Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; de Afdeling Neurochirurgie; De Happy Hearts Leahs M.G.C. en P.R.L.; en RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. werd gesteund door een Fulbright-Argentijnse ministerie van sport en onderwijs Fellowship.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. generatie van Brain Tumor Neurospheres afgeleid van een muismodel
<ol><li>Vóór de dissectie-procedure, bereiden media van neurale stamcellen (NSC Media: DMEM/F12 met 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin en 1 x antibiotica/antimycotic aangevuld met menselijke recombinante EGF en basic-FGF bij concentraties van 20 ng/mL el...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

In dit artikel, we in detail te beschrijven een veelzijdige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van immunohistochemistry op paraffine-ingebedde glioma NS, die houden van de karakteristieke 3D structuur van tumorcellen in de hersenen in situgroeien. Deze techniek beschikt over de volgende voordelen ten opzichte van cuvetten verguld op glas of kunststof oppervlakken: ik) behoud van de 3D structuur van NS; II) voorkomen van stress van cel dissociatie vóór de analyse van eiwit expressie; III) het blussen...

Gliomas zijn primaire solide tumoren van het centrale zenuwstelsel door hun fenotypische en genotypische kenmerken volgens de World Health Organization1ingedeeld. Deze indeling bevat de aanwezigheid of afwezigheid van bestuurder mutaties, die een aantrekkelijke bron van biomarkers2 vormen. Biomarkers zijn biologische kenmerken die kunnen worden gemeten en geëvalueerd om aan te geven van de normale en pathologische processen, evenals farmacologische reacties op een therapeutische interventie3. Biomarkers kunnen worden opgespoord in de tumor weefsel en cellen afgeleid van glioma, waardoor haar biologische karakterisering in verschillende aspecten. Enkele voorbeelden van glioma biomarkers gemuteerde isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), een mutant enzym die kenmerkend zijn voor lager-grade gliomen betere prognose4is gekoppeld. Gemuteerde IDH1 wordt vaak uitgedrukt in combinatie met TP53 en alpha-thalassemie/mentale retardatie syndroom X-gebonden (ATRX)-inactiveren mutaties, vaststelling van een specifieke glioma subtype4,5. ATRX-inactiveren mutaties ook optreden in 44% van de pediatrische hoogwaardige gliomen2,6 en zijn geassocieerd met agressieve tumoren en instabiliteit van het genoom6,7. Daarnaast worden de pediatrische diffuus intrinsiek pontine gliomen (DIPG) onderscheiden in subgroepen volgens de aanwezigheid of afwezigheid van een K27M mutatie in gen H3F3A H3 Histon, of in de HIST1H3B/C gen1,6. Derhalve de invoering van moleculaire karakterisering vergunningen de Subdivisie studie en de behandeling van gliomen als afzonderlijke entiteiten, waardoor de ontwikkeling van meer meer gerichte therapieën voor elk subtype. Bovendien, kan de analyse van biomarkers worden gebruikt om te evalueren van de verschillende biologische processen zoals apoptosis8, autophagy9, celcyclus progressie10, cel proliferatie11en celdifferentiatie12 .
Genetisch gemanipuleerde dierlijke modellen die de genetische laesies aanwezig in menselijke kankers haven zijn essentieel voor de studie van signalering van trajecten die bemiddelen van progressie van de ziekte. Ons laboratorium heeft het gebruik van het Sleeping Beauty (SB) transposase systeem voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde Muismodellen van glioma herbergen specifieke mutaties die menselijke glioma subtypen13,14recapituleren geïmplementeerd. Deze genetisch gemodificeerde Muismodellen worden gebruikt voor het genereren van tumor-afgeleide NS, waarmee in vitro studies in een 3D systeem, mirroring salient eigenschappen presenteren in de tumoren in situ15. Ook kan de transplantatie van de orthotopical van NS in muizen secundaire tumoren die functies van de primaire tumor behouden en bootsen de histopathologische genomic en fenotypische eigenschappen van de overeenkomstige primaire tumor15genereren.
In serumvrij cultuur, tumor hersencellen met eigenschappen van de cel van de stam kunnen worden verrijkt en in aanwezigheid van epidermale groeifactoren (EGF) en fibroblast groeifactoren (FGF), kunnen ze worden geteeld als één cel-afgeleide kolonies zoals NS culturen. In dit systeem van selectieve cultuur sterven meeste onderscheidende of gedifferentieerde cellen snel, overwegende dat stamcellen verdelen en vormen van de cellulaire clusters. Hierdoor is de generatie van een NS-cultuur die glioma tumor functies16,17,18 onderhoudt. Glioma NS kan worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie van de tumor, met inbegrip van de analyse van biomarkers die toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat hebben. Hier, we detail een protocol voor het genereren van glioma NS en de 3D culturen inbedden in paraffine worden gebruikt voor de kleuring van IHC. Een voordeel van vaststelling en glioma NS insluiten is dat de morfologie van de NS beter wordt gehandhaafd ten opzichte van de conventionele cytospin methode19, in welke glioma NS worden stressvolle manipulatie voor cel dissociatie en worden afgevlakt. Bovendien lest insluiten een endogene fluorophore expressie van genetisch gemanipuleerde tumor NS, waardoor over de fluorescerende spectra kleuring. Het algemene doel van deze methode is om te behouden de 3D structuur van glioma cellen door een proces te embedding paraffine en karakterisering van glioma neurospheres met behulp van immunohistochemie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analyse van de eiwituitdrukking in glioma is relevant voor de verschillende aspecten in de studie van de pathologie. Talrijke proteïnen zijn beschreven als biomarkers met toepassingen in de diagnose, prognose, classificatie, staat van progressie van de tumor en cel differentiatie staat. Deze analyses van biomarkers zijn ook handig voor het karakteriseren van de tumor neurospheres (NS) gegenereerd op basis van glioma patiënten en glioma modellen. Tumor NS bieden een waardevolle in vitro model voor de beoordeling van de verschillende kenmerken van de tumor waaruit ze zijn afgeleid en kan nauwkeuriger spiegel glioma biologie. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om biomarkers in tumor NS te analyseren met behulp van immunohistochemistry (IHC) op paraffine-ingebedde tumor NS.

We geanalyseerd om te controleren van de ontwikkeling van de tumor en beoordelen of de tumor de nodig voor het genereren van NS grootte heeft bereikt, de luminescentie uitgestoten door tumoren met bioluminescentie. Hierdoor is de studie van signaaltransductie doelmatigheid in de pups en de progressie van de tumor door het signaal van de luminescentie van luciferase (Figuur 1A en 1B). Wanneer de grootte van de tumor bereikt ee...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Dit protocol is belangrijk omdat kan worden gebruikt om de aanwezigheid van glioom biomarker te bestuderen door middel van een methode die de 3D-structuur van tumorneuros behoudt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat de morfologie van neurosferen wordt gehandhaafd in vergelijking met cytospin methode waarbij cellen worden onderworpen aan stressvolle manipulatie en worden afgevlakt. Deze methode kan worden toegepast op andere weefselkweeksystemen waarin cellen in 3D worden gekweekt en het onderhoud van de structuur belangrijk is.Om te beginnen, cultuur tumor neurosferen of NS in een T-25 fles totdat de cellen zijn confluent. Kies de tumor NS in een 15 milliliter conische buis. De NS vijf minuten lang op 300 Gs.Daarna, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter van 10% formaline en incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg vijf milliliter HBSS toe aan de opnieuw geschorste NS. De cellen zoals eerder beschreven. Plaats de buis met de pellet op ijs.Schort de gewassen NS-pellet opnieuw op in 500 microliters van twee procent warme vloeistof. En meng door een zachte pipetting of roeren. Plaats de agarose ingebedde NS op ijs tot de agarose polymeriseert.Verwijder dan het stuk agarose, met de NS. Plaats het stuk agarose in een cassette voor weefselverwerking. Zet een waterbad op 42 graden Celsius. En steek het mes voorzichtig in het microtome.Plaats vervolgens het paraffineblok in het microtome. Druk met één hand op de hendel die de dikte van elke sectie aan de linkerkant van de machine regelt. Druk op de hendel bij de tweede stop om de microtome op een dikte van 30 micrometer in te stellen.Draai het grove handwiel om te beginnen met het trimmen van het blok. Zodra het oppervlak van het monster bijna is blootgesteld, stelt u de hendel in die de dikte regelt op vijf of tien micrometer. Stop met trimmen wanneer het oppervlak van het monster is bereikt.Vul een ijsdoos met ijs en net genoeg water om het paraffineblok te beschermen tegen het direct aanraken van het ijs. Gooi het oude microtomeblad weg en steek een nieuw mes in voor doorsnede. Droog het paraffineblok met gaas en leg het op het microtome.Draai het grove handwiel om te beginnen met het doorsneed van de paraffine. Gebruik vervolgens een vochtige kwast om het paraffinelint over te brengen naar het 42 graden Celsius waterbad. Met behulp van de curve van de tangen, plaats de tangen tussen twee paraffine secties en duw de secties uit elkaar zachtjes.Gebruik de vochtige kwast om de gescheiden secties op positief geladen adhesiemicroscoopdia's te duwen. Eerst smelt de paraffine door de glijbanen in een metalen rek gedurende 20 minuten uit te broeden op 60 graden Celsius. Deparaffinize de dia's vervolgens via incubatie in een re-hydratatietrein bij kamertemperatuur volgens het tekstprotocol.Bewaar de glijbanen in leidingwater om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen. Daarna, incubeer de dia's in citrate buffer op 125 graden Celsius gedurende 30 seconden en 90 graden Celsius gedurende 10 seconden. Laat de glijbanen afkoelen voordat u ze vijf keer met gedestilleerd water spoelt.Vervolgens, incubeer de dia's bij kamertemperatuur in 0,3%waterstofperoxide gedurende 20 minuten. Was vervolgens de glijbanen gedurende vijf minuten, drie keer in de wasbuffer met zachte agitatie. Incubeer de dia's 's nachts in een bevochtigde kamer ingesteld op vier graden Celsius met verdunde primaire antilichaam.Daarna was je de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten met zachte agitatie. Vervolgens, incubeer de dia's in verdunde biotinylated secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende een uur. Was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in de wasbuffer met zachte agitatie.Vervolgens, inculbateren van de dia's in avidin-biotinylated mierikswortel peroxidase complex bij kamertemperatuur in het donker voor een uur. Herhaal de was zoals eerder beschreven. Daarna, inculbateren van de dia's met DAB waterstofperoxide substraat merken voor twee tot vijf minuten bij kamertemperatuur.Spoel de glijbanen met kraanwater en dompel de glijbanen in hematoxylin oplossing om ze tegen te houden. Spoel vervolgens de glijbanen grondig in leidingwater totdat het water helder loopt. De dia's uitdrogen volgens het tekstprotocol.Tot slot, coverslip de dia's met een xyleen-gebaseerde montage medium en laat ze drogen op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur. In dit protocol wordt NS gefixeerd en ingebed in agarose en paraffine. En dan zijn ze gekleurd voor specifieke glioom biomarkers.Het expressieniveau van ATRX, een chaperonne-eiwit dat de chromatinestructuur bemiddelt, is laag. Ki67, een biomarker van celproliferatie, is positief in de glioom NS. Tot slot is de NS ook positief over OLIG2, een transcriptiefactor die oligodendrocytedifferentiatie bemiddelt. Het belangrijkste om te onthouden is om de cellen goed op te schorten in de warme agarose voordat ze naar ijs gaan, om een gelijkmatige verdeling van neurosferen te garanderen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-cultuur van glutamaterge neuronen en pediatrische hoogwaardige glioomcellen in microfluïdische apparaten om elektrische interacties te beoordelen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...