Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed/National Institute af neurologiske & streg (NIH/NINDS) tilskud R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 til M.G.C.; NIH/NINDS tilskud R01-NS076991 R01-NS082311 og R01-NS096756 til P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Afdeling Neurokirurgi; Leah's Happy Hearts til M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedicin Grant F046166 at M.G.C. F.M.M. er støttet af en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. blev støttet af et Fulbright-argentinske Ministeriet for sport og uddannelse Fellowship.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan.
1. generation af hjernen Tumor Neurospheres stammer fra en musemodel
<ol><li>Før proceduren dissektion forberede neurale stamceller medier (NSC medier: DMEM/F12 med 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin og 1 x antibiotikum/antimykotikum suppleret med menneskelige rekombinant EGF og basic-FGF i koncentrationer på 20 ng/mL hver). Fyld en 1,5 mL tube me...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

I denne artikel detaljer vi en alsidig og reproducerbar metode til at udføre Immunhistokemi på paraffin-embedded gliom NS, som fastholder den karakteristiske 3D-struktur af tumorceller vokser i hjernen in situ. Denne teknik besidder følgende fordele over ved hjælp af celler belagt på glas eller plast overflader: Jeg) bevarelse af 3D-struktur af NS; II) undgå stress af celle dissociation før analyse af protein udtryk; III) quenching af enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktiverin...

Gliomer er primære solide tumorer i det centrale nervesystem, klassificeret efter deres fænotypiske og genotypiske karakteristika ifølge World Health Organization1. Denne klassificering inkorporerer tilstedeværelsen eller fraværet af driver mutationer, som repræsenterer en attraktiv kilde af biomarkører2. Biomarkører er biologiske karakteristika, der kan måles og evalueres for at angive normale og patologiske processer, samt farmakologiske svar til en terapeutisk intervention3. Biomarkører kan påvises i tumor væv og celler, der stammer fra gliom, aktivering af sin biologiske karakterisering i forskellige aspekter. Nogle eksempler på gliom biomarkører muterede isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1), en mutant enzym karakteristisk for lavere-grade gliomer forbundet med bedre prognose4. Muterede IDH1 udtrykkes ofte i kombination med TP53 og alpha-thalassæmi/mental retardering syndrom X-linked (ATRX)-uvirksomme mutationer, definere en specifik gliom subtype4,5. ATRX-uvirksomme mutationer også forekomme i 44% af pediatric high-grade gliomer2,6 og har været forbundet med aggressive tumorer og genomisk ustabilitet6,7. Derudover er pediatric diffuse iboende pontine gliomer (DIPG) differentieret i undergrupper efter tilstedeværelsen eller fraværet af en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Derfor indførelsen af Molekylær karakterisering tillader inddeling, undersøgelse og behandling af gliomer som separate enheder, som tillader mere udvikling af mere målrettede behandlinger for hver undertype. Derudover kan analyse af biomarkører bruges til at vurdere forskellige biologiske processer såsom apoptose8, autophagy9, celle cyklus progression10, celle spredning11og Celledifferentiering12 .
Gensplejsede dyremodeller, der nærer de genetiske læsioner i menneskelige kræftformer er vigtige for studiet af signalering veje, der mægle sygdomsprogression. Vores laboratorium har implementeret brugen af sovende skønhed (SB) transposase system til at udvikle genetisk modificerede musemodeller af gliom husly specifikke mutationer, at sammenfatte menneskelige gliom undertyper13,14. Disse genetisk modificerede musemodeller bruges til at generere tumor-afledte NS, som aktiverer in vitro- undersøgelser i en 3D system, spejling Sukkerøkonomien i hovedtræk i tumorer in situ15. Orthotopical transplantation af NS ind i musene kan generere sekundære tumorer, der bevarer funktioner af den primære tumor og efterligne de histopatologiske, genomiske og fænotypiske egenskaber af den tilsvarende primære tumor15.
I serumfrit kultur, hjerne tumorceller med stamcelle egenskaber kan blive beriget og epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-afledte kolonier som NS kulturer. I dette selektive kultur system dør de fleste differentiering eller differentierede celler hurtigt, mens stamceller Divider og danner de cellulære klynger. Dette giver mulighed for generation af en NS kultur, der vedligeholder gliom tumor funktioner16,17,18. Gliom NS kan bruges til at evaluere flere aspekter af tumor biology, herunder analyse af biomarkører, som har applikationer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Her, vi detalje en protokol til at generere gliom NS og Integrer 3D kulturer i paraffin anvendes til IHC farvning. En fordel ved fastsættelse og indlejring gliom NS er, at morfologi af NS er vedligeholdt bedre i forhold til de konventionelle cytospin metode19, i hvilke gliom NS udsættes for stressende manipulation for celle dissociation og blive fladtrykt. Derudover slukker indlejring enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktivering af farvning på tværs af de fluorescerende spektre. Det overordnede mål med denne metode er at bevare 3D-struktur af gliom celler gennem en paraffin indlejring proces og aktiverer karakterisering af gliom neurospheres ved hjælp af Immunhistokemi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analyse af protein udtryk i gliom er relevant for flere aspekter i studiet af dens patologi. Mange proteiner er blevet beskrevet som biomarkører med programmer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Disse analyser af biomarkører er også nyttige til at karakterisere tumor neurospheres (NS) genereret fra gliom patienter og gliom modeller. Tumor NS giver en værdifuld in vitro- model for at vurdere forskellige funktioner af tumor, som de afledes og kan mere præcist spejl gliom biologi. Her beskriver vi en detaljeret metode til at analysere biomarkører i tumor NS ved hjælp af Immunhistokemi (IHC) på paraffin-indlejret svulst NS.

For at overvåge tumor udvikling og evaluere hvis tumor har nået den størrelse, der er nødvendige for at generere NS, analyserede vi den luminescence udsendes af tumorer med bioluminescens. Dette giver mulighed for undersøgelse af transduktion effektivitet i hvalpe og tumor progression af luminescence signal af luciferase (figur 1A og 1 b). Når tumorstørrelse når et signal af 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres dyrkes som 3D kulturer udgør et kraftfuldt værktøj til at studere gliom biologi. Her præsenterer vi en protokol for at udføre Immunhistokemi samtidig bevare 3D-struktur af gliom neurospheres gennem integrering af paraffin. Denne metode gør det muligt for karakterisering af gliom neurosphere egenskaber som stemness og neurale differentiering.

Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Denne protokol er betydelig, fordi kan bruges til at studere tilstedeværelsen af gliom biomarkør ved en metode, der bevarer 3D-strukturen af tumor neurosfærer. Den største fordel ved denne protokol er, at morfologien af neurosfærer opretholdes i forhold til cytospin metode, hvor cellerne udsættes for stressende manipulation og bliver fladtrykt. Denne metode kan anvendes på alle andre vævskultursystemer, hvor celler dyrkes i 3D, og vedligeholdelse af strukturen er vigtig.Til at begynde, kultur tumor neurosfærer eller NS i en T-25 kolbe, indtil cellerne er sammenløbet. Vælg tumor NS i en 15 milliliter konisk rør. Impellet NS på 300 Gs i fem minutter.Derefter skal pelleten suspenderes igen i en milliliter på 10% formalin og inkubere røret ved stuetemperatur i 10 minutter. Der tilsættes fem milliliter HBSS til den re-suspenderede NS. Impellet cellerne som tidligere beskrevet. Placer røret med pellet på is.Re-suspendere den vaskede NS pellet i 500 mikroliter af to procent varm væske agarose. Og blandes ved en blid pipettering eller omrøring. Placer agarose indlejret NS på is, indtil agarose polymerizes.Fjern derefter det stykke agarose, holde NS. Placer det stykke agarose i en kassette til vævsbehandling. Sæt et vandbad til 42 grader Celsius. Og sæt forsigtigt klingen i mikrotomen.Placer derefter paraffinblokken i mikrotomen. Med den ene hånd skal du trykke ned på håndtaget, der styrer tykkelsen af hver sektion placeret på maskinens venstre side. Tryk på håndtaget til det andet stop for at indstille mikrotomen til en tykkelse på 30 mikrometer.Drej det grove hjul for at begynde at trimme blokken. Når prøvens overflade er næsten eksponeret, indstilles det håndtag, der styrer tykkelsen, til fem eller 10 mikrometer. Stop afpudsningen, når prøvens overflade er nået.Fyld en isboks med is og lige nok vand til at beskytte paraffinblokken mod direkte at røre isen. Kassér den gamle mikrotomklinge, og indsæt en ny til trækning. Tør paraffinblokken med gaze og læg den på mikrotomen.Drej det grove håndhjul for at begynde at dele paraffinen. Brug derefter en fugtig pensel til at overføre paraffinbåndet til 42 grader Celsius vandbad. Ved hjælp af kraftens kurve skal du placere fortræt i mellem to paraffinsektioner og forsigtigt skubbe sektionerne fra hinanden.Brug den fugtige pensel til at skubbe de adskilte sektioner på positivt ladede adhæsionsmikroskopdias. Først smelte paraffin ved at inkubere dias i en metal rack ved 60 grader Celsius i 20 minutter. Derefter deparaffinize dias via inkubation i en re-hydrering tog ved stuetemperatur i henhold til tekstprotokollen.Opbevar objektglassene i postevand for at forhindre ikke-specifik antistofbinding. Derefter inkuberes diasene i citratbuffer ved 125 grader Celsius i 30 sekunder og 90 grader Celsius i 10 sekunder. Lad objektglassene køle af, før de skylles fem gange med destilleret vand.Derefter inkuberes diasene ved stuetemperatur i 0,3% hydrogenperoxid i 20 minutter. Derefter vaskes objektglassene i fem minutter, tre gange i vaskebuffer med let omrøring. Inkuber rutsjebanerne natten over i et befugtet kammer sat til fire grader Celsius med fortyndet primært antistof.Derefter vaskes rutsjebanerne tre gange i fem minutter med let omrøring. Derefter inkuberes objektglassene i fortyndet biotinyleret sekundært antistof ved stuetemperatur i en time. Rutsjebanerne vaskes tre gange i fem minutter i vaskebuffer med let omrøring.Derefter inkuberes diasene i avidin-biotinyleret peberrodsperoxidasekompleks ved stuetemperatur i mørke i en time. Gentag vasken som tidligere beskrevet. Derefter inkuberes objektglassene med DAB hydrogenperoxidsubstratmærker i to til fem minutter ved stuetemperatur.Skyl rutsjebanerne med vand fra hanen og dyp rutsjebanerne i hæmatoxylinopløsning for at modvirke dem. Skyl derefter rutsjebanerne grundigt i vand fra hanen, indtil vandet løber klart. Dehydrer diasene i henhold til tekstprotokollen.Endelig coverslip dias med en xylen-baseret montering medium og give dem tørre på en flad overflade ved stuetemperatur. I denne protokol er NS fast og indlejret i agarose og paraffin. Og så er de farves for specifikke gliom biomarkører.Udtrykket niveau af ATRX, en chaperone protein, der formidler kromatin struktur, er lav. Ki67, en biomarkør for celleprolifererende, er positiv i gliom NS. Endelig er NS også positive for OLIG2, en transskriptionsfaktor, der formidler oligodendrocyte differentiering. Det vigtigste at huske er at re-suspendere cellerne godt i den varme agarose før overførsel til is, for at sikre en jævn fordeling af neurosfærer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Four-Color Fluorescence Immunohistochemistry af T-Cell Subpopulations i Archival Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestemmelse af Protein udtryk niveau i kulturperler celler ved immuncytokemi på Paraffin-embedded celle blokke

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farvning på paraffin-indlejrede slides af pT3N0M0 gastrisk Cancer væv

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering cellelevedygtighed og død i 3D Spheroid kulturer af kræftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-kultur af glutamatergiske neuroner og pædiatriske høj kvalitet Glioma celler i mikrofluidiske enheder til at vurdere elektriske interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immuncytokemiske assays af pædiatrisk diffust midterliniegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital rumlig profilering til karakterisering af mikromiljøet i voksentype diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...