Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; o departamento de neurocirurgia; Corações feliz da Leah M.G.C. e P.R.L.; e RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. foi apoiado por um argentino Fulbright Ministério do esporte e educação Fellowship.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. geração de Neurospheres de Tumor de cérebro derivado de um modelo de Mouse
<ol><li>Antes do procedimento de dissecação, preparar a mídia de células-tronco neurais (NSC Media: DMEM/F12 com 1 suplemento de x B27, 1 x N2 suplemento, 1 x normocin e 1 x antibiótico/antimicótico suplementado com humano recombinante EGF e basic-FGF em concentrações d...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

Neste artigo, detalhamos um método versátil e pode ser reproduzido para realizar a imuno-histoquímica na parafina glioma NS, que mantêm a estrutura 3D característica de células de tumor crescendo no cérebro em situ. Esta técnica possui as seguintes vantagens sobre usando células chapeadas em vidro ou superfícies de plástico: eu) preservação da estrutura 3D do NS; II) evitando stress de dissociação de célula antes da análise da expressão da proteína; III) têmpera de qualquer expressão de fluo...

Gliomas são tumores sólidos primários do sistema nervoso central, classificadas por suas características fenotípicas e genotípicas de acordo com a Organização Mundial de saúde1. Esta classificação incorpora a presença ou ausência de mutações do motorista, que representam uma fonte atraente de biomarcadores2. Biomarcadores são características biológicas que podem ser medidas e avaliadas para indicar processos normais e patológicos, bem como respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica3. Biomarcadores podem ser detectados no tecido do tumor e células derivadas de glioma, permitindo a sua caracterização biológica em diferentes aspectos. Alguns exemplos de biomarcadores de glioma mutante isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), uma enzima mutante característica de gliomas de baixo grau associadas a melhor prognóstico4. IDH1 mutado é expressa frequentemente em combinação com TP53 e síndrome de deficiência de alfa-talassemia/mental ligada ao X (ATRX)-Inactive mutações, definindo um glioma específico de subtipo4,5. ATRX-inactivar as mutações também ocorrem em 44% dos gliomas de alto grau pediátrica2,6 e têm sido associadas com tumores agressivos e instabilidade genômica6,7. Além disso, pediátricas gliomas Pontinas intrínsecas difusas (DIPG) são diferenciadas em subgrupos de acordo com a presença ou ausência de uma mutação K27M no gene de histona H3 H3F3A, ou no gene1,HIST1H3B/C6. Portanto, a introdução de caracterização molecular permite a subdivisão, estudo e tratamento de gliomas como entidades separadas, o que permitirá mais o desenvolvimento de mais direcionados a terapias para cada subtipo. Além disso, a análise de biomarcadores pode ser usada para avaliar diferentes processos biológicos, tais como apoptose8, autofagia9, de progressão do ciclo celular10, proliferação de célula11e diferenciação celular12 .
Modelos de animais geneticamente modificados que abrigam as lesões genéticas presentes em cânceres humanos são fundamentais para o estudo da sinalização de caminhos que medeiam a progressão da doença. Nosso laboratório implementou o uso do sistema de transposase beleza dormindo (SB) para desenvolver modelos de rato geneticamente modificados de glioma abrigando mutações específicas que recapitular glioma humano subtipos13,14. Estes modelos de rato geneticamente modificados são usados para gerar tumor derivado NS, que permitem estudos em vitro em um sistema 3D, espelhamento principais características presentes nos tumores in situ15. Além disso, o transplante de orthotopical de NS em ratos pode gerar tumores secundários que retêm características do tumor primário e imitam as propriedades fenotípicas, genômicas e histopatológicas do tumor primário correspondente15.
Em cultura livre de soro, células de tumor cerebral com propriedades de célula-tronco podem ser enriquecidas, e na presença de fatores de crescimento epidérmico (EGF) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGF), eles podem ser crescidos como colônias única derivado de células, tais como culturas de NS. Neste sistema de cultura seletiva, a maioria das células de diferenciação ou diferenciados rapidamente morrer, Considerando que as células-tronco dividir e formar os grupos celulares. Isto permite a geração de uma cultura de NS que mantém glioma tumor características16,17,18. Glioma NS pode ser usado para avaliar diversos aspectos da biologia do tumor, incluindo a análise de biomarcadores que têm aplicações em diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Aqui, detalhamos um protocolo para gerar glioma NS e incorporar as culturas 3D em parafina a ser usado para coloração de IHC. Uma vantagem da fixação e incorporação de glioma NS é que a morfologia do NS é mantida melhor em comparação ao convencional cytospin método19, no qual glioma NS estão sujeitos à manipulação estressante para dissociação da célula em tornam-se achatados. Além disso, a incorporação sacia qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente. O objectivo geral deste método é para preservar a estrutura 3D de células de glioma através de uma processo de incorporação de parafina e permitir a caracterização de glioma neurospheres usando imuno-histoquímica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Análise da expressão da proteína no glioma é relevante para vários aspectos no estudo da sua patologia. Inúmeras proteínas têm sido descritas como biomarcadores com aplicações no diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Essas análises de biomarcadores também são úteis para caracterizar o tumor neurospheres (NS) gerados a partir de pacientes de glioma e modelos de glioma. Tumor NS fornecem um modelo valioso em vitro para avaliar diferentes características do tumor do qual eles são derivados e podem com mais precisão o espelho glioma biologia. Aqui nós descrevemos um método detalhado para analisar biomarcadores em tumor NS usando imuno-histoquímica (IHC) tumor de parafina NS.

Para monitorar o desenvolvimento do tumor e avaliar se o tumor tiver atingido o tamanho necessário para gerar NS, analisamos a luminescência emitida por tumores usando a bioluminescência. Isso permite que o estudo da eficiência de transdução nos filhotes e progressão do tumor pelo sinal da luminescência de luciferase (Figura 1A e 1B). Quando o tamanho do tumor atinge um sinal de 1 x 107 fótons/s/cm2/RS (<s...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Este protocolo é significativo porque pode ser usado para estudar a presença de biomarcador de glioma por um método que preserva a estrutura 3D das neurosferas tumorais. A principal vantagem deste protocolo é que a morfologia das neurosferas é mantida em comparação com o método citospina no qual as células são submetidas a manipulação estressante e se tornam achatadas. Este método pode ser aplicado a qualquer outro sistema de cultura tecidual em que as células são cultivadas em 3D e a manutenção da estrutura é importante.Para começar, cultura neurosferas tumorais ou NS em um frasco T-25 até que as células sejam confluentes. Eleja o tumor NS em um tubo cônico de 15 mililitros. Impellet o NS a 300 Gs por cinco minutos.Depois disso, suspenda a pelota em um mililitro de 10% de formalina e incubar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. Adicione cinco mililitros de HBSS ao NS re-suspenso. Impellet as células como descrito anteriormente. Coloque o tubo contendo a pelota no gelo.Suspenda a pelota NS lavada em 500 microliters de 2% de líquido quente. E misture por um cachimbo suave ou agitação. Coloque a ágarose incorporada NS no gelo até que a agarose polimerize.Em seguida, remova o pedaço de agarose, segurando o NS. Coloque o pedaço de agarose em uma fita para processamento de tecidos. Coloque um banho de água a 42 graus Celsius. E insira cuidadosamente a lâmina no microtome.Em seguida, coloque o bloco de parafina no microtome. Com uma mão, pressione para baixo na alavanca que controla a espessura de cada seção localizada no lado esquerdo da máquina. Pressione a alavanca até a segunda parada para definir o microtómeo com uma espessura de 30 micrômetros.Gire a roda de mão grosseira para começar a aparar o bloco. Uma vez que a superfície da amostra esteja quase exposta, defina a alavanca que controla a espessura para cinco ou 10 micrômetros. Pare de aparar quando a superfície da amostra for atingida.Encha uma caixa de gelo com gelo e água suficiente para proteger o bloco de parafina de tocar diretamente o gelo. Descarte a lâmina de microtome antiga e insira uma nova para secção. Seque o bloco de parafina com gaze e coloque-o no microtoma.Gire a roda de mão grosseira para começar a seccionar a parafina. Em seguida, use um pincel úmido para transferir a fita de parafina para o banho de água de 42 graus Celsius. Usando a curva dos fórceps, coloque os fórceps entre duas seções de parafina e empurre as seções separadas suavemente.Use o pincel úmido para empurrar as seções separadas em slides de microscópio de adesão carregados positivamente. Primeiro, derreta a parafina incubando os slides em um rack de metal a 60 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, desparafinar os slides via incubação em um trem de re-hidratação à temperatura ambiente de acordo com o protocolo de texto.Armazene os slides na água da torneira para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Depois disso, incubar os slides no tampão citrato a 125 graus Celsius por 30 segundos e 90 graus Celsius por 10 segundos. Deixe os slides esfriarem antes de enxágüe-os cinco vezes com água destilada.Em seguida, incubar os slides à temperatura ambiente em 0,3% peróxido de hidrogênio por 20 minutos. Em seguida, lave os slides por cinco minutos, três vezes na lavagem do tampão com agitação suave. Incubar os slides durante a noite em uma câmara umidificada fixada a quatro graus Celsius com anticorpo primário diluído.Depois disso, lave os slides três vezes por cinco minutos com agitação suave. Em seguida, incubar os slides em anticorpo secundário biotinilado diluído à temperatura ambiente por uma hora. Lave os slides três vezes durante cinco minutos na lavagem do tampão com agitação suave.Em seguida, incubar os slides no complexo de peróxido de rabanete avidin-biotinilado a temperatura ambiente no escuro por uma hora. Repita a lavagem como descrito anteriormente. Depois disso, incubar os slides com marcas de substrato de peróxido de hidrogênio DAB por dois a cinco minutos em temperatura ambiente.Enxágüe os slides com água da torneira e mergulhe os slides na solução de hematoxilina para contratendá-los. Em seguida, enxágue as lâminas completamente na água da torneira até que a água se esclaeça. Desidratar os slides de acordo com o protocolo de texto.Finalmente, cubra os slides com um meio de montagem à base de xileno e deixe-os secar em uma superfície plana à temperatura ambiente. Neste protocolo, ns são fixos e incorporados em agarose e parafina. E então eles são manchados para biomarcadores glioma específicos.O nível de expressão do ATRX, uma proteína de acompanhante que media a estrutura da cromatina, é baixo. Ki67, um biomarcador da proliferação celular, é positivo no glioma NS. Finalmente, o NS também é positivo para o OLIG2, um fator de transcrição que media a diferenciação oligodendrocito. A coisa mais importante a se lembrar é suspender as células bem na agarose quente antes de transferir para o gelo, para garantir uma distribuição uniforme das neurosferas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Pesquisa do câncer

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...