Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la National instituts de santé/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NINDS/NIH) subventions R37-NS094804, NS074387-R01, R21-NS091555 à M.G.C. ; NIH/NINDS accorde R01-NS076991 et NS082311-R01 R01-NS096756 PRL ; NIH/NINDS R01-EB022563 ; 1UO1CA224160 ; le département de neurochirurgie ; Coeur joyeux de Leah M.G.C. et PRL ; et RNA biomédecine Grant F046166 à M.G.C. F.M.M. est pris en charge par un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. disposait d’un Fulbright-argentin ministère des Sports et de la bourse de l’enseignement.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.
1. génération de Brain Tumor Neurospheres provenant d’un modèle de souris
<ol><li>Avant l’intervention de dissection, préparer des cellules souches neurales médias (Media NSC : DMEM/F12 avec 1 supplément de x B27, 1 x N2 supplément, 1 x normocin et 1 x antibiotique/antimycosiques additionné humaine recombinante EGF et basic-FGF ?...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

Dans cet article, nous détaillons une méthode reproductible et polyvalente pour exécuter immunohistochimie sur gliomes de paraffine NS, qui maintiennent la structure 3D caractéristique des cellules tumorales qui poussent dans le cerveau in situ. Cette technique possède les avantages suivants par rapport à l’aide de cellules plaqués sur les surfaces en plastique ou de verre : J’ai) la préservation de la structure 3D de la Nouvelle-Écosse ; II) en évitant de stress de dissociation cellulaire avant ...

Les gliomes sont des tumeurs solides primaires du système nerveux central classées selon leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques selon l' organisation mondiale de la santé1. Cette classification comprend la présence ou l’absence de mutations de pilote, qui représentent une source attrayante de biomarqueurs2. Biomarqueurs sont des caractéristiques biologiques qui peuvent être mesurés et évalués pour indiquer les processus normaux et pathologiques, ainsi que des réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique à3. Biomarqueurs peuvent être détectées dans les tissus tumoraux et cellules de gliome, ce qui permet sa caractérisation biologique sous différents aspects. Quelques exemples de biomarqueurs de gliome muté isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1), une enzyme mutante caractéristique des gliomes de bas-grade associés meilleur pronostic4. IDH1 muté s’exprime souvent en combinaison avec TP53 et alpha-thalassémie/mental retardation syndrome lié à le X (ATRX)-inactivation des mutations, définissant un gliome spécifique du sous-type4,5. Mutations inactivant ATRX également se produisent dans 44 % des gliomes de haut grade pédiatriques2,6 et ont été associées à des tumeurs agressives et instabilité génomique6,7. En outre, pédiatriques diffus intrinsèques pontines gliomas (DIPG) sont différenciés en sous-groupes selon la présence ou l’absence d’une mutation de K27M dans le gène H3F3A de l’histone H3, ou dans le gène HIST1H3B/C1,6. Par conséquent, l’introduction de la caractérisation moléculaire permet la subdivision, étude et le traitement des gliomes comme des entités distinctes, ce qui permettra le développement de plus de plus des traitements pour chaque sous-type ciblés. En outre, l’analyse de biomarqueurs peut servir à évaluer les différents processus biologiques tels que l’apoptose8autophagie9, cycle cellulaire progression10, cellule prolifération11et la différenciation des cellules12 .
Des modèles animaux issus du génie génétique qui hébergent les lésions génétiques présentes dans les cancers humains sont essentiels pour l’étude de la signalisation des voies qui véhiculent la progression de la maladie. Notre laboratoire a mis en place l’utilisation du système transposase Sleeping Beauty (SB) pour développer des modèles de souris génétiquement modifiées de gliome hébergeant des mutations spécifiques qui récapitulent gliome humain sous-types13,14. Ces modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisées pour générer des dérivées de tumeurs NS, qui permettent des études in vitro dans un système 3D, mise en miroir des traits saillants présent dans les tumeurs in situ15. Aussi, la greffe d’orthotopical de NS chez la souris peut générer des tumeurs secondaires qui conservent les caractéristiques de la tumeur primitive et imitent les propriétés phénotypiques, génomiques et histopathologiques des tumeur primitive correspondante15.
Dans la culture sans sérum, cellules de tumeur du cerveau avec des propriétés de cellules souches peuvent être enrichies, et en présence de facteurs de croissance épidermiques (EGF) et facteurs de croissance fibroblastiques (FGF), ils peuvent être cultivés comme colonies de culture cellulaire unique comme cultures de NS. Dans ce système de culture sélective, la plupart des cellules de différenciation ou différenciées rapidement mourir, alors que les souches cellules se divisent et forment des amas cellulaires. Cela permet la génération d’une culture de NS qui maintient les gliomes tumeur caractéristiques16,17,18. Gliome NS peut servir à évaluer plusieurs aspects de la biologie tumorale, y compris l’analyse de biomarqueurs qui ont des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ici, nous détaillons un protocole pour générer des gliomes NS et intégrer les cultures 3D en paraffine à utiliser pour la coloration de IHC. Un des avantages de la fixation et l’incorporation de gliome NS, c’est que la morphologie de la Nouvelle-Écosse est mieux maintenue par rapport au conventionnel cytospin méthode19, dans laquelle gliome NS sont soumis à des manipulations stressantes pour la dissociation cellulaire et deviennent aplaties. En outre, enrobage étanche toute expression de fluorophore endogène de tumeur génétiquement NS, ce qui permet une coloration dans les spectres de fluorescence. L’objectif général de cette méthode consiste à préserver la structure 3D des cellules de gliome par une paraffine intégrant les processus et permettre la caractérisation des gliomes neurospheres par immunohistochimie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analyse de l’expression de la protéine dans les gliomes est pertinente pour plusieurs aspects dans l’étude de sa pathologie. Nombreuses protéines ont été décrits comme biomarqueurs avec des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ces analyses de biomarqueurs sont également utiles pour caractériser les tumeurs neurospheres (NS) produit de patients de gliome et modèles de gliome. NS de tumeur fournissent un modèle précieux in vitro pour évaluer les différentes caractéristiques de la tumeur d'où ils proviennent et peuvent mieux miroir gliome biologie. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour analyser des biomarqueurs dans la tumeur NS à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) sur tumeur paraffine NS.

Pour suivre le développement de tumeurs et d’évaluer si la tumeur a atteint la taille nécessaire pour générer les NS, nous avons analysé la luminescence émise par des tumeurs à l’aide de bioluminescence. Ceci permet l’étude de l’efficacité de la transduction dans les chiots et la progression tumorale par le signal de la luminescence de la luciférase (Figure 1A et 1 b). Lorsque la taille de la tumeur atteint...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Ce protocole est significatif parce que peut être employé pour étudier la présence du biomarqueur de gliome par une méthode qui préserve la structure 3D des neurosphères de tumeur. Le principal avantage de ce protocole est que la morphologie des neurosphères est maintenue par rapport à la méthode de cytospin dans laquelle les cellules sont soumises à une manipulation stressante et s’aplatir. Cette méthode peut être appliquée à tous les autres systèmes de culture tissulaire dans lesquels les cellules sont cultivés en 3D et le maintien de la structure est important.Pour commencer, la culture des neurosphères tumorales ou NS dans un flacon T-25 jusqu’à ce que les cellules sont confluentes. Élire la tumeur NS dans un tube conique de 15 millilitres. Impellet la NS à 300 Gs pendant cinq minutes.Après cela, suspendre à nouveau la pastille en un millilitre de 10% de formaline et incuber le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter cinq millilitres de HBSS à la NS re-suspendue. Impellet les cellules comme précédemment décrit. Placer le tube contenant la pastille sur la glace.Suspendre à nouveau la pastille NS lavée dans 500 microlitres d’agarose liquide chaud à deux pour cent. Et mélanger par un tuyau doux ou en remuant. Placez l’agarose en NS intégrée sur la glace jusqu’à ce que l’agarose polymérise.Retirez ensuite le morceau d’agarose, en tenant le NS. Placer le morceau d’agarose dans une cassette pour le traitement des tissus. Réglez un bain d’eau à 42 degrés Celsius. Et insérez soigneusement la lame dans le microtome.Ensuite, placez le bloc de paraffine dans la microtome. D’une main, appuyez sur le levier qui contrôle l’épaisseur de chaque section située sur le côté gauche de la machine. Appuyez sur le levier au deuxième arrêt pour régler le microtome à une épaisseur de 30 micromètres.Tournez la roue à main grossière pour commencer à couper le bloc. Une fois que la surface de l’échantillon est presque exposée, réglez le levier qui contrôle l’épaisseur à cinq ou 10 micromètres. Arrêtez de tailler lorsque la surface de l’échantillon est atteinte.Remplissez une glacie de glace et juste assez d’eau pour protéger le bloc de paraffine contre le toucher directement de la glace. Jetez l’ancienne lame de microtome et insérez-en une nouvelle pour la sectionnement. Séchez le bloc de paraffine avec de la gaze et placez-le sur la microtome.Tournez la roue à main grossière pour commencer à sectionner la paraffine. Ensuite, utilisez un pinceau humide pour transférer le ruban de paraffine au bain d’eau de 42 degrés Celsius. À l’aide de la courbe des forceps, placez les forceps entre deux sections de paraffine et repoussez doucement les sections.Utilisez le pinceau humide pour pousser les sections séparées sur des glissières de microscope à adhérence chargées positivement. Tout d’abord, faire fondre la paraffine en incubant les glissières dans une grille métallique à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, déparaffiniser les diapositives par incubation dans un train de réhydratation à température ambiante selon le protocole du texte.Conservez les glissières dans l’eau du robinet pour éviter la fixation non spécifique des anticorps. Après cela, incuber les diapositives dans le tampon de citrate à 125 degrés Celsius pendant 30 secondes et 90 degrés Celsius pendant 10 secondes. Laisser refroidir les glissières avant de les rincer cinq fois avec de l’eau distillée.Ensuite, incubez les glissières à température ambiante en peroxyde d’hydrogène de 0,3 % pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les glissières pendant cinq minutes, trois fois dans le tampon de lavage avec une agitation douce. Incuber les glissières pendant la nuit dans une chambre humidifiée réglée à quatre degrés Celsius avec des anticorps primaires dilués.Après cela, laver les diapositives trois fois pendant cinq minutes avec une agitation douce. Ensuite, incubez les glissières dans des anticorps secondaires biotinylés dilués à température ambiante pendant une heure. Lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes dans un tampon de lavage avec une légère agitation.Ensuite, incubez les glissières dans le complexe de peroxydées de raifort avidin-biotinylated à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Répétez le lavage tel que décrit précédemment. Après cela, incuber les diapositives avec des marques de substrat de peroxyde d’hydrogène DAB pendant deux à cinq minutes à température ambiante.Rincez les glissières à l’eau du robinet et trempez les glissières dans la solution d’hématoxyline pour les contrer. Rincez ensuite soigneusement les glissières dans l’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire. Déshydratez les diapositives selon le protocole du texte.Enfin, couvrez les glissières avec un milieu de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à température ambiante. Dans ce protocole, ns sont fixés et incorporés dans l’agarose et la paraffine. Et puis ils sont tachés pour des biomarqueurs gliomes spécifiques.Le niveau d’expression d’ATRX, une protéine chaperon qui médie la structure de la chromatine, est faible. Ki67, un biomarqueur de la prolifération cellulaire, est positif dans le gliome NS. Enfin, les NS sont également positifs pour OLIG2, un facteur de transcription qui médie la différenciation oligodendrocyte. La chose la plus importante à retenir est de re-suspendre les cellules bien dans l’agarose chaude avant de transférer à la glace, pour assurer une distribution égale des neurosphères.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Détermination du niveau d’Expression de protéine dans des cellules cultivées par immunocytochimie sur des blocs de paraffine cellulaire

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Staining élastique sur les diapositives intégrées à la paraffine du tissu du cancer gastrique pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...