Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ 1UO1CA224160؛ قسم جراحة الأعصاب؛ قلوب في ليا سعيدة ب M.G.C. و P.R.L.؛ و "الجيش الملكي النيبالي" الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. جيه بي أيده وزارة الرياضة الأرجنتينية فولبرايت وزمالة التعليم.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميتشيغان.
1-جيل نيوروسفيريس ورم الدماغ مستمدة من طراز الماوس
<ol><li>قبل إجراء التشريح، تحضير الخلايا الجذعية العصبية الوسائط (وسائط الإعلام في مجلس الأمن القومي: DMEM/F12 مع 1 x B27 الملحق 1 x ...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة تنوعاً واستنساخه لأداء immunohistochemistry على الدبقي جزءا لا يتجزأ من البارافين NS، التي تحافظ على هيكل ثلاثي الأبعاد المميزة للخلايا السرطانية في النمو في الدماغ في الموقع. يملك هذا الأسلوب الميزات التالية عبر استخدام خلايا مطلي على الزجاج أو الأسطح البلا...

Gliomas هي الأورام الصلبة الأولية من الجهاز العصبي المركزي مصنفة حسب خصائصها المظهرية وأوضح وفقا "منظمة الصحة العالمية"1. ويتضمن هذا التصنيف وجود أو عدم وجود برنامج تشغيل الطفرات، التي تمثل مصدرا جذاباً للمؤشرات الحيوية2. المؤشرات الحيوية هي الخصائص البيولوجية التي يمكن قياسها وتقييمها للإشارة إلى العمليات العادية والمرضية، فضلا عن الاستجابات الدوائية إلى تدخل علاجي3. ويمكن الكشف عن المؤشرات الحيوية في ورم الأنسجة والخلايا المشتقة من الدبقي، تمكين توصيفه البيولوجية في جوانب مختلفة. وتشمل بعض الأمثلة للمؤشرات الحيوية الدبقي نازعة إيسوسيتراتي تحور 1 (IDH1)، إنزيم متحولة مميزة من الصف السفلي gliomas المرتبطة بأفضل تنبؤ4. أعربت مرارا عن IDH1 تحور في تركيبة مع TP53 ومتلازمة التخلف العقلي ألفا-الثلاسيميا/العقلية المرتبطة بالعاشر (أتركس)--تعطيل الطفرات، تعريف الدبقي محددة النوع الفرعي4،5. الطفرات أتركس يخمد أيضا تحدث في 44% لطب الأطفال جليوماس عالية الجودة2،6 وارتبطت بالأورام العدوانية وعدم الاستقرار المجيني6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، يميز طب الأطفال منتشر الجوهرية البوتانية gliomas (ديبج) في مجموعات فرعية وفقا لوجود أو عدم وجود طفرة K27M في هيستون H3 جين H3F3A، أو في1،جين HIST1H3B/ج6. ولذلك، الأخذ بتوصيف جزيئي يسمح التقسيم، والدراسة، ومعاملة gliomas ككيانات منفصلة، التي سوف تسمح أكثر بتطوير أكثر يستهدف العلاج لكل نوع فرعي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل المؤشرات الحيوية لتقييم العمليات البيولوجية المختلفة مثل المبرمج8أوتوفاجي9، تقدم دورة الخلية10، خلية انتشار11وتمايز الخلايا12 .
النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التي تأوي الآفات الوراثية موجودة في السرطانات البشرية حاسمة بالنسبة للدراسة من إشارات المسارات التي تتوسط تطور المرض. وقد نفذت مختبرنا استخدام نظام ترانسبوساسي النوم الجمال (SB) لتطوير نماذج الماوس المهندسة وراثيا من الدبقي إيواء طفرات محددة أن الخص الدبقي البشرية الأنواع الفرعية13،14. وتستخدم هذه النماذج الماوس المهندسة وراثيا لتوليد NS المستمدة من الورم، الذي تمكن في المختبر الدراسات في نظام ثلاثي الأبعاد، وتقديم النسخ المتطابق من السمات البارزة في الأورام الموقع في15. أيضا، يمكن أن تولد زرع أورثوتوبيكال NS في الفئران الأورام الثانوية التي تحتفظ بميزات الورم الرئيسي وتقليد الخصائص التشريحية المرضية والجينوم والمظهرية الورم الرئيسي الموافق15.
في ثقافة خالية من المصل، يمكن إثراء الدماغ ورم الخلايا مع خصائص الخلايا الجذعية، ووجود عوامل نمو البشرة (مماثلة)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة)، يمكن زراعتها كمستعمرات المستمدة من خلية واحدة مثل الثقافات NS. في هذا النظام ثقافة انتقائية، معظم خلايا التفريق أو المتباينة سرعة يموت، بينما تقسيم الخلايا الجذعية وتشكيل المجموعات الخلوية. وهذا ما يسمح توليد ثقافة NS تحتفظ الدبقي الورم ميزات16،،من1718. يمكن استخدام NS الدبقي لتقييم جوانب عديدة من الأحياء الورم، بما في ذلك تحليل المؤشرات الحيوية التي لها تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء الدبقي NS وتضمين ثقافات 3D في البارافين لاستخدامها لتلطيخ المدينة. هي ميزة واحدة لتثبيت وترسيخ الدبقي NS مورفولوجية NS الإبقاء على أفضل مقارنة بال سيتوسبين التقليدية الأسلوب19، التي الدبقي NS يتعرضون للتلاعب المجهدة لتفكك الخلية وتصبح الأرض. وباﻹضافة إلى ذلك، تضمين يروي أي تعبير فلوروفوري الذاتية من ورم المهندسة وراثيا NS، تمكين تلطيخ عبر أطياف الفلورسنت. والهدف العام لهذا الأسلوب هو للحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد الدبقي الخلايا عن طريق بارافين تضمين عملية وتمكين توصيف نيوروسفيريس الدبقي باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

تحليل التعبير البروتين في الدبقي ذات الصلة لعدة جوانب في الدراسة في علم الأمراض. قد وصفت بروتينات عديدة كالمؤشرات الحيوية مع تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. تحليل هذه المؤشرات الحيوية مفيدة أيضا لوصف الورم نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من المرضى الدبقي ونماذج الدبقي. NS الورم تقدم نموذجا قيماً في المختبر لتقييم ميزات مختلفة من الورم التي تستمد ويمكن أكثر دقة من مرآة الدبقي بيولوجيا. هنا يصف لنا طريقة مفصلة لتحليل المؤشرات الحيوية في ورم NS باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) على الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين NS.

رصد التنمية الورم وتقييم إذا كان الورم قد وصلت إلى الحجم اللازم لتوليد NS، قمنا بتحليل التﻷلؤ المنبعثة من الأورام باستخدام الإضاءة الحيوية. وهذا ما يسمح دراسة كفاءة توصيل في الجراء وتطور الورم بإشارة التﻷلؤ لوسيفراس (الشكل 1ألف و 1 باء). ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

نيوروسفيريس نمت كثقافات 3D تشكل أداة قوية لدراسة البيولوجيا الدبقي. نقدم هنا بروتوكولا لأداء إيمونوهيستوتشيميستري مع الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد نيوروسفيريس الدبقي عن طريق تضمين البارافين. هذا الأسلوب يتيح لتوصيف خصائص نيوروسفيري الدبقي مثل ستيمنيس وتمايز العصبية.

تقييم المؤشرات الحيوية في الدبقي التي Immunohistochemistry على الثقافات نيوروسفيري جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي 3D

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لدراسة وجود العلامات الحيوية الورم الدبقي من خلال طريقة تحافظ على بنية ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الورم. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أن يتم الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا العصبية مقارنة مع طريقة cytospin التي تتعرض الخلايا للتلاعب المجهدة وتصبح بالارض. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة أخرى لثقافة الأنسجة التي يتم فيها زراعة الخلايا في 3D والحفاظ على الهيكل مهم.للبدء، الخلايا العصبية أو ن ن في قارورة T-25 حتى يتم التقاء الخلايا. انتخاب الورم NS في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. (إمبيليت) في 300 جي لمدة خمس دقائقبعد هذا، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من 10٪ formalin واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة خمسة ملليلتر من HBSS إلى NS إعادة تعليق. impellet الخلايا كما وصف سابقا. وضع أنبوب يحتوي على بيليه على الجليد.إعادة تعليق بيليه NS غسلها في 500 ميكرولترات من اثنين في المئة من أكاروز السائل الدافئ. ويخلط بواسطة الأنابيب لطيف أو التحريك. ضع agarose جزءا لا يتجزأ من NS على الجليد حتى أغاروز البلمرة.ثم إزالة قطعة من agarose ، وعقد NS. ضع قطعة من agarose في كاسيت لتجهيز الأنسجة. تعيين حمام مائي إلى 42 درجة مئوية. و ادرج الشفرة بعناية في الميكراتوم.ثم ضع كتلة البارافين في المايكروتوم. بيد واحدة، اضغط لأسفل على ذراع يتحكم في سمك كل قسم يقع على الجانب الأيسر من الجهاز. اضغط على ذراع إلى المحطة الثانية لتعيين microtome إلى سمك ميكرومتر 30.بدوره عجلة اليد الخشنة لبدء تقليم كتلة. بمجرد تعرض سطح العينة تقريبًا ، قم بضبط الرافعة التي تتحكم في سمكها إلى خمسة أو 10 ميكرومترات. توقف عن التشذيب عند الوصول إلى سطح العينة.ملء مربع الثلج مع الجليد والمياه فقط ما يكفي لحماية كتلة البارافين من لمس الجليد مباشرة. تجاهل شفرة microtome القديمة وإدراج واحدة جديدة للقطع. جفف كتلة البارافين بالشاش ووضعها على المايكروتوم.بدوره عجلة اليد الخشنة لبدء قسمة البارافين. ثم استخدام فرشاة الطلاء رطبة لنقل الشريط البارافين إلى 42 درجة مئوية حمام الماء. باستخدام منحنى من ملقط، ووضع ملقط في ما بين قسمين البارافين ودفع أقسام بعيدا بلطف.استخدام فرشاة الطلاء رطبة لدفع أقسام فصل على الشرائح المجهر التصاق مشحونة إيجابيا. أولاً، إذابة البارافين عن طريق احتضان الشرائح في رف معدني عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم إلغاء صبغ الشرائح عن طريق الحضانة في قطار إعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة وفقا لبروتوكول النص.تخزين الشرائح في ماء الصنبور لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. بعد ذلك، احتضان الشرائح في العازلة سيترات في 125 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 90 درجة مئوية لمدة 10 ثوان. السماح للشرائح لتبرد قبل شطف لهم خمس مرات مع الماء المقطر.بعد ذلك، احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ لمدة 20 دقيقة. ثم، غسل الشرائح لمدة خمس دقائق، ثلاث مرات في عازلة الغسيل مع التحريض لطيف. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة تعيين إلى أربع درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففة.بعد ذلك، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع هياج لطيف. بعد ذلك ، احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية المخففة biotinylated في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في عازلة الغسيل مع التحريض لطيف.ثم، احتضان الشرائح في avidin-biotinylated مجمع بيروكسيديز الفجل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة. كرر الغسيل كما سبق وصفه. بعد ذلك، احتضان الشرائح مع علامات الركيزة بيروكسيد الهيدروجين DAB لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.شطف الشرائح مع مياه الصنبور وتراجع الشرائح في حل الهماوكسيلين لمضادة لهم. ثم شطف الشرائح جيدا في ماء الصنبور حتى المياه يعمل واضحة. يجفف الشرائح وفقًا لبروتوكول النص.وأخيراً، تُغطّى الشرائح بمتوسط متصاعد قائم على الزيلين، وتسمح لها بالجفاف على سطح مستوٍ في درجة حرارة الغرفة. في هذا البروتوكول، يتم إصلاح NS وجزءا لا يتجزأ في agarose والبارافين. ثم أنها ملطخة للعلامات الحيوية الورم الدبقي محددة.مستوى التعبير من ATRX، وهو بروتين مرافق يتوسط بنية الكروماتين، منخفض. Ki67، وهو علامة بيولوجية لانتشار الخلايا، هو إيجابي في NS الورم الدبقي. وأخيراً، فإن NS هي أيضا إيجابية لOLIG2، وهو عامل النسخ الذي يتوسط التمايز oligodendrocyte. أهم شيء يجب تذكره هو إعادة تعليق الخلايا بشكل جيد في الأذانروز الدافئ قبل الانتقال إلى الجليد ، لضمان توزيع متكافئ للغلاف العصبية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

أربعة ألوان مضان المناعية من الخلايا السكانية الفرعية T- خلية في الأرشيفية الفورمالين ثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الإنسان البلعوم الخلايا الحرشفية سرطان الخلايا العينات

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

تحديد مستوى التعبير البروتين في الخلايا المستزرعة إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي عالية الجودة للأطفال في الأجهزة الدقيقة لتقييم التفاعلات الكهربائية

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للورم الدبقي في خط الوسط المنتشر لدى الأطفال

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...