Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
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Este trabajo fue financiado por los institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) subvenciones R37-NS094804, NS074387 R01, R21-NS091555 a M.G.C.; NIH/NINDS becas R01-NS076991, NS082311 R01 y R01-NS096756 de P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; el Departamento de Neurocirugía; Corazones felices de Leah a M.G.C. y P.R.L.; y RNA biomedicina Grant F046166 a M.G.C. F.M.M. es apoyado por un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. fue apoyado por Fulbright Argentina Ministerio de deportes y educación beca.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. generación de neuroesferas de Tumor cerebral derivado de un modelo de ratón
<ol><li>Antes del procedimiento de la disección, preparar medios de células madre neurales (NSC medios: DMEM/F12 con 1 x B27 suplemento, suplemento de x N2 1, normocin x 1 y 1 x antibiótico/antimicótico con recombinante humano EGF y basic-FGF a concentraciones ...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

En este artículo detallamos un método reproducible y versátil para realizar inmunohistoquímica en parafina-encajado glioma NS, que mantienen la característica estructura 3D de las células del tumor en el cerebro in situ. Esta técnica posee las siguientes ventajas sobre usar células plateadas en superficies de plástico o vidrio: i) preservación de la estructura 3D del NS; II) evitando de la tensión de disociación celular antes del análisis de expresión de la proteína; III) amortiguamiento de cualqu...

Los gliomas son los tumores sólidos primarios del sistema nervioso central clasificados por sus características fenotípicas y genotípicas según la Organización Mundial de la salud1. Esta clasificación incorpora la presencia o ausencia de mutaciones del conductor, que representan una atractiva fuente de biomarcadores2. Biomarcadores son características biológicas que pueden ser medidas y evaluadas para indicar procesos normales y patológicos, así como la respuesta farmacológica a una intervención terapéutica3. Biomarcadores se pueden detectar en el tejido del tumor y las células derivadas de glioma, lo que permite su caracterización biológica en diferentes aspectos. Algunos ejemplos de biomarcadores de glioma mutado Isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), una enzima del mutante de gliomas de bajo grado asociados a mejor pronóstico4. IDH1 transformada se expresa con frecuencia en combinación con el síndrome de la alfa-talasemia/retraso mental X-ligado (ATRX) y TP53-hacer inactivo mutaciones, definiendo un glioma específico subtipo4,5. ATRX inactivar mutaciones también se producen en el 44% de gliomas de alto grado pediátrica2,6 y han sido asociadas con tumores agresivos e inestabilidad genómica6,7. Además, los gliomas del pontine intrínsecos difusos pediátricos (DIPG) se distinguen en subgrupos según la presencia o ausencia de una mutación de K27M en el gene de histona H3 H3F3A, o en el gen HIST1H3B/C1,6. Por lo tanto, la introducción de caracterización molecular permite la subdivisión, estudio y tratamiento de los gliomas como entidades separadas, que se permite el desarrollo de más objetivo terapias para cada subtipo. Además, puede utilizarse el análisis de biomarcadores para evaluar diferentes procesos biológicos tales como apoptosis8autofagia9, de la progresión del ciclo celular10, proliferación de la célula11y diferenciación celular12 .
Modelos animales modificados genéticamente que albergan las lesiones genéticas presentes en los cánceres humanos son críticos para el estudio de la señalización de las vías que median la progresión de la enfermedad. Nuestro laboratorio ha implementado el uso del sistema transposasa belleza durmiente (SB) para el desarrollo de modelos de ratón modificados genéticamente de glioma abrigar mutaciones específicas que recapitulan glioma humano subtipos13,14. Estos modelos de ratón modificados genéticamente se utilizan para generar tumor derivado NS, que permiten estudios en vitro en un sistema 3D, espejadas características presentan en los tumores in situ15. Además, el trasplante de orthotopical de NS en ratones puede generar tumores secundarios que retienen características del tumor primario y mímico las características histopatológicas, genómicas y fenotípicas del tumor primario correspondiente15.
En cultivo libre de suero, las células del tumor cerebral con propiedades de células madre pueden ser enriquecidas y en presencia de factores de crecimiento epidérmicos (EGF) y factores de crecimiento de fibroblasto (FGF), pueden cultivarse como solo colonias derivadas de células como las culturas NS. En este sistema de cultivo selectivo, mayoría diferenciadoras o diferenciadas de las células mueren rápidamente, mientras que células madre se dividen y forman los grupos celulares. Esto permite la generación de una cultura de NS que mantiene glioma tumor características16,17,18. Glioma NS puede utilizarse para evaluar varios aspectos de la biología del tumor, incluyendo el análisis de biomarcadores que tienen aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Aquí detallamos un protocolo generar glioma NS e integrar las culturas 3D en parafina para ser utilizado para la tinción de IHC. Una ventaja de fijación y embebido glioma NS es que la morfología del NS se mantiene mejor en comparación con el cytospin convencional método19, en que glioma NS son sometido a manipulación estresante para disociación celular y ser aplanado. Además, incrustar apaga cualquier expresión endógena fluoróforo de tumor genéticamente NS, lo que permite la tinción a través de los espectros fluorescentes. El objetivo general de este método es preservar la estructura 3D de las células del glioma a través de un proceso de inclusión de parafina y caracterización de neuroesferas de glioma usando immunohistochemistry.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Análisis de expresión de proteínas en glioma es relevante por varios aspectos en el estudio de su patología. Se han descrito numerosas proteínas como biomarcadores con aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Estos análisis de biomarcadores también son útiles para caracterizar el tumor neuroesferas (NS) generados a partir de pacientes de glioma y modelos de glioma. Tumor NS proporcionan un modelo valioso en vitro para evaluar diversas características de tumor de que se derivan y pueden más exactamente espejo glioma biología. Aquí describimos un método detallado para analizar biomarcadores en tumor NS mediante inmunohistoquímica (IHQ) en tumor de parafina-encajado NS.

Para monitorear el desarrollo de tumores y evaluar si el tumor ha alcanzado el tamaño necesario para generar NS, analizamos la luminiscencia emitida por tumores mediante bioluminiscencia. Esto permite el estudio de la eficiencia de la transducción de señales en los cachorros y la progresión del tumor por la señal de luminiscencia de luciferasa (figura 1A y 1B). Cuando el tamaño de tumor alcanza una señal de 1 x 10...

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para estudiar la presencia de biomarcador de glioma mediante un método que preserva la estructura 3D de las neuroesferas tumorales. La principal ventaja de este protocolo es que la morfología de las neuroesferas se mantiene en comparación con el método de citospino en el que las células son sometidas a una manipulación estresante y se aplanan. Este método se puede aplicar a cualquier otro sistema de cultivo de tejido en el que las células se cultivan en 3D y el mantenimiento de la estructura es importante.Para empezar, el cultivo de neuroesferas tumorales o NS en un matraz T-25 hasta que las células son confluentes. Elija el tumor NS en un tubo cónico de 15 mililitros. Impellear el NS a 300 Gs durante cinco minutos.Después de esto, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de 10%formalina e incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Agregue cinco mililitros de HBSS al NS re-suspendido. Impellear las células como se describió anteriormente. Coloque el tubo que contiene el pellet sobre hielo.Vuelva a suspender el pellet NS lavado en 500 microlitros de agarosa líquida caliente dos por ciento. Y mezcle con un suave pipeteo o agitación. Coloque la agarosa incrustada en el hielo hasta que la agarosa se polimerice.A continuación, retire el trozo de agarosa, sosteniendo el NS. Coloque la pieza de agarosa en un casete para el procesamiento de tejidos. Ponga un baño de agua a 42 grados centígrados. E inserte cuidadosamente la cuchilla en el microtoma.A continuación, coloque el bloque de parafina en el microtoma. Con una mano, presione hacia abajo en la palanca que controla el grosor de cada sección situada en el lado izquierdo de la máquina. Presione la palanca en la segunda parada para ajustar el microtoma a un espesor de 30 micrómetros.Gire la rueda de mano gruesa para comenzar a recortar el bloque. Una vez que la superficie de la muestra está casi expuesta, ajuste la palanca que controla el espesor a cinco o 10 micrómetros. Deje de recortar cuando se alcance la superficie de la muestra.Llene una caja de hielo con hielo y suficiente agua para proteger el bloque de parafina de tocar directamente el hielo. Deseche la hoja de microtomo antigua e inserte una nueva para el seccionamiento. Seque el bloque de parafina con gasa y colóquelo en el microtome.Gire la rueda de mano gruesa para comenzar a sedar la parafina. A continuación, utilice un pincel húmedo para transferir la cinta de parafina al baño de agua Celsius de 42 grados. Usando la curva de los fórceps, coloque los fórceps entre dos secciones de parafina y empuje las secciones separados suavemente.Utilice el pincel húmedo para empujar las secciones separadas sobre las diapositivas del microscopio de adhesión cargadas positivamente. Primero, derrite la parafina incubando los portaobjetos en un estante metálico a 60 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, desparafinar los portaobjetos a través de la incubación en un tren de rehidratación a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo de texto.Almacene los portaobjetos en agua del grifo para evitar la unión de anticuerpos no específica. Después de esto, incubar los portaobjetos en tampón de citrato a 125 grados Celsius durante 30 segundos y 90 grados Celsius durante 10 segundos. Deje que los portaobjetos se enfríen antes de enjuagarlos cinco veces con agua destilada.A continuación, incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos. A continuación, lave los portaobjetos durante cinco minutos, tres veces en el tampón de lavado con agitación suave. Incubar los portaobjetos durante la noche en una cámara humidificada establecida en cuatro grados Celsius con anticuerpo primario diluido.Después de esto, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos con una agitación suave. A continuación, incubar los portaobjetos en anticuerpos secundarios biotinilados diluidos a temperatura ambiente durante una hora. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en el tampón de lavado con agitación suave.Luego, incubar los toboganes en el complejo de peroxidasa de rábano picante avidin-biotinilo a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Repita el lavado como se describió anteriormente. Después de esto, incubar los portaobjetos con marcas de sustrato de peróxido de hidrógeno DAB durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente.Enjuague los portaobjetos con agua del grifo y sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina para contrarrestarlos. A continuación, enjuague bien los portaobjetos en agua del grifo hasta que el agua quede limpia. Deshidrate las diapositivas según el protocolo de texto.Por último, cubra los portaobjetos con un medio de montaje a base de xileno y déjelos secar sobre una superficie plana a temperatura ambiente. En este protocolo, NS son fijos e incrustados en la agarosa y la parafina. Y luego se tiñen para biomarcadores específicos de glioma.El nivel de expresión de ATRX, una proteína de chaperón que media la estructura de la cromatina, es bajo. Ki67, un biomarcador de proliferación celular, es positivo en el glioma NS. Por último, el NS también es positivo para OLIG2, un factor de transcripción que media la diferenciación de oligodendrocitos. Lo más importante a recordar es re-suspender bien las células en la agarosa caliente antes de transferirse al hielo, para asegurar una distribución uniforme de las neuroesferas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Tinción elástica en diapositivas incrustadas en parafina de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...