruir sobre estratégias diagnósticas e terapêuticas para distúrbios celulares plasmáticas, como no caso do mieloma múltiplo, um câncer sem cura definitiva, para o qual melhores prognósticos e melhores estratégias terapêuticas são criticamente necessárias. Caracterizar e compreender as mudanças estruturais e arquitetônicas de remodelação epigenética que afetam a cromatina durante a diferenciação de células plasmáticas B2 será de particular interesse. Isso poderia ser feito usando sequenciamento genético, ERRBS, sequenciamento ATAC, IC e sequenciamento de RNA.Uma heterogeneidade moderada poderia ser observada na porcentagem de células B ativadas, preplasmablasts, plasmablastos e células plasmáticas, dependendo do sangue saudável do doador, usado para purificação celular B da memória.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...