Name: in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från franska INCA (Institut National du Cancer) Institutet (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) och ITMO Cancer (MM & TT).

Protokollet följer riktlinjer enligt Helsingforsdeklarationen och överenskommelsen av Montpellier universitet sjukhus centrum för biologiska resurser.
1. i Vitro Normal Plasma Cell differentiering modell
Obs: Datorer genereras genom en fyra steg kultur11,12,13.
<ol><li>
B-cell amplifiering och differentiering
	<ol>
<li>Använd perifert...

I mänskliga, PC är sällsynta celler med differentiering arrangerar äger rum i anatomiska platser som hindrar fullständig biologisk karakterisering. Vi har utvecklat en in vitro-B i PC differentiering modell med flera steg kultur system där olika kombinationer av aktiveringen molekyler och cytokiner tillämpas därefter för att reproducera den sekventiella celldifferentiering som förekommer i den olika organ/vävnader i vivo11,12,<sup class="xre...

Differentieringen av B-celler till plasmaceller (st) är viktigt för humoral immunitet och skydda värden mot infektioner1. B till PC differentiering är förknippat med stora förändringar i transkription kapacitet och metabolism för att rymma till antikropp sekretion. De transkriptionsfaktorer som styr B till PC differentiering har studerats och avslöjade exklusiva nätverk inklusive B - och PC-specifika transkription faktorer (TFs)2. I B-celler är PAX5, BCL6 och BACH2 TFs väktare av B-cell identitet2,3. Induktion av IRF4, PRDM1 BLIMP1 och XBP1 PC TF-kodning kommer att släcka B cell gener och framkalla en samordnad antikropp-utsöndrar cell transkriptionell program3,4,5. Dessa samordnade transkriptionell förändringar är associerade med Ig gener transkription aktivering tillsammans med en switch från formuläret membran-bundna till formuläret utsöndras av immunglobulin tung kedja2,3, 4. B till PC differentiering är länkad med induktion av gener involverade i endoplasmatiska retiklet och Golgi apparaten fungerar samtidig med ovikta protein svar (UPR) aktiveringen känd för att spela en nyckelroll i PC av tillmötesgående syntesen av utsöndras immunglobuliner6,7. Den TF XBP1 spelar en viktig roll i denna cellulära anpassning8,9,10.
B-celler och datorer är nyckelaktörer av humorala immuniteten. Förstå biologiska processer som styr produktionen och överlevnaden av normala plasma celler är kritisk i terapeutiska interventioner som behöver säkerställa effektivt immunsvar och förhindra autoimmunitet eller immunbrist. PC är sällsynta celler med differentiering tidigt äger rum på anatomiska platser som hindrar fullständig biologisk karakterisering, särskilt i mänskliga. Använda flera steg kultur system, har vi rapporterat en in vitro-B till PC differentiering modell. Denna modell återger den sekventiella celldifferentiering och mognad som förekommer i de olika organ i vivo11,12,13. I ett första steg, minne B celler aktiveras först fyra dagar av CD40 ligand, oligodeoxynucleotides och cytokin kombination och differentieras till preplasmablasts (PrePBs). I ett andra steg förmås preplasmablasts att differentieras till plasmablasts (PBs) genom att ta bort CD40L och oligodeoxynucleotides stimulering och ändra kombinationen cytokin. I ett tredje steg induceras plasmablasts differentieras till tidiga datorer genom att ändra de cytokin kombination11,12. Ett fjärde steg infördes för att få fullt mogen datorer genom att odla dessa tidiga datorer med benmärgens stromaceller luftkonditionerade medium eller valda tillväxtfaktorer13. Dessa mogna datorer kunde överleva flera månader in vitro- och utsöndrar stora mängder immunglobulin (figur 1). Intressant, recapitulates vår in vitro-modell samordnade transkriptionell ändringarna och fenotypen av olika B till PC-stadier som kan vara upptäckta invivo11,12,13,14 ,15. Datorer är sällsynta celler och vår in vitro-differentiering modell gör det möjligt för att studera mänskliga B till PC differentiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:817px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-CD2 magnetic beads</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11159D</td>
			<td style="width:344px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD138-APC</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD19-APC</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD20-PB</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B49208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD27-PE</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-CD38-PE</td>
			<td style="width:139px;">Beckman-Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A07779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-histidine</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CpG ODN(PT)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* 
			G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">human Transferin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN-&#945;</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td>Intron A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IMDM</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31980-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinan Human CD40L-hi</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>2706-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human APRIL</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5860-AP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-10</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human IL-15</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-15-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IL-6</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation model of human normal memory b cells to long-lived plasma cells

Plasma celler (st) utsöndrar stora mängder antikroppar och utveckla från B-celler som har aktiverats. Datorer är sällsynta celler i benmärgen eller slemhinna och säkerställa humorala immuniteten. På grund av deras lågfrekventa och läge, studiet av datorer är svårt i mänskliga. Vi rapporterade ett B till PC in vitro-differentiering modell med valda kombinationer av cytokiner och aktivering molekyler som möjligt för att reproducera den sekventiella celldifferentiering inträffar invivo. I denna in vitro-modell, minne B-celler (MBCs) kommer att differentieras till före plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), tidigt datorer och slutligen in i långlivade nära datorer, med en fenotyp sina motsvarigheter hos friska individer. Vi har också byggt en öppen tillgång bioinformatik verktyg för att analysera de mest framträdande informationen från GEP data relaterade till PC differentiering. Dessa resurser kan användas för att studera mänskliga B till PC differentiering och i den aktuella studien, undersökte vi gen uttryck regleringen av epigenetiska faktorer under mänskliga B till PC differentiering.

Det övergripande förfarandet av in vitro-normala PC differentiering är representerade i figur 1. Med hjälp av protokollet som presenteras här, kan vi generera tillräcklig mängd celler som inte kunde erhållas med ex vivo mänskliga prover. Även om rollen av det komplexa nätverket av transkriptionsfaktorer som är inblandade i PC differentiering har undersökts, fortfarande de mekanismer som reglerar viktiga PC differentiering transkription nätverk d...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Använda flera steg kultur system, rapportera vi en in vitro-B-cellen till plasma cell differentiering modell.

I Vitro differentiering modell av människans normala minne B celler att långlivade plasmaceller

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Plasmaceller är sällsynta celler med 30 differentieringsstadier som äger rum på anatomiska platser som försämrar full biologisk karakterisering, särskilt i mänskliga. Vår in vitro B2 plasma cell differentiering modell återger sekventiella cell differentiering och mognad förekommer i de olika organen in vivo. Denna in vitro-modell rekapulerar de samordnade transkriptionella förändringarna och fenotypen av de olika B2-plasmacellsstadier som kan detekteras in vivo.Vi byggde också en open-access bioinformatiska verktyg för att analysera de mest framträdande informationerna från prospekteringsdata relaterade till plasma celldifferentiering. Demonstrera förfarandet kommer att Hugues de Boussac, en postdoc från mitt laboratorium. Till att börja, erhålla perifera blodkroppar från friska frivilliga för minne B cell rening.Späd 7,5 milliliter blod med 24,5 milliliter RPMI 1640 medium. Lägg därefter till 12,5 milliliter av rumstemperaturdensitetsgradient till ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter. Försiktigt överlägg densitetsgradienten med de 32 milliliter av utspädd blod, se till att minimera blandningen av de två faserna.Centrifugera i 20 minuter vid 500 gånger gravitation med bromsen av. Samla upp de mononukleära cellerna för perifert blod från det utspädda gränssnittet för plasma och densitetsgradient. Överför cellerna till ett sterilt 50-milliliterrör och fyll röret upp till 45 milliliter med Hank's Balanced Salt Solution.Centrifugera vid 500 gånger gravitation i fem minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och behåll pelleten. Lägg sedan till 45 milliliter RPMI 1640 medium, kompletterat med 10%FCS.Centrifugera vid 500 gånger gravitation i fem minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och behåll pelleten. Tillsätt 30 milliliter PBS, kompletterat med 2%FCS.Använd anti-CD magnetiska pärlor för att ta bort CD2-positiva celler genom att lägga till fyra pärlor för en målcell. Inkubera vid fyra grader Celsius i 30 minuter. Med hjälp av en magnet för cellseparation ansökan, separera de pärla-bundna celler från de obundna celler.Samla de obundna cellerna och inkubera dem med anti-CD19 APC och anti-CD27 PE antikroppar för femton minuter vid fyra grader Celsius. Tvätta cellerna två gånger i PBS som innehåller 10%getserum. Sedan använder cell sorteraren för att rena minnes B-cellerna till en 95%-renhet.Efter detta, lägga till lösliga CD40 ligand och anti-polyhistidine monoklonal antikropp för minne B cell aktivering. Plate de renade minnes B-cellerna i sex-brunns odlingsplattor i fyra dagar med interleukin-2, interleukin-10 och interleukin-15. För profilering av genuttryck, använd en cellsorterare för att rena cd38-negativa CD20-negativa preplasmablaster på dag fyra.På dag fyra, räkna cellerna och platta dem i 12-brunns odlingsplattor vid en celltäthet på 250, 000 celler per milliliter genom att lägga till två milliliter cell suspension i varje brunn. För att inducera differentiering, ta bort CPG oligonukleotid och lösliga CD40 ligand och lägga till nya odlingsmedium som innehåller en ny cytokin cocktail inklusive interleukin-2, interleukin-6, interleukin-10 och interleukin-15. Odla cellerna i tre dagar vid 37 grader Celsius.För profilering av genuttryck, använd en cellsorterare för att rena de CD38-positiva, CD20-negativa plasmablasterna på dag sju. På dag sju, räkna cellerna. Platta cellerna i 12-brunns odlingsplattor vid en celltäthet på 500 000 celler per brunn, genom att lägga till två milliliter cellfjädring till varje brunn.Differentiera plasmablasterna till tidiga plasmaceller med hjälp av färskt odlingsmedium som innehåller interleukin-6, interleukin-15 och interferon-alfa i tre dagar vid 37 grader Celsius. För profilering av genuttryck, använd en cellsorterare för att rena de CD20-negativa, CD38-positiva, CD138-positiva tidiga plasmacellerna vid dag 10. Först, kultur stromal celler i fem dagar med odlingsmedium.Använd ett 0,2-mikroliterfilter för att filtrera den stromala cellkulturens supernatant för att erhålla stromalcell betingat medium och frysa tills det är klart att användas. Därefter odlar de tidiga plasmacellerna i 12-brunnskulturplattor, med hjälp av det tidigare erhållna stromalcellsmediet med interleukin-6 och APRIL vid en celltäthet på 500 000 celler per brunn, genom att lägga till två milliliter cellfjädring till varje brunn. Inkubera vid 37 grader Celsius, förnya stromalcellen konditionerat medium varje vecka.Sedan, mäta immunglobulin sekretion från flöde cytometri sorterade plasmaceller. Odla plasmacellerna med en densitet på en miljon celler per milliliter i 24 timmar och skörda kulturens supernatant. Med hjälp av en ELISA kit, mäta immunglobulin G, och immunglobulin A.First, lansera GenomicScape open access bioinformatics webbverktyg.I menyn bläddra i data markerar du datamängden med namnet mänskliga B-celler till plasmaceller. Visualisering av genuttrycksprofilen för en unik gen eller en lista över gener finns tillgänglig med hjälp av verktyget Expression/Coexpression Report i analysverktygen. Därefter väljer du Analysverktyg webSAM för att ladda SAM-verktyget.Välj de mänskliga B-cellerna till plasmaceller datauppsättning och välj den grupp av prover att jämföra. Använd de olika filter som finns för att tillämpa filtreringsalternativen av intresse. Om du vill jämföra profiler för genuttryck med SAM-verktyget ändrar du filtreringsalternativen inklusive vikändring, antal permutationer, falsk identifieringsfrekvens och typ av jämförelse.Programvaran kommer att beräkna analysen och ge gener differentiellt uttryckt mellan de valda grupperna. I denna studie undersöks uttrycksförändringarna av de epigenetiska faktorerna vid normal plasmacellsdifferentiering. Med hjälp av SAM-analys i flera klasser ses 71 gener vara signifikant differentiellt uttryckta mellan minnes B-cellerna, preplasmablasterna, plasmablasterna, de tidiga plasmacellerna och benmärgsplasmacellerna med en falsk upptäcktsfrekvens på under 5%Minnes B-cellsteget kännetecknas av överuttryck av 23 epigenetiska spelargener, inklusive 39,13%av histonacetyltransferaser, 30,43%av hitonmetyltransaseraser, inklusive 39,13%av histonacetyltransferaser, 30,43%av hitonmetyltransferaser, inklusive 39,13%av histonacetyltransferas, 30,43%av hitonmetyltransferaser, 30,43%av hitonmetyltransferaser, 30,43%av hitonmetyltransferaser, inklusive 39,13%av histonacetylfastaser, 30,43%av hitonmetyltransferaser, 30,43%av hitonmetyltransferaser, inklusive 39,13%av histonacetylfastass , 21,74%av histondeetylaser, 4,35% av metylbindande proteiner, och 4,35% av histondeacetyllases.14 epigenetiska spelargener överuttrycks avsevärt vid preplasmablaststadiet, inklusive 50%av histonmetyltransferaser, 14,28%av DNA-metyltransferaser, 21,43%av hiton deacetylases, 7,14%av histone demethylases och 17,14%av histone acetyltransferases. Efter denna procedur, flera analyser för att identifiera och förstå ändringar i kromatin struktur och arkitektur under dessa B2 plasma cell differentiering kunde utföras. Denna in vitro-differentieringsmodell kommer att göra det möjligt att generera tillräckligt med celler för att slutföra denna molekylära analys för att avslöja både de vägar som är involverade i hela denna modellering och deras nedströms transkriptionell påverkan under B2 plasma cell differentiering.Denna kunskap som härrör från denna forskning skulle kunna informera och instruera om diagnostiska och terapeutiska strategier för plasma cell störningar, såsom i fallet med multipelt myelom, en cancer utan ett definitivt botemedel, för vilka bättre prognos och förbättrade terapeutiska strategier är kritiskt behövs. Att karakterisera och förstå de epigenetiska omdanande strukturella och arkitektoniska förändringar som påverkar kromatin under B2-plasmacellsdifferentiering kommer att vara av särskilt intresse. Detta kan göras med hjälp av gensekvensering, ERRBS, ATAC sekvensering, IC och RNA sekvensering.En måttlig heterogenitet kunde observeras i andelen aktiverade B-celler, preplasmablaster, plasmablasts och plasmaceller, beroende på friska givarens blod, används för minne B cell rening.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Isolering av Viral Replication Fack-berikade underkärn Fraktioner från adenovirus-infekterade Normal humana celler

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro-differentiering av humana CD4 + Foxp3 + Induced regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + -T-celler med ett TGF-β-innehållande protokoll