Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантов от французского ИНКОВ (Институт национального du рака) институт (PLBIO15-256), НРУ (галстук-скип) и НИУ ИТМО рака (мм & TT).

Протокол придерживается руководящих принципов, в соответствии с Хельсинкской декларации и соглашения центра больницы университета Монпелье биологических ресурсов.
1. в Vitro нормальной клетки плазмы дифференциация модели
Примечание: Компьютеры со...

В человека PC являются редкими клетки с этапами дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологической характеристике. Мы разработали в пробирке B PC дифференциация модель с использованием культуры многоступенчатой системы, где различные комби?...

Дифференцировки лимфоцитов в плазматические клетки (шт) имеет важное значение для гуморального иммунитета и защиты узла против инфекций1. B для PC дифференциация ассоциируется с значительные изменения в транскрипции потенциала и метаболизм для размещения до антитела секрецию. Факторы транскрипции, которые контролируют Б PC дифференциации широко изучены и выявлены эксклюзивные сетей, в том числе B - и PC-определенного транскрипции факторы (TFs)2. В B-клеток PAX5, BCL6 и BACH2 TFs являются хранителями клетки B личность2,3. Индукции IRF4, PRDM1 кодировки BLIMP1 и XBP1 PC TF будет потушить B клетки генов и побудить скоординированного антитела секретирующих клеток транскрипционный анализ программы3,4,5. Эти скоординированные транскрипционный анализ изменения связаны с активацией транскрипции генов Ig вместе с переход от мембраны Присоединенная форма выделяется форму иммуноглобулин тяжелые цепи2,3, 4. B PC дифференциации связан с индукции генов, участвующих в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи функции сочетанной с активацией ответ (УНР) разворачивались белка известен играть ключевую роль в ПК путем размещения синтез выделяется иммуноглобулины6,7. TF XBP1 играет важную роль в этой клеточной адаптации8,9,10.
B клетки и ПК являются ключевыми игроками гуморального иммунитета. Понимание биологических процессов, управления, производства и выживания нормальных клеток плазмы имеет решающее значение в терапевтических вмешательств, которые нужны для обеспечения эффективного иммунного ответа и предотвратить аутоиммунных заболеваний или иммунодефицит. PC являются редкими клетки с ранних стадиях дифференцировки происходящих в анатомических местах, которые препятствуют полной биологических характеристик, особенно в человека. С помощью системы многоступенчатого культуры, мы сообщали в пробирке B PC дифференциация модели. Эта модель воспроизводит последовательных ячеек дифференцировки и созревания, происходящих в различных органах в vivo11,12,13. В качестве первого шага клетки памяти B сначала активируются для четырех дней CD40 лиганд, oligodeoxynucleotides и цитокина комбинации и дифференцироваться в preplasmablasts (PrePBs). В качестве второго шага preplasmablasts вынуждены дифференцироваться в plasmablasts (PBs) путем удаления CD40L и oligodeoxynucleotides стимуляции и изменения цитокинов комбинации. В качестве третьего шага plasmablasts вынуждены дифференцироваться в начале ПК, изменив цитокина сочетание11,12. Четвертый шаг был введен получить полностью зрелые ПК путем культивирования этих ранних ПК с костного стромальные клетки кондиционером среднего или выбранные факторы роста13. Эти пожилые ПК могут выжить несколько месяцев в пробирке и выделяют большое количество иммуноглобулина (рис. 1). Интересно, что наши экстракорпоральное моделью резюмирует скоординированных transcriptional изменений и фенотип различных B PC этапов, которые могут быть обнаружены в естественных условиях11,12,13,14 ,15. Компьютеры являются редкие клетки и наша модель в пробирке дифференциация позволяет изучить человека B PC дифференциации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

Клетки плазмы (шт) выделяют большое количество антител и развиваются из клеток B, которые были активированы. Компьютеры являются редкие клеток, расположенных в костный мозг или слизистую оболочку и обеспечить гуморального иммунитета. Из-за их низкой частоты и местоположение, трудно изучение ПК в человека. Мы сообщили B для ПК модель в пробирке дифференциации, с использованием выбранных комбинаций цитокинов и активация молекул, которые позволяют воспроизводить последовательный клеточная дифференцировка, происходящих в естественных условиях. В этой модели в пробирке, памяти, клетки B (MBCs) будет дифференцироваться в предварительно plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), рано ПК и наконец, в долгоживущих ПК, с фенотипом близко к их коллег в здоровых индивидуалах. Мы также построили открытый доступ Биоинформатика инструменты для анализа наиболее известных информации от GEP данные, относящиеся к ПК дифференциации. Эти ресурсы могут использоваться для изучения человека B ПК дифференциации и в текущем исследовании, мы исследовали регулирование выражение гена эпигенетических факторов во время человека B PC дифференциации.

Общая процедура экстракорпорального нормальный PC дифференциации представлена на рисунке 1. С использованием протокола, представленные здесь, мы могли бы генерировать достаточное количество клеток, которые не могут быть получены с ex vivo человека образ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

С помощью системы многоступенчатого культуры, мы доклад в vitro клетки B модели дифференцировки клеток плазмы.

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Плазменные клетки являются редкими клетками с 30 этапами дифференциации, происходящими в анатомические места, которые ухудшают полную биологическую характеристику, особенно у человека. Наша модель дифференциации плазменных клеток in vitro B2 воспроизводит последовательных клеточных дифференциаций и созревания, происходящих в различных органах in vivo. Эта модель in vitro резюмирует скоординированные транскрипционные изменения и фенотип различных стадий плазменных клеток B2, которые могут быть обнаружены in vivo.Мы также создали биоинформатические инструменты открытого доступа для анализа наиболее известных информации из данных разведки, связанных с дифференциацией плазменных клеток. Демонстрация процедуры будет Хьюг де Boussac, postdoc из моей лаборатории. Для начала, получить периферические клетки крови от здоровых добровольцев для очистки клеток памяти В.Разбавить 7,5 миллилитров крови с 24,5 миллилитров RPMI 1640 среды. Затем добавьте 12,5 миллилитров градиента плотности комнатной температуры в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку. Аккуратно наложить градиент плотности с 32 миллилитров разбавленной крови, убедившись, чтобы свести к минимуму смешивание двух фаз.Центрифуга в течение 20 минут при 500-времени тяжести с выключенным тормозом. Соберите периферические моноядерные клетки крови из разбавленного интерфейса градиента плазмы и плотности. Перенесите клетки в стерильную 50-миллилитровую трубку и заполните трубку до 45 миллилитров сбалансированным соленым раствором Хэнка.Центрифуга при 500-времени гравитации в течение пяти минут. Аккуратно удалите супернатант и держите гранулы. Затем добавьте 45 миллилитров rpMI 1640 среды, дополненные 10%FCS.Центрифуга при 500-времени гравитации в течение пяти минут. Аккуратно удалите супернатант и держите гранулы. Добавьте 30 миллилитров PBS, дополненных 2%FCS.Используйте анти-CD магнитные бусы для удаления CD2-положительных клеток, добавив четыре бусинки для одной целевой ячейки. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Используя магнит для приложения разделения клеток, отделяйте клетки, связанные бисером, от неограниченных ячеек.Соберите неограниченные клетки и инкубировать их анти-CD19 APC и анти-CD27 PE антител в течение пятнадцати минут при четырех градусах по Цельсию. Вымойте клетки дважды в PBS, содержащий 10%goat сыворотки. Затем используйте сортер клеток, чтобы очистить клетки памяти В до 95%чистоты.После этого добавьте растворимые лиганд CD40 и анти-полихистидин моноклональные антитела для активации клеток памяти В. Плита очищенных клеток памяти В в шести-хорошо культуры пластин в течение четырех дней с интерлеукин-2, интерлеукин-10 и интерлеукин-15. Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD38-отрицательных преплазмабластов CD20 на четвертый день.На четвертый день, подсчитайте клетки и пластины их в 12-хорошо культуры пластин при плотности клеток 250000 клеток на миллилитр, добавив два миллилитров клеточной суспензии в каждой хорошо. Чтобы вызвать дифференциацию, удалите олигонуклеотиды CPG и растворимый лиганд CD40 и добавьте новую культурную среду, содержащую новый цитокиновый коктейль, включающий интерлейкин-2, интерлеукин-6, интерлеукин-10 и интерлеукин-15. Культура клеток в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию.Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD38-положительных плазменныхбластов CD20 на седьмой день. На седьмой день посчитайте камеры. Плита клеток в 12-хорошо культуры пластин при плотности клеток 500000 клеток на колодец, добавив два миллилитров клеточной подвески к каждой хорошо.Дифференцируйте плазменные пластины на ранние плазменные клетки, используя свежую культурную среду, содержащую интерлеукин-6, интерлеукин-15 и интерферон-альфа в течение трех дней при 37 градусах Цельсия. Для профилирования экспрессии генов используйте сортер клеток для очистки CD20-отрицательных, CD38-положительных, CD138-положительных ранних плазменных клеток в день 10. Во-первых, культура стромальных клеток в течение пяти дней с культурой среды.Используйте 0,2-микролитровый фильтр для фильтрации стромальной клеточной культуры супернатанта для получения стромальной клетки кондиционированной среды и заморозить до готовности к использованию. Далее, культура ранних плазменных клеток в 12-хорошо культуры пластин, используя ранее полученные стромальные клетки среды с интерлейкин-6 и APRIL при плотности клеток 500000 клеток на колодец, добавив два миллилитров клеточной суспензии к каждой хорошо. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию, обновляя стромальные клетки кондиционированной среде каждую неделю.Затем измерьте секрецию иммуноглобулина из цитометрии потока отсортированных плазменных клеток. Культура плазменных клеток при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в течение 24 часов и урожай культуры supernatant. Используя комплект ELISA, измерьте иммуноглобулин G и иммуноглобулин A.First, запустите веб-инструмент GenomicScape открытого доступа к биоинформатике.В меню данных просмотра выберите набор данных, названный клетками группы В человека, в плазменные клетки. Визуализация профиля экспрессии генов уникального гена или списка генов доступна с помощью инструмента Expression/Coexpression Report в инструментах анализа. Далее выберите Analysis Tools webSAM для загрузки инструмента SAM.Выберите человеческие В-клетки для набора данных плазменных клеток и выберите группу образцов для сравнения. Используйте различные фильтры, доступные для применения вариантов фильтрации, представляющих интерес. Чтобы сравнить профили экспрессии генов с инструментом SAM, измените параметры фильтрации, включая изменение складок, количество перестановок, скорость ложных открытий и тип сравнения.Программное обеспечение будет вычислять анализ и предоставлять гены, дифференцированно выраженные между выбранными группами. В этом исследовании исследованы экспрессионные изменения эпигенетических факторов в нормальной дифференциации плазменных клеток. Используя многоклассный анализ SAM, 71 ген, как видно, значительно дифференциально выражен между клетками памяти В, преплазмабласты, плазмабласты, ранние плазматические клетки и плазменные клетки костного мозга с ложной скоростью открытия менее 5%Стадия В-клеток памяти характеризуется переэкспрессией 23 генов эпигенетических игроков, в том числе 39,13% гистона ацетилтрансферазы, 30,43% его метилтрансферазы , 21,74% деметилаза гистона, 4,35% метил связывающих белков и 4,35% деацетилаз гистона.14 генов эпигенетических игроков значительно переэкспрессированы на стадии преплазмабласта, в том числе 50% гистона метилтрансферазы, 14,28% метилтрансфераз ДНК, 21,43% гистона деацетилазы, 7,14% гистона деметилазы, и 17,14% гистонов ацетилтрансаза. После этой процедуры, несколько анализов для выявления и понимания изменений в структуре хроматина и архитектуры во время этих B2 дифференциации плазменных клеток может быть выполнена. Эта модель дифференциации in vitro позволит генерировать достаточное количество клеток для завершения этого молекулярного анализа, чтобы выявить как пути, участвующие во всем этом моделировании, так и их влияние транскрипции ниже по течению во время дифференциации плазменных клеток B2.Эти знания, полученные в результате этого исследования может информировать и инструктировать по диагностическим и терапевтическим стратегиям для плазменных клеток расстройств, таких, как в случае множественной миеломы, рак без окончательного лечения, для которого лучше прогноз и улучшение терапевтических стратегий крайне необходимы. Особый интерес представляет характеристика и понимание эпигенетических ремоделирования структурных и архитектурных изменений, влияющих на хроматин при дифференциации плазменных клеток В2. Это можно сделать с помощью секвенирования генов, ERRBS, секвенирования ATAC, IC и секвенирования РНК.Умеренная неоднородность может наблюдаться в процентном соотношении активированных В-клеток, преплазмабластов, плазменныхбластов и плазменных клеток, в зависимости от крови здорового донора, используемой для очистки клеток памяти В.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In Vitro Дифференциация человеческого CD4 + FOXP3 + Индуцированные регуляторных Т - клеток (iTregs) от наивных CD4 + Т - клеток с использованием TGF-β-содержащего протокол