Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar & Stroke (NIH/NINDS) bidrag R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 till M.G.C.; NIH/NINDS beviljar R01-NS076991, R01-NS082311 och R01-NS096756 till P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Avdelningen för neurokirurgi; Leah's Happy Hearts till M.G.C. och P.R.L.; och RNA biomedicin Grant F046166 till M.G.C. F.M.M. stöds av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. stöddes av ett Fulbright-argentinska ministeriet för idrott och utbildning gemenskap.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från University of Michigan.
1. generering av hjärnan tumören Neurospheres härrör från en musmodell
<ol><li>Innan dissektion förfarandet, Förbered neurala stamceller (NSC Media: DMEM/F12 med 1 x B27 tillägg, 1 x N2 tillägg, 1 x normocin och 1 x antibiotikum/antimycotic kompletteras med humant rekombinant EGF och basic-FGF vid koncentrationer på 20 ng/mL vardera). Fyl...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

I denna artikel detalj vi en mångsidig och reproducerbar metod att utföra immunohistokemi på paraffin-inbäddat gliom NS, som upprätthåller den karakteristiska 3D-strukturen för tumörcellerna växer i den hjärnan i situ. Denna teknik har följande fördelar jämfört med celler pläterade på glas eller plast ytor: jag) bevarandet av 3D-strukturen för NS; (II) att undvika stress av cell dissociation före analys av proteinuttryck. (III) kylning av alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade ...

Gliom är primära solida tumörer i centrala nervsystemet klassificeras efter deras fenotypiska och genotypiska egenskaper enligt Världshälsoorganisationen1. Denna klassificering omfattar närvaron eller frånvaron av drivrutinen mutationer, som utgör en attraktiv biomarkörer2. Biomarkörer är biologiska egenskaper som kan mätas och utvärderas för att indikera normala och patologiska processer, liksom farmakologiska Svaren till en terapeutisk intervention3. Biomarkörer kan upptäckas i tumörvävnad och celler från gliom, gör det möjligt för dess biologiska karakterisering i olika aspekter. Några exempel på gliom biomarkörer muterade isocitrate dehydrogenas 1 (IDH1), en mutant enzym för lägre kvalitet gliom associerade med bättre prognos4karakteristiska. Muterade IDH1 uttrycks ofta i kombination med TP53 och alfa-thalassemi/mental retardation syndrom X-länkade (ATRX)-inactivating mutationer, definiera en specifik gliom subtyp4,5. ATRX-inactivating mutationer också förekommer i 44% av pediatric höggradigt gliom2,6 och har förknippats med aggressiva tumörer och genomisk instabilitet6,7. Dessutom är pediatric diffusa inneboende pontine gliom (DIPG) differentierade i undergrupper enligt närvaron eller frånvaron av en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Därför införandet av molekylär karakterisering tillåter den underavdelning, undersökning och behandling av gliomas som separata enheter, vilket gör mer utveckling av mer riktade terapier för varje subtyp. Dessutom kan en analys av biomarkörer användas för att utvärdera olika biologiska processer såsom apoptos8, autofagi9, cellcykeln progression10, cell spridning11och celldifferentiering12 .
Genmanipulerade djurmodeller som hysa de genetiska lesionerna i mänskliga cancerformer är kritiska för studien av signalering vägar som förmedlar sjukdomsprogression. Vårt laboratorium har infört användning av sovande skönhet (SB) transposase systemet att utveckla genetiskt modifierade musmodeller av gliom härbärgerat specifika mutationer som recapitulate mänskliga glioma subtyper13,14. Dessa genetiskt modifierade musmodeller används för att generera tumör-derived NS, som möjliggör in vitro- studier i en 3D-systemet presenterar spegling framträdande dragen i tumörer i situ15. Orthotopical transplantation av NS i möss kan också generera sekundära tumörer att behålla funktioner av den primära tumören och härma de histopatologiska, genomisk och fenotypiska egenskaperna av motsvarande primärtumör15.
I serumfritt kultur, hjärnan tumörceller med stamceller egenskaper kan berikas och i närvaro av epidermal tillväxtfaktorer (EGF) och fibroblast tillväxtfaktor (FGF), de kan odlas som enda cell-derived kolonier såsom NS kulturer. I detta selektiva kultur system dör mest särskiljande eller differentierade celler snabbt, medan stamceller delar och bildar de cellulära kluster. Detta tillåter generationen av en NS-kultur som upprätthåller gliom tumör funktioner16,17,18. Gliom NS kan användas för att utvärdera flera aspekter av tumörbiologi, inklusive analys av biomarkörer som har program i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Här, vi detalj ett protokoll att generera gliom NS och bädda in 3D kulturerna i paraffin som ska användas för IHC färgning. En fördel med fastställande och inbäddning gliom NS är att morfologi av NS bevaras bättre jämfört med den konventionella cytospin metod19, i vilka gliom NS utsätts för stressande manipulation för cell dissociation och bli tillplattad. Dessutom släcker inbäddning alla endogena fluorophore uttryck från genmanipulerade tumör NS, aktivera färgning över fluorescerande spektra. Det övergripande målet med denna metod är att bevara 3D-strukturen för gliom celler genom en paraffin inbäddning process och aktivera karakterisering av gliom neurospheres med immunohistokemi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Analys av proteinuttryck i gliom är relevant för flera aspekter i studien av dess patologi. Många proteiner har beskrivits som biomarkörer med tillämpningar i diagnos, prognos, klassificering, av tumör progression, och cell differentiering medlemsstat. Dessa analyser av biomarkörer är också användbara att karakterisera tumör neurospheres (NS) genereras från gliom patienter och gliom modeller. Tumör NS ger en värdefull in vitro- modell för att bedöma olika funktioner av tumören från vilken de härrör och kan mer exakt spegel gliom biologi. Här beskriver vi en detaljerad metod för att analysera biomarkörer i tumör NS med immunhistokemi (IHC) på paraffin-inbäddat tumör NS.

För att övervaka tumörutveckling och utvärdera om tumören har nått storlek krävs för att generera NS, analyserade vi de luminiscens som avges av tumörer med Mareld. Detta tillåter studier av transduktion effektivitet i ungar och tumör progression av luminiscens signalera av luciferas (figur 1A och 1B). När storleken på tumören når en signal av 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (figur 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Neurospheres odlas som 3D kulturer utgör ett kraftfullt verktyg för att studera gliom biologi. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra immunohistokemi bibehållen 3D-strukturen för gliom neurospheres genom paraffin inbäddning. Denna metod gör det möjligt för karakterisering av gliom neurosphere egenskaper såsom stemness och neurala differentiering.

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Detta protokoll är betydande eftersom kan användas för att studera förekomsten av gliom biomarkör med en metod som bevarar 3D-struktur tumör neurospheres. Den största fördelen med detta protokoll är att morfologi neurosfärer bibehålls jämfört med cytospin metod där celler utsätts för stressande manipulation och blir tillplattad. Denna metod kan tillämpas på alla andra vävnadsodlingssystem där celler odlas i 3D och underhåll av strukturen är viktigt.Till att börja, kultur tumör neurospheres eller NS i en T-25 kolv tills cellerna är konfluenta. Välj tumören NS i en 15 milliliter koniska röret. Impellet NS på 300 Gs i fem minuter.Efter detta, åter upphäva pelleten i en milliliter av 10%formalin och inkubera röret i rumstemperatur i 10 minuter. Lägg till fem milliliter HBSS till den återuppdragna NS. Impellet cellerna som tidigare beskrivits. Placera röret som innehåller pelleten på is.Åter uppskjut den tvättade NS-pelleten i 500 mikroliter av två procent varm vätska agaros. Och blanda med en mild pipettering eller omrörning. Placera agaros inbäddade NS på is tills agaros polymeriserar.Ta sedan bort den bit av agaros, hålla IS. Placera den del av agaros i en kassett för vävnad bearbetning. Ställ in ett vattenbad till 42 grader Celsius. Och sätt försiktigt in bladet i mikrotomen.Placera sedan paraffinblocket i mikrotomen. Med en hand, tryck ner på spaken som styr tjockleken på varje sektion som sitter på vänster sida av maskinen. Tryck på spaken till det andra stoppet för att ställa in mikrotomen på en tjocklek på 30 mikrometer.Vrid det grova handhjulet för att börja trimma blocket. När provets yta är nästan utsatt, ställ in spaken som styr tjockleken på fem eller 10 mikrometer. Sluta putsa när provets yta har uppnåtts.Fyll en islåda med is och precis tillräckligt med vatten för att skydda paraffinblocket från att direkt röra isen. Kassera det gamla mikrotombladet och sätt in ett nytt för snittning. Torka paraffinblocket med gasbinda och placera det på mikrotomen.Vrid det grova handhjulet för att börja dela upp paraffinen. Använd sedan en fuktig pensel för att överföra paraffinbandet till 42 grader Celsius vattenbad. Med hjälp av täntskuren placerar du täntssnitten mellan två paraffinsektioner och trycker isär sektionerna försiktigt.Använd den fuktiga penseln för att trycka de separerade sektionerna på positivt laddade vidhäftningsmikroskopsglas. Först smälta paraffin genom att inkubera diabilderna i en metall rack på 60 grader Celsius i 20 minuter. Avparaser sedan av objektglasen via inkubation i ett återfuktningståg vid rumstemperatur enligt textprotokollet.Förvara rutschkanorna i kranvatten för att förhindra icke-specifik antikroppsbindning. Efter detta, inkubera bilderna i citratbuffert vid 125 grader Celsius i 30 sekunder och 90 grader Celsius i 10 sekunder. Låt rutschkanorna svalna innan du sköljer dem fem gånger med destillerat vatten.Därefter inkubera objektglasen i rumstemperatur i 0,3%väteperoxid i 20 minuter. Sedan tvättar du bilderna i fem minuter, tre gånger i tvättbuffert med mild agitation. Inkubera glidbanorna över natten i en befuktad kammare inställd på fyra grader Celsius med utspädd primär antikropp.Efter detta tvättar du objektglasen tre gånger i fem minuter med mild agitation. Därefter inkubera objektglasen i utspädd biotinylerad sekundär antikropp vid rumstemperatur i en timme. Tvätta diabilderna tre gånger i fem minuter i tvättbuffert med mild agitation.Sedan, inkubera diabilder i avidin-biotinylerade pepparrot peroxidas komplex vid rumstemperatur i mörkret i en timme. Upprepa tvätten som tidigare beskrivits. Efter detta, inkubera objektglasen med DAB väteperoxid substrat märken för två till fem minuter vid rumstemperatur.Skölj diabilderna med kranvatten och doppa rutschkanorna i hematoxylinlösning för att motse dem. Skölj sedan diabilderna ordentligt i kranvatten tills vattnet rinner klart. Torka ut bilderna enligt textprotokollet.Slutligen täcker täck av glidbanorna med ett xylenbaserat monteringsmedium och låt dem torka på en plan yta vid rumstemperatur. I detta protokoll är NS fasta och inbäddade i agaros och paraffin. Och då är de färgade för specifika gliom biomarkörer.Uttrycksnivån för ATRX, ett förklädeprotein som förmedlar kromatinstruktur, är låg. Ki67, en biomarkör för cellproliferation, är positiv i gliom NS. Slutligen är NS också positiva för OLIG2, en transkriptionsfaktor som förmedlar oligodendrocyte differentiering. Det viktigaste att komma ihåg är att åter avbryta cellerna väl i den varma agaros innan de överförs till is, för att säkerställa en jämn fördelning av neurosfärer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestämning av Protein uttryck nivå i odlade celler genom immuncytokemi på Paraffin-inbäddat Cell block

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk färgning på paraffin-inbäddade diabilder av pT3N0M0 mag cancer vävnad

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real tidsövervakning av humana Glioma cell migration på dorsala root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Samkultur av glutamaterga nervceller och pediatriska högkvalitativa gliomceller till mikrofluidiska enheter för att bedöma elektriska interaktioner

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cell immunocytokemi analyser av pediatriskt diffust mittlinjegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital rumslig profilering för karakterisering av mikromiljön i vuxentyp som diffust infiltrerar gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...