Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) tilskudd R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 å M.G.C.; NIH/NINDS gir R01-NS076991, R01-NS082311 og R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Department of Neurosurgery; Leah Happy Hearts M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedisin Grant F046166 å M.G.C. F.M.M. støttes av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. ble støttet av et Fulbright-argentinsk departementet av idrett og utdanning fellesskap.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Michigan.
1. generasjon av hjerne svulst Neurospheres avledet fra en musemodell
<ol><li>Før disseksjon prosedyren, forberede nevrale stamceller media (NSC Media: DMEM/F12 med 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin og 1 x antibiotika/antimycotic supplert med menneskelige rekombinant EGF og basic-FGF i konsentrasjoner på 20 ng/mL hver). Fylle en 1,5 mL tube me...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

I denne artikkelen detalj vi en allsidig og reproduserbar metode for å utføre immunohistochemistry på parafin-embedded glioma NS, som opprettholde karakteristiske 3D strukturen av kreftceller vokser i hjernen i situ. Denne teknikken har følgende fordeler over bruker celler belagt på glass eller plast overflater: jeg) bevaring av 3D NS; II) å unngå stress av cellen dissosiasjon før analyse av protein uttrykk. III) slukke alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker ov...

Gliomas er primære solide svulster i sentralnervesystemet klassifisert av deres fenotypiske og genotypic egenskaper i henhold til Verdens helseorganisasjon1. Klassifiseringen inkluderer tilstedeværelse eller fravær av driveren mutasjoner, som representerer en attraktiv kilde biomarkers2. Biomarkers er biologiske egenskaper som kan måles og evalueres for å indikere normal og patologisk prosesser, samt farmakologiske svar til terapeutisk intervensjon3. Biomarkers kan oppdages i tumor vev og celler avledet fra glioma, slik at dens biologiske karakteristikk i ulike aspekter. Eksempler på glioma biomarkers er muterte isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), en mutert enzym karakteristisk for lavere grad gliomas assosiert med bedre prognose4. Muterte IDH1 uttrykkes ofte i kombinasjon med TP53 og alpha-talassemi/mental retardasjon syndrom X-koblet (ATRX)-inaktivere mutasjoner, definere en bestemt glioma undertype4,5. ATRX-inaktivere mutasjoner også forekommer i 44% av pediatric høyverdig gliomas2,6 og er forbundet med aggressiv svulster og genomisk ustabilitet6,7. I tillegg er pediatric diffus iboende pontine gliomas (DIPG) differensiert i undergrupper etter tilstedeværelse eller fravær av en K27M mutasjon histone H3 genet H3F3A eller HIST1H3B/C gen1,6. Derfor innføringen av molekylære karakterisering tillater underinndeling, studiet og behandling av gliomas som separate enheter, noe som gjør mer utvikling av mer målrettet terapi for hver undertype. I tillegg kan analyse av biomarkers brukes til å evaluere ulike biologiske prosesser som apoptose8, autophagy9, celle syklus progresjon10, celle spredning11og celledifferensiering12 .
Genmodifiserte dyr modeller som havn genetisk lesjoner i kreft hos mennesker er avgjørende for å studere signalnettverk trasé som megle sykdomsprogresjon. Vårt laboratorium har implementert bruk av Sleeping Beauty (SB) transposase systemet å utvikle genmodifiserte musen modeller av glioma skjuler spesifikke mutasjoner som recapitulate menneskelige glioma subtyper13,14. Modellene genmodifiserte mus brukes for å generere svulst-avledet NS, som aktiverer i vitro studier i et 3D-system, speiling viktigste funksjonene finnes i svulster i situ15. Orthotopical transplantasjon av NS i mus kan også generere sekundære svulster som beholde funksjoner av den primære svulsten og etterligner egenskapene histopathological genomisk og fenotypiske av tilsvarende primære svulst15.
I serum-free kultur, hjerne svulst cellene med stilk celleegenskaper kan bli beriket, og i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-avledet kolonier som NS kulturer. I dette selektiv kultur-systemet dør mest unike eller differensierte celler raskt, mens stilk celler dele og danne mobilnettet klynger. Dette tillater generering av en NS kultur som opprettholder glioma svulst funksjoner16,17,18. Glioma NS kan brukes til å vurdere flere aspekter av svulst biologi, inkludert analyse av biomarkers som har programmer i diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Her vi detalj en protokoll for å generere glioma NS og bygg inn 3D kulturer i parafin skal brukes til IHC farging. En fordel av bestemmer og innebygging glioma NS er at morfologi av NS opprettholdes bedre sammenlignet med konvensjonelle cytospin metoden19, som glioma NS er utsatt for stressende manipulasjon for cellen dissosiasjon og bli jevnet. I tillegg slukker innebygging alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker over til fluorescerende spectra. Det overordnede målet med denne metoden er å bevare 3D strukturen av glioma celler gjennom en parafin innebygging prosessen og aktiverer karakterisering av glioma neurospheres med immunohistochemistry.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analyse av protein uttrykk i glioma er relevant for flere aspekter i studiet av dens patologi. Mange proteiner har blitt beskrevet som biomarkers programmer diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Disse analysene av biomarkers er også nyttig å karakterisere svulst neurospheres (NS) fra glioma pasienter og glioma modeller. Svulst NS gi en verdifull i vitro modell for å vurdere ulike funksjoner av svulsten som de er avledet og kan mer nøyaktig speil glioma biologi. Her beskriver vi en detaljert metode for å analysere biomarkers i svulst NS med immunohistochemistry (IHC) på parafin-embedded svulst NS.

For å overvåke tumor utvikling og vurdere om svulsten har nådd størrelse nødvendig å generere NS, analyserte vi luminescence slippes ut av svulster med bioluminescens. Dette gjør at studiet av signaltransduksjon effektivitet i pups og svulst progresjon av luminescence signalet fra luciferase (figur 1A og 1B). Når tumor størrelse når et signal på 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (figur 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres dyrket som 3D kulturer utgjør et kraftig verktøy for å studere glioma biologi. Her presenterer vi en protokoll for å utføre immunohistochemistry samtidig 3D oppbygning glioma neurospheres gjennom parafininnstøper. Denne metoden kan karakterisering av glioma neurosphere egenskaper som stemness og nevrale differensiering.

Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Denne protokollen er betydelig fordi kan brukes til å studere tilstedeværelsen av glioma biomarkør ved en metode som bevarer 3D-strukturen av tumornevrosfærer. Den største fordelen med denne protokollen er at morfologien til nevrosfærer opprettholdes sammenlignet med cytospinmetode der celler blir utsatt for stressende manipulasjon og blir flatet ut. Denne metoden kan brukes på andre vevkultursystemer der celler dyrkes i 3D og vedlikehold av strukturen er viktig.Til å begynne, kultur tumor neurospheres eller NS i en T-25 kolbe til cellene er samløpet. Velg svulsten NS i et 15 milliliter konisk rør. Impellet NS på 300 Gs i fem minutter.Etter dette, re-suspendere pellet i en milliliter på 10% formalin og inkubere røret ved romtemperatur i 10 minutter. Legg til fem milliliter HBSS til den re-suspenderte NS. Impellet cellene som tidligere beskrevet. Plasser røret som inneholder pelleten på isen.Re-suspender den vasket NS pellet i 500 mikroliter av to prosent varm væske oppsto. Og bland ved en mild pipettering eller omrøring. Plasser agarose innebygd NS på is til agarose polymeriserer.Fjern deretter stykke agarose, holder NS. Plasser biten av agarose i en kassett for vevsbehandling. Sett et vannbad til 42 grader Celsius. Og sett bladet forsiktig inn i mikrotomen.Plasser deretter parafinblokken i mikrotomen. Med én hånd trykker du ned spaken som styrer tykkelsen på hver del på venstre side av maskinen. Trykk spaken til det andre stoppet for å sette mikrotomen til en tykkelse på 30 mikrometer.Drei det grove håndhjulet for å begynne å trimme blokken. Når overflaten på prøven er nesten utsatt, sett spaken som styrer tykkelsen til fem eller 10 mikrometer. Slutt å trimme når overflaten på prøven er nådd.Fyll en isboks med is og akkurat nok vann til å beskytte parafinblokken fra å berøre isen direkte. Kast det gamle mikrotombladet og sett inn et nytt for snitting. Tørk parafinblokken med gasbind og legg den på mikrotomen.Vri det grove håndhjulet for å begynne å dele parafinen. Bruk deretter en fuktig pensel til å overføre parafinbåndet til 42 grader Celsius vannbad. Bruk kraftens kurve, plasser tangen mellom to parafinseksjoner og skyv seksjonene forsiktig fra hverandre.Bruk den fuktige penselen til å skyve de separerte delene på positivt ladede vedheftsmikroskopsklier. Først smelter parafinen ved å inkubere lysbildene i et metallstativ ved 60 grader Celsius i 20 minutter. Deretter deparaffinere lysbildene via inkubasjon i et re-hydreringstog ved romtemperatur i henhold til tekstprotokollen.Oppbevar lysbildene i vann fra springen for å unngå ikke-spesifikk antistoffbinding. Etter dette, inkuber lysbildene i citrate buffer på 125 grader Celsius i 30 sekunder og 90 grader Celsius i 10 sekunder. La lysbildene avkjøles før du skyller dem fem ganger med destillert vann.Deretter inkuberer lysbildene ved romtemperatur på 0,3% hydrogenperoksid i 20 minutter. Vask deretter lysbildene i fem minutter, tre ganger i vaskebuffer med mild agitasjon. Inkuber lysbildene over natten i et fuktet kammer satt til fire grader Celsius med fortynnet primært antistoff.Etter dette vasker du lysbildene tre ganger i fem minutter med mild agitasjon. Deretter inkubere lysbildene i fortynnet biotinylert sekundært antistoff ved romtemperatur i en time. Vask lysbildene tre ganger i fem minutter i vaskebuffer med mild agitasjon.Deretter inkubere lysbildene i ivrig-biotinylert pepperrot peroksidase kompleks ved romtemperatur i mørket i en time. Gjenta vasken som tidligere beskrevet. Etter dette, inkuber lysbildene med DAB hydrogenperoksid substrat merker i to til fem minutter ved romtemperatur.Skyll lysbildene med vann fra springen og dypp lysbildene i hematoksylinløsning for å motvirke dem. Skyll deretter skliene grundig i vann fra springen til vannet renner klart. Dehydrere lysbildene i henhold til tekstprotokollen.Til slutt, dekkerskliene med et xylenbasert monteringsmedium og la dem tørke på en flat overflate ved romtemperatur. I denne protokollen er NS fast og innebygd i agarose og parafin. Og så er de farget for spesifikke glioma biomarkører.Uttrykksnivået til ATRX, et chaperone-protein som formidler kromatinstruktur, er lavt. Ki67, en biomarkør for cellespredning, er positiv i glioma NS. Til slutt er NS også positive for OLIG2, en transkripsjonsfaktor som formidler oligodendrocyttdilatering. Det viktigste å huske er å re-suspendere cellene godt i den varme agarose før du overfører til is, for å sikre en jevn fordeling av nevrosfærer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Fastsettelse av Protein uttrykk nivå i kulturperler celler av Immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farging på parafin-embedded lysbilder av pT3N0M0 magekreft vev

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-Time overvåking av Human glioma Cell migrasjon på rygg rot Ganglion axon-Oligodendrocyte co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Samkultur av glutamatergeiske nevroner og pediatriske gliomaceller av høy kvalitet til mikrofluidiske enheter for å vurdere elektriske interaksjoner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immunocytokjemi analyser av pediatrisk diffus midtlinje gliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital romlig profilering for karakterisering av mikromiljøet i voksen type diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...