Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
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이 작품은 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 보조금 R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 M.G.C.;에 의해 지원 되었다 NIH/NINDS 부여 R01-NS076991, R01-NS082311, 및 R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; 신경외과 학과; 레 아의 행복 한 마음은 M.G.C. 및 P.R.L.; 그리고 RNA 의학 그랜트 F046166 M.G.C. F.M.M.에 의해 한 F31 NIH/NINDS-F31NS103500 지원 됩니다. Jp 모 간 풀브라이트 아르헨티나 스포츠 사역 및 교육 협력에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 뇌 종양 Neurospheres 마우스 모델에서 파생 된 세대
<ol><li>해 부 절차 전에 신경 줄기 세포 미디어 준비 (NSC 미디어: 1 x B27 보충, 1 x N2 보충, 1 x normocin, 및 1 x 항생제/antimycotic 인간 재조합 EGF와 20 ng/ml 각 농도에서 기본적인 FGF 보충 DMEM/F12). NSC 미디어의 300 µ L와 1.5 mL 튜...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

이 문서에서는, 우리 선발 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 glioma NS에 수행 하기 위해 다양 하 고 재현할 수 방법 두뇌 제자리에서 성장 하는 종양 세포의 특성 3 차원 구조를 유지 하는. 이 기술은 유리 또는 플라스틱 표면에 도금 하는 셀을 사용 하 여 다음과 같은 이점을: 난) NS;의 3D 구조의 보존 ii) 단백질 표정;의 분석 하기 전에 셀 분리의 스트레스의 방지 3) 유전자 조작된 종양 NS, 사?...

Gliomas 중추1세계 보건 기구 따르면 그들의 phenotypic genotypic 특성에 의해 분류의 기본 고체 종양입니다. 이 분류는 생체2의 매력적인 소스를 나타내는 드라이버 돌연변이의 유무를 통합 합니다. 생체 측정 하 고 치료 적 개입3약리 응답 뿐 아니라 정상 및 병 적인 프로세스를 나타내기 위해 평가 될 수 있는 생물 학적 특징입니다. 바이오 마커의 검출 될 수 있다 종양 조직에 셀 glioma에서 파생 된 다양 한 측면에서의 생물 학적 특성 사용. Glioma biomarkers의 몇 가지 예로 돌연변이 isocitrate 효소 1 (IDH1), 돌연변이 효소 더 나은 예 지4와 관련 된 낮은-학년 gliomas의 있습니다. IDH1 돌연변이 TP53 알파 thalassemia/정신 박약 증후군 X 연결 (ATRX)와 함께에서 자주 표현 된다-돌연변이 비활성화 특정 glioma 정의 하위4,5. ATRX 비활성화 돌연변이 또한 소아 고급 gliomas2,6 의 44%에서 발생 하 고 공격적인 종양 및 게놈 불안정성6,7관련 된 되었습니다. 또한, 소아 확산 본질적인 pontine gliomas (DIPG)는 히스톤 H3 유전자 H3F3A, 또는 HIST1H3B/C 유전자1,6K27M 돌연변이의 유무에 따라 하위 그룹에서 분화 된다. 따라서, 분자 특성의 소개 허용 세분, 연구, 그리고 더 더 개발 하면 별도 엔터티로 gliomas의 치료 대상으로 각 하위 형식에 대 한 치료. 또한, biomarkers의 분석 apoptosis8, autophagy9, 세포 주기 진행10, 셀 확산11, 세포 분화12 등 다른 생물 학적 과정을 평가에 사용할 수 있습니다. .
유전자 조작된 동물 모델 인간의 암 발생에 유전적 병 변의 항구는 질병의 진행을 중재 하는 통로 신호 하는 연구를 위한 중요 합니다. 우리의 실험실 glioma 은닉 인간의 glioma 하위13,14정리 특정 돌연변이의 유전자 조작된 마우스 모델 개발에 잠자는 아름다움 (SB) transposase 시스템의 사용을 구현 했습니다. 이러한 유전자 조작된 마우스 모델 3D 시스템에서 생체 외에서 연구는 종양에서 파생 된 NS를 생성 하는 데 사용 됩니다, 그리고 미러링 현저한 특징 종양에 원래의15에 제시. 또한, 쥐로 NS orthotopical 이식 1 차 종양의 기능을 유지 하 고 해당 기본 종양15의 histopathological, 게놈, 및 phenotypic 특성을 모방 하는 이차 종양을 생성할 수 있습니다.
혈 청 무료 문화에서 뇌 종양 세포 줄기 세포 특성을 가진 농축 될 수 있다, 그리고 표 피 성장 인자 (EGF)과 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 존재 그들은 NS 문화 등 단일 세포 유래 식민지로 성장 될 수 있다. 이 선택적 문화 시스템에 대부분 차별화 또는 차별화 된 세포 급속 하 게 죽어, 반면 줄기 세포 분열과 세포 클러스터 형성. NS 문화 glioma 종양 기능16,,1718유지를 생성 수 있습니다. Glioma NS 종양 생물학, 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램의 분석을 포함 한 여러 가지 측면을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 glioma NS를 생성 하 고 사용 되는 파라핀에 3D 문화를 포함 하는 프로토콜 세부 IHC 얼룩에 대 한. 담합 및 glioma NS 포함의 장점 중 하나는 NS의 형태는 유지 더 나은 기존의 cytospin 방법19, 어떤 glioma에서 NS 셀 분리에 대 한 스트레스가 조작에 복종 하 고 평평 하 게 될에 비해입니다. 또한, 유전자 조작된 종양 NS, 형광 스펙트럼에 걸쳐 얼룩 사용에서 생 fluorophore 식 냉각 포함. 이 방법의 전반적인 목표는 과정을 포함 한 파라핀 glioma 셀의 3 차원 구조를 유지 하 고 glioma neurospheres immunohistochemistry를 사용 하 여 특성을 사용 하입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Glioma에 단백질 발현의 분석은 여러 가지 측면의 병 리의 연구에 관련이 있습니다. 수많은 단백질 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램으로 설명 했습니다. 생체의 이러한 분석은 또한 종양 neurospheres (NS) glioma 환자 및 glioma 모델에서 생성 된 특성을 유용 합니다. 종양 NS 모델을 귀중 한 생체 외에서 평가는 그들이 파생 되 고 미러 glioma 생물학을 더 정확 하 게 수 있습니다 종양의 다른 기능을 제공 합니다. 종양 NS 바이오 마커 분석 하는 자세한 방법을 설명 여기에 파라핀 포함 종양 NS immunohistochemistry (IHC)를 사용 하 여.

종양 개발 모니터링 및 평가 종양 NS를 생성 하는 데 필요한 크기에 도달 하면, 우리는 생물 발광을 사용 하 여 종양에 의해 방출 하는 발광 분석. (그림 1A , 1B) luciferase의 발광 신호에 의해 새끼 및 종양 진행에 변환 효율의 연구 수 있습니다. 종양 크기는 1 x 107 광자/s/cm2/sr (그림 1B)?...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

이 프로토콜은 종양 신경구의 3D 구조를 보존하는 방법에 의해 신경교종 바이오마커의 존재를 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 프로토콜의 주요 장점은 세포가 스트레스 조작을 실시하고 평평해지는 사이토스핀 방법에 비해 신경권의 형태가 유지된다는 것입니다. 이 방법은 세포가 3D로 배양되고 구조의 유지보수가 중요한 다른 조직 배양 시스템에 적용될 수 있다.시작하려면, 세포가 수렴 될 때까지 T-25 플라스크에서 배양 종양 신경구 또는 NS. 15 밀리리터 원내 관에서 종양 NS를 선출한다. NS를 300 Gs에서 5분간 임펠트하십시오.그 후, 펠릿을 10%의 포르말린 1밀리리터로 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 다시 중단된 NS에 HBSS 5밀리리터를 추가합니다. 이전에 설명한 바와 같이 세포를 임펠트합니다. 펠릿이 들어 있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.2% 따뜻한 액체 아가로즈의 500 마이크로 리터에 세척 된 NS 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 부드러운 파이펫팅이나 교반으로 섞는다. 아가로즈가 중합될 때까지 아가로즈가 내장된 NS를 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 NS를 잡고 아가로즈 조각을 제거합니다. 아가로즈 조각을 조직 처리를 위해 카세트에 넣습니다. 수조를 섭씨 42도까지 설정합니다. 그리고 조심스럽게 마이크로 톤에 블레이드를 삽입합니다.그런 다음 파라핀 블록을 마이크로토메에 넣습니다. 한 손으로 는 기계의 왼쪽에 있는 각 섹션의 두께를 제어하는 레버를 누릅니다. 레버를 두 번째 정지로 눌러 마이크로토메를 30 마이크로미터 두께로 설정합니다.거친 손 바퀴를 돌려 블록 트리밍을 시작합니다. 시료의 표면이 거의 노출되면 두께를 5 또는 10 마이크로미터로 제어하는 레버를 설정합니다. 샘플 표면에 도달하면 트리밍을 중지합니다.얼음 상자와 파라핀 블록이 얼음에 직접 닿지 않도록 충분한 물로 채웁니다. 오래된 마이크로톤 블레이드를 버리고 단면에 새 칼을 삽입합니다. 파라핀 블록을 거즈로 말리고 마이크로톤에 놓습니다.거친 손 바퀴를 돌려 파라핀을 단면화하기 시작합니다. 그런 다음 젖은 페인트 브러시를 사용하여 파라핀 리본을 섭씨 42도의 수조로 옮겨냅니다. 집게의 곡선을 사용하여 두 파라핀 섹션 사이에 집게를 배치하고 섹션을 부드럽게 밀어 넣습니다.젖은 페인트 브러시를 사용하여 분리된 부분을 양전하 접착 현미경 슬라이드로 밀어 넣습니다. 먼저, 20분 동안 60°C의 금속 랙에 슬라이드를 배양하여 파라핀을 녹입니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 실온에서 재수화 열차에서 배양을 통해 슬라이드를 분리합니다.비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 슬라이드를 수돗물에 저장합니다. 그런 다음 125도의 구산완충장에서 슬라이드를 30초 동안, 섭씨 90도에서 10초 동안 배양합니다. 증류수로 5번 헹구기 전에 슬라이드를 식힙니다.다음으로, 20 분 동안 0.3 %의 과산화수소에서 실온에서 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 5 분 동안 세 번 씻고 완충액을 부드럽게 교반합니다. 희석 된 1 차 항체와 섭씨 4도로 설정 된 가습 챔버에서 밤새 슬라이드를 배양.그런 다음 슬라이드를 부드러운 동요로 5분간 세 번 씻습니다. 다음으로, 1시간 동안 실온에서 희석된 바이오티니드 이차 항체의 슬라이드를 배양한다. 부드러운 동요로 버퍼를 세척하여 슬라이드를 5분간 세 번 씻습니다.그런 다음 어둠 속에서 실온에서 아비딘-바이오타이니드 고추냉이 과로시다제 복합체에서 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. 이전에 설명한 대로 세척을 반복합니다. 그 후, 실온에서 2~5분 동안 DAB 과산화수소 기판 브랜드로 슬라이드를 배양한다.슬라이드를 수돗물로 헹구고 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 찍어 카운터스테인을 처리합니다. 그런 다음 물이 맑아질 때까지 수돗물로 슬라이드를 완전히 헹구십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드를 탈수합니다.마지막으로, 커버는 자일렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 슬립하고 실온에서 평평한 표면에서 건조할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜에서 NS는 아가로즈 및 파라핀에 고정되고 내장되어 있습니다. 그리고 그(것)들은 특정 신경교종 biomarkers를 위해 염색됩니다.크로마틴 구조를 중화시키는 샤페론 단백질인 ATRX의 발현 수준은 낮습니다. Ki67은 세포 증식의 바이오마커로서 신경교종 NS에서 양성이다. 마지막으로, NS는 올리고드엔드로시테 분화를 중재하는 전사 인자 인 OLIG2에도 긍정적이다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 신경구의 균등한 분포를 보장하기 위해 얼음으로 옮겨지기 전에 따뜻한 아가로즈에서 세포를 잘 중단하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...