Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות & קו (NIH/NINDS) מענקים R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 כדי M.G.C.; NIH/NINDS מעניקה R01-NS076991 R01-NS082311, R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; במחלקה הנוירוכירורגית; לבבות שמח של לאה M.G.C., P.R.L.; והיא RNA וההתערבות גרנט F046166 כדי M.G.C. F.M.M. נתמכת על ידי F31 NIH/NINDS-F31NS103500. ג'יי. פי נתמכה על ידי משרד הספורט פולברייט-ארגנטינאי מלגת החינוך.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. דור של המוח גידול Neurospheres נגזר דגם העכבר
<ol><li>לפני ההליך לנתיחה, להכין תאי גזע עצביים מדיה (Media המועצה לבטחון לאומי: DMEM/F12 עם תוספת x B27 1, 1 השלמה x N2, 1 x normocin 1 x אנטיביוטיקה/antimy...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

במאמר זה, אנחנו פירוט שיטה לשחזור רב-תכליתי לביצוע אימונוהיסטוכימיה על glioma פרפין-מוטבע NS, המקיימות המבנה 3D האופיינית של תאים סרטניים גדל המוח בתוך באתרו. טכניקה זו יש את היתרונות הבאים לעומת באמצעות תאי ציפוי זכוכית או משטחי פלסטיק: אני) שימור המבנה התלת-ממד של NS; ii) הימנעות של מתח התא ה...

Gliomas הם גידולים מוצקים העיקרי של מערכת העצבים המרכזית מסווגים לפי המאפיינים שלהם פנוטיפי ו genotypic על פי ארגון הבריאות העולמי ה-1. סיווג זה משלבת נוכחות או היעדרות של מוטציות הנהג, אשר מייצגים מקור אטרקטיבי של סמנים ביולוגיים2. סמנים ביולוגיים הן תכונות ביולוגיות ולהשוואה הערכה לציון תהליכים נורמליים ופתולוגיים, כמו גם תרופתי התגובות התערבות טיפולית3. סמנים ביולוגיים ניתן להבחין ב גידול רקמות ותאים שמקורם glioma, המאפשרת אפיון ביולוגי שלו בהיבטים שונים. כמה דוגמאות של סמנים ביולוגיים glioma כוללים מוטציה isocitrate דהידרוגנאז 1 (IDH1), אנזים מוטציה האופייניים gliomas נמוך בכיתה הקשורים עם פרוגנוזה טובה יותר4. מוטציה IDH1 מתבטא לעתים קרובות בשילוב עם TP53 אלפא-תלסמיה/מנטלי פיגור תסמונת X-linked (ATRX)-inactivating מוטציות, הגדרת glioma ספציפי של סוג הנכס4,5. מוטציות ATRX inactivating גם להתרחש ב- 44% של ילדים gliomas בדרגה גבוהה2,6 , קושרו עם גידולים אגרסיביים, אי יציבות גנומית6,7. בנוסף, ילדים ' מאטום לשקוף ' מהותי pontine gliomas (DIPG) מובחנים של תת קבוצות לפי נוכחות או היעדרות של מוטציה K27M בגן היסטון H3 H3F3A, או ב- HIST1H3B/C ג'ין1,6. לכן, כניסתה של אפיון מולקולרי מתיר את חלוקת משנה, מחקר, וטיפול של gliomas כישויות נפרדות, אשר יותר יאפשר הפיתוח של יותר ממוקד טיפולים עבור כל סוג של. בנוסף, הניתוח של סמנים ביולוגיים ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכים ביולוגיים שונים כגון אפופטוזיס8, autophagy9, מחזור התא התקדמות10, התפשטות תא11תאית התמיינות12 .
בדגמי בעלי חיים מהונדסים גנטית הנמל נגעים גנטי נוכח סרטן אנושיים הם קריטיים עבור המחקר של איתות המסלולים המתווכות התקדמות המחלה. המעבדה שלנו יישמה את השימוש במערכת transposase היופי ישן (SB) לפתח מודלים מהונדס גנטית עכבר של glioma מחסה מוטציות ספציפיות אשר מסכם את הדברים glioma האנושי יחוברו13,14. מודלים מהונדס גנטית עכבר אלה משמשים ליצירת NS נגזר הגידול, אשר מאפשרים מחקרים במבחנה במערכת תלת-ממד, תכונות בולטות שיקוף להציג גידולים מקומיים בתוך15. כמו כן, השתלת orthotopical של NS לתוך עכברים ניתן להפיק גידולים משניים אשר שומרים על תכונות של הגידול העיקרי ומחקים את המאפיינים histopathological גנומית, פנוטיפי של הגידול העיקרי המקביל15.
בתרבות ללא סרום, תאים סרטניים במוח עם מאפייני תא גזע יכולים להיות מועשר, בנוכחות גורמי גדילה עוריות (EGF) ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGF), הם ניתן לגדל כמו מושבות נגזר תא יחיד כגון NS תרבויות. במערכת זו בררני תרבות ', רוב התאים המבדילים או הבדיל במהירות מתים, ואילו תאי גזע להתחלק ויוצרים האשכולות הסלולר. פעולה זו מאפשרת את הדור של תרבות NS המתחזק glioma הגידול תכונות16,17,18. Glioma NS ניתן להעריך כמה היבטים של הגידול ביולוגיה, כולל הניתוח של סמנים ביולוגיים בעלי יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירה glioma NS להטביע את התרבויות 3D פרפין לשימוש עבור IHC מכתים. אחד היתרונות של תיקון והטבעה glioma NS הוא כי המורפולוגיה של NS נשמר טוב יותר בהשוואה ל- cytospin המקובלת בשיטה19, אילו glioma NS מוכתבת עליהם מניפולציה מלחיץ עבור תא דיסוציאציה, להיות שיטוח. בנוסף, הטבעה המרווה כל ביטוי fluorophore אנדוגני מהגידול מהונדס גנטית NS, המאפשרים צביעת על פני ספקטרום פלורסנט. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשמר את המבנה התלת-ממד של תאים glioma דרך פרפין הטמעת תהליך אפיון של glioma neurospheres באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

ניתוח של חלבון ביטוי glioma רלוונטי עבור מספר היבטים במחקר של הפתולוגיה שלו. חלבונים רבים תוארו גם סמנים ביולוגיים עם יישומים אבחון, הפרוגנוזה, סיווג, מצב של התקדמות הגידול, ובמדינה תא בידול. ניתוחים אלה של סמנים שימושיים גם לאפיין הגידול neurospheres (NS) המופקים glioma חולים ומודלים glioma. הגידול NS מספקות מודל ערך במבחנה כדי להעריך את תכונות שונות של הגידול שממנו הם נגזרים, ניתן באופן מדויק יותר מראה glioma ביולוגיה. כאן נתאר שיטת מפורט לניתוח סמנים סרטניים NS באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) על גידול פרפין-מוטבע NS.

לעקוב אחר התפתחות גידולים ולהעריך אם הגידול הגיע הגודל הדרוש ליצירת NS, ניתחנו את לומינסנציה הנפלטת גידולים באמצעות ביולומינסנציה. פעולה זו מאפשרת לימוד יעילות התמרה חושית הגורים, התקדמות הגידול ע י האות הפריה חוץ גופית של לוציפראז (איור 1א' ו-<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי ניתן להשתמש כדי ללמוד את נוכחותו של סמן ביולוגי glioma על ידי שיטה המשמרת את המבנה 3D של נוירוספרות הגידול. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא כי המורפולוגיה של נוירוספרות נשמר בהשוואה לשיטת cytospin שבו תאים נתונים מניפולציה מלחיצה ולהיות שטוח. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכות אחרות תרבת רקמות שבו תאים מתורבתים 3D ותחזוקה של המבנה חשוב.כדי להתחיל, נוירוספרות גידול תרבות או NS בבקבוק T-25 עד התאים הם confluent. בחר את הגידול NS בצינור חרוט 15 מיליליטר. אל תדהים את האן.אן.איי ב-300 אלף למשך חמש דקות.לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של 10% פורמלין ו דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוסף חמישה מיליליטר של HBSS ל- NS המושעה מחדש. אל תדהים את התאים כפי שתואר קודם לכן. מניחים את הצינור המכיל את גלולה על קרח.להשעות מחדש את גלולת NS שטף ב 500 microliters של שני אחוזים נוזל חם אגרוז. ומערבבים על ידי צינור עדין או ערבוב. מניחים את NS מוטבע אגרוז על קרח עד הפולימרים אגרוז.ואז להסיר את פיסת אגרוז, מחזיק את NS. מניחים את חתיכת אגווז לתוך קלטת לעיבוד רקמות. קבעו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס. ולהכניס בזהירות את הלהב לתוך המיקרוטום.ואז למקם את בלוק הפרפין לתוך המיקרוטום. ביד אחת, לחץ על הידית השולטת בעובי של כל קטע הממוקם בצד שמאל של המכונה. לחץ על הידית לתחנה השנייה כדי להגדיר את המיקרוטום לעובי של 30 מיקרומטר.סובב את גלגל היד גס כדי להתחיל לקצץ את הבלוק. לאחר ש פני השטח של המדגם כמעט נחשפים, הגדר את הידית השולטת בעובי לחמישה או עשרה מיקרומטרים. הפסק לחתוך כאשר מגיעים לפני השטח של הדגימה.מלאו קופסת קרח בקרח ומספיק מים כדי להגן על גוש הפרפין מלגעת ישירות בקרח. השלך את להב המיקרוטום הישן והכנס להב חדש לקטע. יבש את בלוק הפרפין עם גזה והצב אותו על המיקרוטום.סובב את גלגל היד גס כדי להתחיל חתך את הפרפין. לאחר מכן השתמשו במברשת צבע לחה כדי להעביר את סרט הפרפין לאמבט המים של 42 מעלות צלזיוס. בעזרת עקומת המדחפים, מניחים את המדפים בין שני חלקי פרפין ומפרקים את החלקים בעדינות.השתמש במברשת הצבע הלחה כדי לדחוף את המקטעים המופרדים לשקופיות מיקרוסקופ הידבקות טעונות באופן חיובי. ראשית, ממיסים את הפרפין על ידי דגירה של המגלשות במתלה מתכת ב-60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ואז deparaffinize את השקופיות באמצעות דגירה ברכבת הידרציה מחדש בטמפרטורת החדר על פי פרוטוקול הטקסט.אחסן את המגלשות במי ברז כדי למנוע כריכת נוגדנים לא ספציפית. לאחר מכן, הדגירה את השקופיות במאגר ציטראט ב 125 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו 90 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות. אפשר למגלשות להתקרר לפני שטיפתן חמש פעמים במים מזוקקים.לאחר מכן, הדגירה את השקופיות בטמפרטורת החדר ב 0.3% מי חמצן במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות, שלוש פעמים במאגר כביסה עם תסיסה עדינה. הדגירה את המגלשות לילה בתא לח להגדיר ארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני מדולל.לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות בנוגדן משני ביוטינילציה מדולל בטמפרטורת החדר במשך שעה. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות במאגר כביסה עם תסיסה עדינה.לאחר מכן, הדגירה את המגלשות במתחם פרוקסידזה חזרת avidin-biotinylated בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעה. חזור על הכביסה כמתואר לעיל. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות עם DAB מי חמצן מצע מותגים במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.יש לשטוף את המגלשות במי ברז ולטבול את המגלשות בתקשת המטוקסילין כדי לנטרל אותן. לאחר מכן שוטפים את המגלשות ביסודיות במי ברז עד שהמים מתבהרים. ייבש את השקופיות בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לבסוף, מכסה את השקופיות עם מדיום הרכבה מבוסס קסילן ולאפשר להם להתייבש על משטח שטוח בטמפרטורת החדר. בפרוטוקול זה, NS קבועים ומוטבעים אגרוז ופרפין. ואז הם מוכתמים לסמנים ביולוגיים ספציפיים של גליומה.רמת הביטוי של ATRX, חלבון מלווה התיווך מבנה הכרומטין, נמוכה. Ki67, סמן ביולוגי של התפשטות תאים, הוא חיובי ב NS גליומה. לבסוף, NS הם גם חיוביים עבור OLIG2, גורם שעתוק המתווך התמורות oligodendrocyte. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשעות מחדש את התאים היטב ב agarose חם לפני המעבר לקרח, כדי להבטיח הפצה שווה של נוירוספרות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

תרבית משותפת של נוירונים גלוטמטריים ותאי גליומה ברמה גבוהה לילדים למכשירים מיקרופלואידיים להערכת אינטראקציות חשמליות

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...