Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders, R21-NS091555, M.G.C. & Schlaganfall (NIH/NINDS) Zuschüsse R37-NS094804, R01-NS074387 unterstützt; NIH/NINDS gewährt R01-NS076991 R01-NS082311 und R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; der Abteilung für Neurochirurgie; Leahs glückliche Herzen, M.G.C. und P.R.L.; und RNA Biomedizin Grant F046166, M.G.C. F.M.M. wird durch eine F31 NIH/NINDS-F31NS103500 unterstützt. J.P wurde durch ein Fulbright-argentinischen Ministerium für Sport und Bildung Stipendium unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Michigan genehmigt.
1. Generation von Gehirn Tumor Neurospheres abgeleitet von einem Maus-Modell
<ol><li>Bereiten Sie vor dem Eingriff Dissektion neurale Stammzellen Medien (NSC-Medien: DMEM/F12 mit 1 x B27 Ergänzung, 1 x N2 Ergänzung, 1 X Normocin und 1 X Antibiotikum/antimykotische ergänzt mit menschlichen rekombinanten EGF und Basic-FGF bei Konzentrationen von...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

In diesem Artikel zeigen wir eine vielseitige und reproduzierbare Methode durchführen Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten Gliom NS, die die charakteristischen 3D-Struktur von Tumorzellen wachsen in das Gehirn in Situzu pflegen. Diese Technik besitzt die folgenden Vorteile gegenüber der Verwendung von Zellen auf Glas oder Kunststoff-Oberflächen verchromt: ich) Erhaltung der 3D-Struktur von NS; (II) Vermeidung von Stress der Zelle Dissoziation vor der Analyse der Proteinexpression; (III) abschrecken...

Gliome sind primäre soliden Tumoren des zentralen Nervensystems durch ihre genotypischen und phänotypischen Merkmale gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO)1eingestuft. Diese Einteilung beinhaltet das Vorhandensein oder Fehlen der Fahrer Mutationen, die eine attraktive Biomarker2darstellen. Biomarker sind biologische Merkmale, die gemessen und ausgewertet, um normale und pathologische Prozesse sowie pharmakologische Reaktionen auf eine therapeutische Intervention3zeigen werden. Biomarker können erkannt werden in Tumor-Gewebe und Zellen aus Gliom, so dass seine biologische Charakterisierung in verschiedenen Aspekten. Einige Beispiele für Gliom Biomarker mutierten Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1), ein mutiertes Enzym charakteristisch für minderwertigen Gliome bessere Prognose4zugeordnet. Mutiertes IDH1 drückt sich häufig in Kombination mit TP53 und Alpha-Thalassämie/Mentale Retardierung Syndrom X-chromosomal (ATRX)-Inaktivierung Mutationen,4,5Subtyp definieren einen bestimmten Gliom. ATRX-Inaktivierung Mutationen auch in 44 % der pädiatrischen hochgradige Gliome2,6 auftreten und aggressive Tumoren und genomische Instabilität6,7zugeordnet wurden. Darüber hinaus unterscheiden sich die pädiatrische diffus intrinsische Pontinische Gliome (DIPG) in Untergruppen nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer K27M Mutation in Histon H3 gen H3F3A oder in der HIST1H3B/C gen1,6. Daher die Einführung der molekularen Charakterisierung erlaubt die Unterteilung, Erforschung und Behandlung von Gliomen als getrennte Einheiten, wodurch mehr die Entwicklung von mehr gezielte Therapien für jeden Subtyp. Darüber hinaus kann die Analyse von Biomarkern verwendet werden, um unterschiedliche biologische Prozesse z. B. Apoptose8Autophagie9, Zellzyklus Progression10, Zelle Verbreitung11und Zelldifferenzierung12 bewerten .
Gentechnisch hergestellte Tiermodellen, die die genetischen Veränderungen im menschlichen Krebserkrankungen Hafen sind entscheidend für das Studium der Signalwege, die Progression der Erkrankung zu vermitteln. Unser Labor hat die Verwendung von Sleeping Beauty (SB) Transposase System entwickeln gentechnisch veränderter Mausmodelle der Gliom beherbergen bestimmte Mutationen, die menschlichen Gliom Subtypen13,14rekapitulieren umgesetzt. Diese gentechnisch veränderte Mausmodelle dienen zur Erzeugung von Tumor-abgeleitete NS, die in-vitro- Studien in einem 3D System ermöglichen, Spiegelung hervorstechenden Merkmale präsentieren in der Tumoren in Situ15. Die Orthotopical Transplantation von NS auf Mäuse kann auch sekundäre Tumoren generieren, die Funktionen des Primärtumors zu behalten und imitieren die histopathologischen, genomischen und phänotypischen Eigenschaften der entsprechenden Primärtumors15.
In serumfreien Kultur Gehirn-Tumor-Zellen mit Stammzellen Eigenschaften angereichert werden können, und im Beisein von epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), können sie als einzelne Zelle abgeleitet Kolonien wie NS Kulturen angebaut werden. In diesem selektiven Kultursystem sterben die meisten differenzierende oder differenzierte Zellen schnell, während Stammzellen teilen und die zelluläre Cluster bilden. Dies ermöglicht die Erzeugung einer NS-Kultur, die Gliom Tumor Merkmale16,17,18unterhält. Gliom NS kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie, einschließlich der Analyse von Biomarkern, die Anwendungen in Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Zellstatus Differenzierung zu bewerten. Hier haben wir ein Protokoll zum Gliom NS zu generieren und Einbinden der 3D Kulturen in Paraffin verwendet werden ausführlich für IHC beflecken. Ein Vorteil von Befestigung und Einbettung Gliom NS ist, dass die Morphologie der NS ist besser im Vergleich zu den herkömmlichen Cytospin Methode19, gepflegt, in welche Gliom NS stressig Manipulation für Zelle Dissoziation unterliegen und abgeflacht werden. Darüber hinaus stillt die Einbettung beliebiger endogenen Fluorophor Ausdruck aus gentechnisch veränderter Tumor NS, Färbung über die fluoreszierenden Spektren ermöglichen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die 3D-Struktur Gliom Zellen durch ein Paraffin einbetten Prozess erhalten und Charakterisierung von Gliom Neurospheres verwenden Immunohistochemistry zu ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analyse der Proteinexpression in Gliom ist relevant für verschiedene Aspekte in der Studie von seiner Pathologie. Zahlreiche Proteine wurden als Biomarker mit Anwendungen in der Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Differenzierung Zellstatus beschrieben. Diese Analysen der Biomarker eignen sich auch zur Charakterisierung der Tumor Neurosphären (NS) aus Gliom Patienten und Gliom Modelle generiert. Tumor-NS bieten eine wertvolle in-vitro- Modell, um verschiedene Funktionen des Tumors zu beurteilen, aus denen sie stammen und können genauer Spiegel Gliom Biologie. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Analyse von Biomarkern im Tumor NS mit Immunhistochemie (IHC) auf Paraffin-eingebetteten Tumor NS.

Um Tumorentwicklung zu überwachen und zu bewerten, wenn der Tumor die NS generieren Größe erreicht hat, analysierten wir die Lumineszenz von Tumoren mit Biolumineszenz emittiert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Transduktion Effizienz in der Welpen und Tumorprogression durch die Lumineszenz-Signal der Luciferase (Abbildung 1A und 1 b). Wenn die Größe des Tumors ein Signal von 1 x 107 Photonen/s/cm2/sr (<s...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es verwendet werden kann, um das Vorhandensein von Gliom-Biomarkern durch eine Methode zu untersuchen, die die 3D-Struktur von Tumorneurosphären bewahrt. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die Morphologie von Neurosphären im Vergleich zur Cytospin-Methode beibehalten wird, bei der Zellen einer belastenden Manipulation unterzogen und abgeflacht werden. Diese Methode kann auf alle anderen Gewebekultursysteme angewendet werden, in denen Zellen in 3D kultiviert werden und die Erhaltung der Struktur wichtig ist.Zu Beginn, Kultur Tumor Neurosphären oder NS in einem T-25 Kolben, bis die Zellen konfluent sind. Wählen Sie den Tumor NS in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Impellet die NS bei 300 Gs für fünf Minuten.Danach das Pellet in einem Milliliter 10%formalin wieder aufhängen und das Rohr bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie dem erneut suspendierten NS fünf Milliliter HBSS hinzu. Impellet die Zellen wie zuvor beschrieben. Legen Sie das Rohr mit dem Pellet auf Eis.Das gewaschene NS-Pellet in 500 Mikroliter n2 Prozent warmer Flüssigagarose wieder aufhängen. Und mischen Sie durch ein sanftes Pipettieren oder Rühren. Legen Sie die agarose eingebettete NS auf Eis, bis die Agarose polymerisiert.Entfernen Sie dann das Stück Agarose und halten Sie die NS. Legen Sie das Stück Agarose in eine Kassette für die Gewebeverarbeitung. Stellen Sie ein Wasserbad auf 42 Grad Celsius. Und legen Sie die Klinge vorsichtig in das Mikrotom ein.Dann legen Sie den Paraffinblock in das Mikrotome. Drücken Sie mit einer Hand auf den Hebel, der die Dicke jedes Abschnitts auf der linken Seite der Maschine steuert. Drücken Sie den Hebel auf den zweiten Anschlag, um das Mikrotome auf eine Dicke von 30 Mikrometern einzustellen.Drehen Sie das grobe Handrad, um mit dem Trimmen des Blocks zu beginnen. Sobald die Oberfläche der Probe fast freigelegt ist, stellen Sie den Hebel, der die Dicke steuert, auf fünf oder zehn Mikrometer. Beenden Sie das Trimmen, wenn die Oberfläche der Probe erreicht ist.Füllen Sie eine Eiskiste mit Eis und gerade genug Wasser, um den Paraffinblock vor dem direkten Berühren des Eises zu schützen. Entsorgen Sie das alte Mikrotom-Blatt und legen Sie eine neue für die Schnitte ein. Trocknen Sie den Paraffinblock mit Gaze und legen Sie ihn auf das Mikrotome.Drehen Sie das grobe Handrad, um mit der Schnittung des Paraffins zu beginnen. Dann verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um das Paraffinband in das 42 Grad Celsius Wasserbad zu übertragen. Platzieren Sie die Zangen mithilfe der Kurve der Zange zwischen zwei Paraffinabschnitten und schieben Sie die Abschnitte sanft auseinander.Verwenden Sie den feuchten Pinsel, um die getrennten Abschnitte auf positiv geladene Haftmikroskop-Dias zu schieben. Schmelzen Sie zunächst das Paraffin, indem Sie die Dias in einem Metallgestell bei 60 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Anschließend deparaffinisieren Sie die Dias über inkubation in einem Rehydrationszug bei Raumtemperatur nach dem Textprotokoll.Bewahren Sie die Dias im Leitungswasser auf, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Danach die Dias im Citratpuffer bei 125 Grad Celsius für 30 Sekunden und 90 Grad Celsius für 10 Sekunden inkubieren. Lassen Sie die Dias abkühlen, bevor Sie sie fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.Als nächstes inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur in 0,3% Wasserstoffperoxid für 20 Minuten. Dann waschen Sie die Rutschen für fünf Minuten, dreimal in Waschpuffer mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias über Nacht in einer befeuchteten Kammer, die auf vier Grad Celsius mit verdünntem Primärantikörper eingestellt ist.Danach die Rutschen dreimal fünf Minuten lang mit sanfter Rührung waschen. Als nächstes inkubieren Sie die Dias in verdünnten biotinylierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie die Rutschen dreimal für fünf Minuten in Waschpuffer mit sanfter Rührung.Dann inkubieren Sie die Dias in avidin-biotinylierten Meerrettich peroxidase Komplex bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für eine Stunde. Wiederholen Sie die Wäsche wie zuvor beschrieben. Danach die Dias mit DAB-Hydrogenperoxidsubstratmarken für zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Spülen Sie die Dias mit Leitungswasser und tauchen Sie die Dias in Hämatoxylin-Lösung, um sie zu verstellen. Dann spülen Sie die Rutschen gründlich in Leitungswasser, bis das Wasser klar läuft. Dehydrieren Sie die Dias gemäß dem Textprotokoll.Schließlich die Dias mit einem Xylol-basierten Montagemedium abdecken und auf einer ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur trocknen lassen. In diesem Protokoll sind NS fixiert und in Agarose und Paraffin eingebettet. Und dann werden sie für bestimmte Gliom-Biomarker gefärbt.Die Expressionsstufe von ATRX, einem Chaperonprotein, das die Chromatinstruktur vermittelt, ist niedrig. Ki67, ein Biomarker der Zellproliferation, ist positiv im Gliom NS. Schließlich sind die NS auch positiv für OLIG2, ein Transkriptionsfaktor, der Oligodendrozytendifferenzierung vermittelt. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, die Zellen in der warmen Agarose wieder zu suspendieren, bevor man auf Eis überträgt, um eine gleichmäßige Verteilung der Neurosphären zu gewährleisten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Forschung

Krebsforschung

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Kokultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidische Geräte zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...