Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) sovvenzioni R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 a m.g.c.; NIH/NINDS concede R01-NS076991, R01-NS082311 e R01-NS096756 al Domaine; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; il reparto di neurochirurgia; Cuori felici di Leah m.g.c. e Domaine; e RNA biomedicina Grant F046166 a m.g.c. f.m.m. è supportato da un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. era sostenuto da una Fulbright-argentino Ministero dello sport e formazione Fellowship.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. generazione di cervello tumore neurosfere derivata da un modello di Mouse
<ol><li>Prima della procedura di dissezione, preparare i supporti delle cellule staminali neurali (NSC Media: DMEM/F12 con 1 supplemento di x B27, 1 x N2 supplemento, 1 x normocin e 1 x antibiotico/antimicotico completati con umana ricombinante EGF e basic-FGF alle concentrazioni di ...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. 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In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per eseguire esame immuno-istochimico su paraffina glioma NS, che mantengono la caratteristica struttura 3D delle cellule del tumore crescendo nel cervello in situ. Questa tecnica possiede i seguenti vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule piastrate su vetro o superfici in plastica: io) conservazione della struttura 3D del NS; II) evitando di stress di dissociazione di cella prima dell'analisi dell'espressione della proteina; III) tempra...

I gliomi sono i tumori solidi primari del sistema nervoso centrale classificati dalle loro caratteristiche fenotipiche e genotipiche secondo l' organizzazione mondiale della sanità1. Questa classificazione incorpora la presenza o l'assenza di mutazioni di driver, che rappresentano una fonte interessante di biomarcatori2. Biomarcatori sono caratteristiche biologiche che possono essere misurate e valutate per indicare processi normali e patologici, come pure la risposta farmacologica ad un intervento terapeutico3. Biomarcatori possono essere rilevati nel tessuto del tumore e cellule derivate da glioma, permettendo la sua caratterizzazione biologica in diversi aspetti. Alcuni esempi di biomarcatori di glioma mutato Isocitrato deidrogenasi 1 (IDH1), un enzima del mutante caratteristico dei gliomas di qualità inferiore connesso con migliore prognosi4. IDH1 mutato è espressa frequentemente in combinazione con TP53 e sindrome ritardo mentale/di alfa-talassemia X-collegata (ATRX)-mutazioni inattivanti, definendo un glioma specifico sottotipo4,5. Mutazioni inattivanti ATRX anche verificano nel 44% dei gliomas di prima scelta pediatrica2,6 e sono state associate con i tumori aggressivi e l'instabilità genomica6,7. Inoltre, i gliomi pontine intrinseci diffusi pediatrici (DIPG) sono differenziati in sottogruppi secondo la presenza o l'assenza di una mutazione K27M nel gene di istone H3 H3F3A o in HIST1H3B/C gene1,6. Pertanto, l'introduzione di caratterizzazione molecolare permette la suddivisione, studio e trattamento dei gliomi come entità separate, che più vi permetterà lo sviluppo di ulteriori terapie per ogni sottotipo mirate. Inoltre, l'analisi dei biomarker può essere utilizzato per valutare i diversi processi biologici quali apoptosi8, autofagia9, ciclo cellulare progressione10, cellula proliferazione11e differenziazione delle cellule12 .
Modelli animali geneticamente ingegnerizzati che harbor le lesioni genetiche presenti nei cancri umani sono fondamentali per lo studio delle vie che mediano di progressione di malattia di segnalazione. Il nostro laboratorio ha implementato l'utilizzo del sistema transposase Sleeping Beauty (SB) per sviluppare modelli murini geneticamente di glioma che harboring le mutazioni specifiche che ricapitolano glioma umano sottotipi13,14. Caratteristiche salienti del mirroring presentano nei tumori in situ15, questi modelli murini geneticamente sono utilizzati per la generazione di NS tumore-derivato, che consentono gli studi in vitro in un sistema 3D. Inoltre, il trapianto di orthotopical di NS nei topi può generare tumori secondari che conservano le caratteristiche del tumore primario e imitano le proprietà istopatologiche, genomiche e fenotipiche del tumore primario corrispondente15.
Nella coltura privo di siero, cellule di tumore cerebrale con proprietà delle cellule staminali possono essere arricchite e in presenza di fattori di crescita epidermici (EGF) e fattori di crescita del fibroblasto (FGF), può essere coltivate come singole colonie di cellule derivate come culture NS. In questo sistema di coltura selettiva, la maggior parte delle cellule di differenziazione o differenziate rapidamente muoiono, mentre cellule staminali dividere e formare i cluster cellulari. Questo consente la generazione di una cultura di NS che mantiene glioma tumore caratteristiche16,17,18. Glioma NS può essere utilizzato per valutare diversi aspetti della biologia del tumore, tra cui l'analisi di biomarcatori che hanno applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare glioma NS e incorporare le culture 3D in paraffina per essere utilizzato per la colorazione IHC. Uno dei vantaggi di fissaggio e l'incorporamento di glioma NS è che la morfologia del NS è mantenuta meglio rispetto ai convenzionali cytospin metodo19, in cui glioma NS sono sottoposti a manipolazione stressante per dissociazione delle cellule e diventare appiattito. Inoltre, l'incorporamento estingue qualsiasi espressione endogena fluoroforo da tumore geneticamente NS, consentendo la colorazione attraverso gli spettri di fluorescenza. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preservare la struttura 3D delle cellule di glioma attraverso una processo di inclusione a paraffina e consentire la caratterizzazione di glioma neurosfere usando immunohistochemistry.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analisi dell'espressione proteica in glioma sono rilevante per diversi aspetti nello studio della sua patologia. Numerose proteine sono state descritte come biomarcatori con applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Queste analisi di biomarcatori sono anche utili per caratterizzare tumore neurosfere (NS) generato da glioma pazienti e modelli di glioma. Tumore NS forniscono un modello prezioso in vitro per valutare diverse caratteristiche del tumore da cui sono derivate e più accuratamente possibile specchio glioma biologia. Qui descriviamo un metodo dettagliato per analizzare biomarcatori nel tumore NS usando immunohistochemistry (IHC) su paraffina-incastonato del tumore NS.

Per monitorare lo sviluppo del tumore e valutare se il tumore ha raggiunto le dimensioni necessarie per generare NS, abbiamo analizzato la luminescenza emessa dai tumori tramite bioluminescenza. Questo consente lo studio dell'efficienza di trasduzione nei cuccioli e la progressione del tumore dal segnale di luminescenza della luciferasi (Figura 1A e 1B). Quando le dimensioni del tumore raggiungono un segnale di 1 x 107</...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per studiare la presenza di biomarcatore di glioma con un metodo che preserva la struttura 3D delle neurosfere tumorali. Il principale vantaggio di questo protocollo è che la morfologia delle neurosfere viene mantenuta rispetto al metodo dei citospini in cui le cellule sono sottoposte a manipolazione stressante e si appiattisce. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi altro sistema di coltura tissutale in cui le cellule sono coltivate in 3D e il mantenimento della struttura è importante.Per cominciare, coltura di neurosfere tumorali o NS in un pallone T-25 fino a quando le cellule non sono confluenti. Eleggere l'NS tumorale in un tubo conico da 15 millilitri. Impellet l'NS a 300 G per cinque minuti.Successivamente, sospendere il pellet in un millilitro di formalina al 10% e incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere cinque millilitri di HBSS all'NS ri-sospeso. Impellet le cellule come descritto in precedenza. Posizionare il tubo contenente il pellet sul ghiaccio.Sospendere di nuovo il pellet NS lavato in 500 microlitri di agarosio liquido caldo al due per cento. E mescolare con una tubazione delicata o mescolando. Posizionare l'Agarosio incorporato NS sul ghiaccio fino a quando l'agarosio polimerizza.Quindi rimuovere il pezzo di agarosio, tenendo l'NS. Posizionare il pezzo di agarosio in una cassetta per la lavorazione dei tessuti. Impostare un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. E inserire con cura la lama nel microtomo.Quindi posizionare il blocco di paraffina nel microtomo. Con una mano, premere verso il basso sulla leva che controlla lo spessore di ogni sezione situata sul lato sinistro della macchina. Premere la leva fino al secondo arresto per impostare il microtomo su uno spessore di 30 micrometri.Ruotare il volantino grossolano per iniziare a tagliare il blocco. Una volta che la superficie del campione è quasi esposta, impostare la leva che controlla lo spessore a cinque o 10 micrometri. Interrompere il taglio quando viene raggiunta la superficie del campione.Riempire una ghiacciaia con ghiaccio e acqua sufficiente per proteggere il blocco di paraffina dal toccare direttamente il ghiaccio. Scartare la vecchia lama del microtomo e inserirne una nuova per la sessatura. Asciugare il blocco di paraffina con garza e posizionarlo sul microtomo.Ruotare la ruota a mano grossolana per iniziare a sessare la paraffina. Quindi utilizzare un pennello umido per trasferire il nastro di paraffina al bagno d'acqua di 42 gradi Celsius. Utilizzando la curva delle forcep, posizionare le forcep tra due sezioni di paraffina e allontanare delicatamente le sezioni.Utilizzare il pennello umido per spingere le sezioni separate su vetrini del microscopio ad adesione caricati positivamente. In primo luogo, sciogliere la paraffina incubando gli scivoli in un rack metallico a 60 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi deparaffinizzare le diapositive tramite incubazione in un treno di reidratazione a temperatura ambiente secondo il protocollo di testo.Conservare i vetrini nell'acqua del rubinetto per evitare il legame anticorpale non specifico. Successivamente, incubare le diapositive in tampone di citrato a 125 gradi Celsius per 30 secondi e 90 gradi Celsius per 10 secondi. Lasciare raffreddare i vetrini prima di risciacquarli cinque volte con acqua distillata.Successivamente, incubare i vetrini a temperatura ambiente in perossido di idrogeno allo 0,3% per 20 minuti. Quindi, lavare gli scivoli per cinque minuti, tre volte in tampone di lavaggio con delicata agitazione. Incubare i vetrini durante la notte in una camera umidificata impostata a quattro gradi Celsius con anticorpo primario diluito.Dopo questo, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti con delicata agitazione. Successivamente, incubare le diapositive in anticorpi secondari biotinilati diluiti a temperatura ambiente per un'ora. Lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti in tampone di lavaggio con delicata agitazione.Quindi, incubare gli scivoli nel complesso perossidasi del rafano biotinilato di avidina a temperatura ambiente al buio per un'ora. Ripetere il lavaggio come descritto in precedenza. Successivamente, incubare le diapositive con le marche di substrato di perossido di idrogeno DAB per due o cinque minuti a temperatura ambiente.Risciacquare gli scivoli con acqua del rubinetto e immergere gli scivoli in soluzione di ematossilina per controbilanciarli. Quindi sciacquare accuratamente gli scivoli nell'acqua del rubinetto fino a quando l'acqua non scorre limpida. Disidratare le diapositive in base al protocollo di testo.Infine, coprire le diapositive con un mezzo di montaggio a base di xilene e consentire loro di asciugare su una superficie piana a temperatura ambiente. In questo protocollo, gli NS sono fissi e incorporati in agarosio e paraffina. E poi sono macchiati per specifici biomarcatori di glioma.Il livello di espressione di ATRX, una proteina chaperone che media la struttura della cromatina, è basso. Ki67, un biomarcatore della proliferazione cellulare, è positivo nel glioma NS. Infine, gli NS sono positivi anche per OLIG2, un fattore di trascrizione che media la differenziazione degli oligodendrociti. La cosa più importante da ricordare è sospendere di nuovo bene le cellule nell'agarosio caldo prima di trasferirsi sul ghiaccio, per garantire una distribuzione uniforme delle neurosfere.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinazione del livello di espressione della proteina in cellule coltivate di immunocitochimica su blocchi di paraffina celle

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-coltura di neuroni glutamatergici e cellule di glioma pediatrico di alto grado in dispositivi microfluidici per valutare le interazioni elettriche

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...