Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) гранты R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 до M.G.C.; NIH/NINDS предоставляет R01-NS076991, R01-NS082311 и R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Кафедра нейрохирургии; Счастливые сердца Лии M.G.C. и P.R.L.; и РНК биомедицины Грант F046166 в M.G.C. F.M.M. поддерживается путем F31 NIH/NINDS-F31NS103500. Ю.П. была поддержана Фулбрайта-аргентинский Министерства спорта и образования стипендий.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.
1. поколение Neurospheres опухоли мозга, производных от модели мыши
<ol><li>Перед процедурой рассечение, подготовить нервных стволовых клеток СМ...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

В этой статье мы подробно универсальным и воспроизводимый метод, чтобы выполнить иммуногистохимия на парафин врезанных глиомы NS, которые поддерживают характерным 3D структура клеток опухоли, растущие в мозг в situ. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с использовани...

Глиомы являются первичных твердых опухолей центральной нервной системы, классифицируются по их Фенотипические и генотипические характеристики согласно Всемирной организации здравоохранения1. Эта классификация включает в себя наличие или отсутствие драйверов мутаций, которые представляют собой привлекательный источник биомаркеров2. Биомаркеры являются биологические характеристики, которые могут быть измерены и оценены для обозначения нормальных и патологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство3. Биомаркеры могут быть обнаружены в опухолевой ткани и клетки, полученные от глиомы, позволяя ее биологических характеристик в различных аспектах. Некоторые примеры глиомы крысы биомаркеров мутировавших isocitrate дегидрогеназа 1 (IDH1), мутант фермента, характерные для младших классов глиомы, связанные с лучше прогноза4. Мутировавшие IDH1 часто выражается в сочетании с TP53 и альфа талассемия/умственной отсталости синдром Х-хромосомой (ATRX)-инактивации мутации, определение конкретных глиомы подтип4,5. ATRX-инактивации мутации также происходят в 44% педиатрических полноценного глиомы2,6 и были связаны с агрессивными опухолями и геномная нестабильность6,7. Кроме того педиатрических диффузных встроенные Понтийские глиомы (DIPG) продифференцируйте в подгруппах по наличие или отсутствие K27M мутации гена гистонов H3 H3F3A, или HIST1H3B/C ген1,6. Таким образом, введение молекулярная характеристика разрешает подразделение, исследования и лечения глиомы как отдельные объекты, которые позволят более разработку более целенаправленных терапии для каждого подтипа. Кроме того анализ биомаркеров может использоваться для оценки различных биологических процессов, например апоптоз8, autophagy9, клеточный цикл прогрессии10, распространения клеток11и дифференцировки клеток12 .
Генетически модифицированные Животные модели, которые гавани генетических в человеческих раковых поражений являются критическими для изучения сигнальные пути, которые посредником прогрессирования заболевания. Наша лаборатория осуществляет использования системы Транспозаза Спящая красоты (SB) в разработке генетически модифицированные мыши модели глиомы, укрывательство специфических мутаций, которые пилки человека глиомы подтипы13,14. Эти генетически модифицированные мыши модели используются для генерации опухоль производные NS, которые позволяют в vitro исследования в системе 3D, зеркального отображения характерных особенностей присутствует в опухоли в situ15. Кроме того orthotopical трансплантация NS в мышей может генерировать вторичные опухоли, которые сохраняют особенности первичной опухоли и имитировать гистопатологические, геномных и фенотипических свойств соответствующей первичной опухоли15.
Сыворотка свободной культуры мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток может быть расширен, в присутствии эпидермальный фактор роста (EGF) и факторы роста фибробластов (ФБП), их можно выращивать как единый колоний клеток, полученных как NS культур. В этой системе выборочной культуры большинство дифференциации или дифференцированных клеток быстро умирают, тогда как стволовые клетки разделяют и формируют сотовой кластеров. Это позволяет генерации NS культуры, которая поддерживает глиомы опухоли особенности16,17,18. Глиомы NS может использоваться для оценки некоторых аспектов опухоли биологии, включая анализ биомаркеров, которые находят применение в диагностике, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Здесь, мы подробно протокол для создания глиомы NS и вставлять 3D культур в парафин используемый для окрашивания IHC. Одним из преимуществ установления и внедрения глиомы NS является, что морфология NS поддерживается лучше по сравнению с обычными cytospin метод19, в котором глиомы NS подвергаются стрессовым манипуляции для диссоциации клеток и стали плоскими. Кроме того внедрение утоляет любое выражение эндогенного Флюорофор от генетически опухоли NS, позволяя окрашивание через флуоресцентные спектров. Общая цель этого метода является сохранение 3D структура клеток глиомы через парафин, встраивание процесс и дать характеристику neurospheres глиомы, используя иммуногистохимия.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Анализ выражения протеина в глиомы актуальна для ряда аспектов в изучении его патологии. Многочисленные белки были описаны как биомаркеров с приложениями в диагноз, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Эти анализы биомаркеров полезны также для характеристики опухоли neurospheres (NS) генерируется глиомы пациентов и глиомы модели. Опухоль NS обеспечивают ценный в vitro модель для оценки различных характеристик опухоли, из которого они являются производными и может более точно зеркало глиомы биологии. Здесь мы описываем метод подробный анализ биомаркеров в опухоли NS с помощью иммуногистохимия (IHC) на опухоли парафин врезанных NS.

Для мониторинга развития опухоли и оценить, если опухоль достигла размера, необходимого для создания NS, мы проанализировали люминесценции, испускаемых опухоли с помощью биолюминесценции. Это позволяет исследование эффективности трансдукции детенышей и прогрессии о...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres выращивают как 3D культур являются мощным инструментом для изучения биологии глиомы. Здесь мы представляем протокол для выполнения иммуногистохимия при сохранении 3D структура глиомы neurospheres через встраивание парафина. Этот метод позволяет характеристика глиомы нейросферы свойств, таких как stemness и нейронных дифференциации.

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку может быть использован для изучения присутствия биомаркера глиомы методом, который сохраняет 3D структуру опухолевых нейросфер. Основным преимуществом этого протокола является то, что морфология нейросфер поддерживается по сравнению с методом цитоскопина, при котором клетки подвергаются стрессовым манипуляциям и становятся сплющенными. Этот метод может быть применен к любым другим системам культуры тканей, в которых клетки культури в 3D и поддержание структуры имеет важное значение.Для начала, культура опухолевых нейросфер или NS в колбе Т-25, пока клетки не будут стечены. Избрать опухоль NS в 15 миллилитров конической трубки. Impellet NS на 300 Gs в течение пяти минут.После этого повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр 10%формалин и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте пять миллилитров HBSS в повторно приостановленный NS. Impellet клетки, как описано ранее. Поместите трубку, содержащую гранулы, на лед.Повторно приостанавливайте промытую гранулу NS в 500 микролитров двухпроцентной теплой жидкой агарозы. И смешать нежным пипетки или перемешивания. Поместите агарозу, встроенную NS, на лед до тех пор, пока агароза не полимеризируется.Затем удалите кусок агарозы, держа NS. Поместите кусок агарозы в кассету для обработки тканей. Установите водяную баню до 42 градусов по Цельсию. И аккуратно вставьте лезвие в микротом.Затем поместите парафиновый блок в микротом. С одной стороны, нажмите вниз на рычаг, который контролирует толщину каждой секции, расположенной на левой стороне машины. Нажмите рычаг на вторую остановку, чтобы установить микротом до толщины 30 микрометров.Поверните грубое колесо руки, чтобы начать обрезку блока. После того, как поверхность образца почти подвергается, установите рычаг, который контролирует толщину до пяти или 10 микрометров. Прекратите обрезку, когда поверхность образца будет достигнута.Заполните ледяную коробку со льдом и достаточно воды, чтобы защитить парафиновую глыму от прямого прикосновения к льду. Откажитесь от старого лезвия микротомы и вставьте новое для секциоровки. Высушите парафиновый блок марлей и поместите его на микротому.Поверните грубое колесо руки, чтобы начать раздел парафина. Затем используйте влажную кисть для переноса парафиновой ленты на водяную баню 42 градуса по Цельсию. Используя кривую типсов, поместите типсы между двумя парафинами и аккуратно раздвигите секции.Используйте влажную кисть, чтобы подтолкнуть разделенные разделы на положительно заряженные слайды адгезионого микроскопа. Во-первых, растопить парафин, инкубируя горки в металлической стойке при 60 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем депарафинировать слайды через инкубацию в регидратационном поезде при комнатной температуре в соответствии с текстовым протоколом.Храните слайды в водопроводной воде, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. После этого инкубировать слайды в буфере цитрата при 125 градусах по Цельсию в течение 30 секунд и 90 градусов по Цельсию в течение 10 секунд. Дайте слайдам остыть перед полоскать их пять раз дистиллированной водой.Затем инкубировать слайды при комнатной температуре в 0,3% перекиси водорода в течение 20 минут. Затем промойте горки в течение пяти минут, три раза в стиральном буфере с нежным возбуждением. Инкубировать слайды на ночь в увлажненной камере установлен на четыре градуса по Цельсию с разбавленным первичным антителом.После этого трижды мыть горки в течение пяти минут с нежным возбуждением. Затем инкубировать слайды в разбавленных биотинилированных вторичных антител при комнатной температуре в течение часа. Вымойте горки три раза в течение пяти минут в стиральном буфере с нежным возбуждением.Затем инкубировать горки в avidin-биотинилированных хрена пероксидазы комплекса при комнатной температуре в темноте в течение часа. Повторите стирку, как описано ранее. После этого инкубировать слайды с МАЗ перекиси перекиси субстрата брендов в течение двух-пяти минут при комнатной температуре.Промыть горки водопроводной водой и окунуть слайды в раствор гематоксилина, чтобы противостоять им. Затем тщательно промойте горки в водопроводной воде, пока вода не прояснится. Обезвоживать слайды в соответствии с текстовым протоколом.Наконец, крышки слайдов с ксиленом основе монтажа среды и позволяют им высохнуть на плоской поверхности при комнатной температуре. В этом протоколе NS фиксируются и встраиваются в агарозу и парафин. И тогда они окрашены для конкретных биомаркеров глиомы.Уровень экспрессии ATRX, белка сопровождающего, который опосредует структуру хроматина, низок. Ki67, биомаркер пролиферации клеток, является положительным в глиоме NS. Наконец, NS также являются положительными для OLIG2, транскрипционный фактор, который является посредником олигодендроцитов дифференциации. Самое главное помнить, чтобы вновь приостановить клетки хорошо в теплой агарозы перед передачей на лед, чтобы обеспечить равномерное распределение нейросфер.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Определение уровня выражения протеина в культивируемых клеток Immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Мониторинг в режиме реального времени миграции клеток глиомы человека на dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Кокультура глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Цифровое пространственное профилирование для характеристики микросреды при диффузно проникающей глиоме взрослого типа

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...