Name: evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Bu eser ulusal kurumları, Sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar & kontur (NIH/NINDS) hibe R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 için M.G.C. tarafından desteklenen; NIH/NINDS verir R01-NS076991, R01-NS082311 ve R01-NS096756 P.R.L. için; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Nörocerrahi bölümü; Leah'ın mutlu Kalpler M.G.C. ve P.R.L.; ve RNA Biyomedikal Grant F046166 M.G.C. F.M.M. için bir F31 NIH/NINDS-F31NS103500 tarafından desteklenir. J.P. bir Fulbright-Arjantinli Bakanlığı spor ve eğitim bursu tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. nesil bir fare modelinden türetilmiş Beyin tümör Neurospheres
<ol><li>Diseksiyon yordamı önce sinir kök hücre ortam hazırlamak (NSC medya: DMEM/F12 özel sayı: 1 x B27, 1 x N2 ek, 1 x normocin ve 1 x antibiyotik/insan rekombinant EGF ve basic-FGF konsantrasyonları 20 ng/mL her yönü ile antimycotic). 1.5 mL tüp NSC medya 300 µL ile dolduru...

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Hochberg, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+diagnostics+and+biomarkers:+an+ongoing+challenge+in+the+field+of+medicine+and+science.">Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science.</a> Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).</li><li>Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+using+DNA+biomarkers:+a+review.">Personalized medicine using DNA biomarkers: a review.</a> Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).</li><li>Ceccarelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+Reveals+Biologically+Discrete+Subsets+and+Pathways+of+Progression+in+Diffuse+Glioma.">Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.</a> Cell. 164 (3), 550-563 (2016).</li><li>Cancer Genome Atlas Research, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive,+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas.">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li><li>Mackay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Molecular+Meta-Analysis+of+1,000+Pediatric+High-Grade+and+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma.">Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma.</a> Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).</li><li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma.">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li><li>Ward, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+apoptosis.">Biomarkers of apoptosis.</a> British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).</li><li>Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=May+autophagy+be+a+novel+biomarker+and+antitumor+target+in+colorectal+cancer.">May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer.</a> Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).</li><li>Williams, G. H., Stoeber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+and+cancer.">The cell cycle and cancer.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).</li><li>Preusser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+index+in+intracranial+ependymoma:+a+promising+histopathological+candidate+biomarker.">Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker.</a> Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).</li><li>Trepant, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OLIG2+as+the+most+specific+glioblastoma+stem+cell+marker+starting+from+comparative+analysis+of+data+from+similar+DNA+chip+microarray+platforms.">Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms.</a> Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).</li><li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma.">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource:+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes.">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li><li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumour+stem+cells.">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).</li><li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells:+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer.">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li><li>Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+experimental+models+and+reality.">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li></ol>

Bu makalede, hangi içinde beyin içinde in situbüyüyen tümör hücreleri karakteristik 3D yapısını korumak immünhistokimya parafin gömülü gliyom NS, gerçekleştirmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntı. Bu teknik cam veya plastik yüzeyler kaplama hücreleri kullanarak üzerinde aşağıdaki avantajları vardır: Ben) NS; 3D yapısını korunması II) protein ifade analiz önce hücre ayrılma stresinin önlenmesi; III) genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleşti...

Gliomas tarafından fenotipik ve genotypic özellikleri1Dünya Sağlık Örgütü göre sınıflandırılmış merkez sinir sisteminin birincil solid tümör vardır. Bu sınıflandırma varlığı ya da yokluğu biyolojik2çekici bir kaynağı temsil sürücü mutasyonlar içermektedir. Biyolojik ölçülen ve terapötik müdahale3farmakolojik yanıtlarının yanı sıra normal ve patolojik işlemleri belirtmek için değerlendirilen biyolojik özellikleri vardır. Biyolojik tespit tümör doku ve hücreleri tümörü türetilmiş, farklı açıdan biyolojik onun karakterizasyonu etkinleştirme. Mutasyona uğramış isocitrate dehidrogenaz 1 (IDH1), bir mutant enzim daha iyi prognoz4ile ilişkili alt-sınıf gliomas karakteristik gliyom biyolojik bazı örnekler. Mutasyona uğramış IDH1 sık sık TP53 ve alfa-talasemi/mental retardasyon sendromu X'e (ATRX) ile birlikte dile getirdi-mutasyon ihracı, belirli bir gliyom tanımlama alt tür4,5. ATRX ihracı mutasyonlar da Pediatrik yüksek kalitede gliomas2,%6 44'ortaya çikmaktadir ve agresif tümörler ve genomik istikrarsızlık6,7ile ilişkili bulunmuştur. Buna ek olarak, Pediatrik diffüz içsel pontine gliomas (DIPG) bir K27M mutasyon histon H3 gen H3F3A veya HIST1H3B/C gen1,6olup göre alt gruplar farklı. Bu nedenle, alt bölümü, çalışma ve gliomas tedavisi daha daha fazla gelişimi sağlayacak ayrı varlıklar olarak Moleküler Karakterizasyonu giriş izni hedefli tedaviler her alt türü için. Buna ek olarak, biyolojik analizini apoptosis8, autophagy9, hücre döngüsü ilerleme10, hücre proliferasyonu11ve hücre farklılaşması12 gibi farklı biyolojik süreçlerin değerlendirmek için kullanılabilir .
İnsan kanser mevcut genetik lezyonlar liman genetiği hayvan modelleri hastalık ilerleme aracılık yolları sinyal çalışması için kritik önem taşımaktadır. Bizim Laboratuvar insan gliyom alt türlerinden13,14özetlemek belirli mutasyonlar yataklık gliyom genetiği fare modelleri geliştirmek için uyku Güzellik (SB) transposase sistemi hayata geçirdi. Bu genetik fare modelleri vitro çalışmalar 3D sisteminde etkinleştirmek tümör kaynaklı NS oluşturmak için kullanılır, tümör içinde in situ15' te yansıtma belirgin özellikleri mevcut. Ayrıca, NS orthotopical nakli fareler içine özelliklerini birincil tümör korumak ve karşılık gelen birincil tümörün15histopatolojik, genomik ve fenotipik özellikleri taklit ikincil tümörler oluşturabilirsiniz.
Kültür, serum-Alerjik Beyin tümör hücreleri kök hücre özellikleri ile zenginleştirilmiş ve epidermal büyüme faktörleri (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) huzurunda onlar NS kültürler gibi tek hücre kaynaklı koloniler olarak yetiştirilir. Kök Hücre Böl ve hücresel kümeleri oluşturur, ancak bu seçici kültür sistemi içinde en ayırt edici veya farklılaşmış hücreler hızla, ölmek. Bu tümörü tümör Özellikler16,17,18tutar bir NS kültür üretimi sağlar. Tümörü NS tümör biyolojisi, tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşma durumu da biyolojik analizi de dahil olmak üzere çeşitli yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, tümörü NS oluşturmak ve 3D kültürler parafin içinde kullanılmak üzere embed için bir protokol ayrıntılı IHC boyama için. Sabitleme ve tümörü NS gömme bir NS morfolojisi daha iyi hangi gliyom NS hücre ayrılma için stresli işleme tabi tutulur ve basık haline geleneksel cytospin yöntemi19' a, göre korunur üstünlüktür. Buna ek olarak, gömme genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden quenches. Bu yöntem genel işlem katıştırma parafin ile tümörü hücreleri 3D yapısını korumak ve karakterizasyonu tümörü neurospheres immünhistokimya kullanarak etkinleştirmek için hedeftir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Coated microtome blade HP35</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:221px;">3150734</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome RM 2135</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:221px;">MR2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-ATRX,</td>
			<td style="width:191px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:221px;">sc-15408</td>
			<td>IHC, 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Rabbit polyclonal anti-Ki-67</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:221px;">Ab15580</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit polyclonal anti-OLIG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>IHC, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated</td>
			<td style="width:191px;">Dako</td>
			<td style="width:221px;">E0432</td>
			<td>IHC, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:305px;">Vectastain Elite ABC HRP kit</td>
			<td style="width:191px;">Vector Laboratories Inc</td>
			<td style="width:221px;">PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td>
			<td style="width:191px;">Biocare medical</td>
			<td style="width:221px;">BDB2004 L/price till 12/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">N-27 Supplement</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:221px;">A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Accutase&#174; Cell Detachment Solution</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:221px;">423201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">AGAROSE LE</td>
			<td style="width:191px;">GoldBio</td>
			<td style="width:221px;">A-201-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">Olympus 15 ml</td>
			<td style="width:221px;">21-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-75 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Genesee Sc. Corporation</td>
			<td style="width:191px;">TC-25 treated Flask</td>
			<td style="width:221px;">25-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:221px;">11330-057</td>
			<td>NS media</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:305px;">HBSS</td>
			<td style="width:191px;">GibcoTM</td>
			<td style="width:221px;">14175-103</td>
			<td>balanced salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:191px;">Taconic</td>
			<td style="width:221px;">B6-f</td>
			<td>C57BL/6 mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of biomarkers in glioma by immunohistochemistry on paraffin-embedded 3d glioma neurosphere cultures

Tümörü ifadede protein analizi onun patoloji çalışma çeşitli yönlerini ilgilidir. Çok sayıda protein tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşması devlet uygulamaları ile biyolojik olarak tarif edilmiştir. Bu biyolojik analizleri de tümörü hasta ve tümörü modelleri üretilen tümör neurospheres (NS) karakterize etmek kullanışlıdır. Tümör NS hangi onlar türetilmiştir ve daha doğru olabilir ayna gliyom biyoloji tümör farklı özelliklerini değerlendirmek için değerli vitro modeli sağlar. Burada biz biyolojik tümör NS içinde analiz etmek için ayrıntılı bir yöntem tarif parafin gömülü tümörle NS immünhistokimya (IHC) kullanarak.

Değer biçmek Eğer tümör NS üretmek için gereken boyuta ulaştı ve tümör gelişimi izlemek için bioluminescence kullanarak tümör tarafından yayılan ışıma analiz ettik. Bu luciferase (Şekil 1A ve 1B) ışıldama sinyal ile iletim verimliliği pups ve tümör ilerleme çalışma sağlar. 1 x 107 fotonlar/s/cm2/sr (Şekil 1B) bir sinyal tümör boyutu er...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures at JoVE.com

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Tümör nörosferlerinin 3Boyutlu yapısını koruyan bir yöntemle glioma biyomarkervarlığını incelemek için kullanılabilir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu protokolün en büyük avantajı, hücrelerin stresli manipülasyona maruz kaldığı ve düzleştirildiği sitospin yöntemine göre nörosferlerin morfolojisinin korunmasıdır. Bu yöntem, hücrelerin 3Boyutlu olarak kültürlendiği diğer doku kültürü sistemlerine uygulanabilir ve yapının bakımı önemlidir.Başlamak için, bir T-25 şişesinde kültür tümör nörosferler veya NS hücreleri confluent kadar. 15 mililitrelik konik tüpte tümör NS'i seçin. NS'i 300 Gs'ye beş dakika lığına itin.Bundan sonra, peletin mililitresini %10 formalin olarak yeniden askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yeniden askıya alınan NS'ye beş mililitre HBSS ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi hücreleri impellet. Pelet içeren tüpü buz üzerine yerleştirin.Yıkanmış NS peletini %2'lik ılık sıvı agarose'un 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Ve nazik bir pipetleme veya karıştırarak karıştırın. Agarose polimerize olana kadar buz üzerinde agarose gömülü NS yerleştirin.Sonra ns tutarak, agarose parçası çıkarın. Doku işleme için bir kaset içine agarose parçası yerleştirin. 42 santigrat dereceye kadar bir su banyosu ayarlayın. Ve bıçağı dikkatlice mikrotome takın.Sonra parafin bloğunu mikrotome yerleştirin. Bir elinizle makinenin sol tarafında bulunan her bölümün kalınlığını kontrol eden kolu bastırın. Mikrotomu 30 mikrometre kalınlığa ayarlamak için kolu ikinci durağa bastırın.Bloğu kesmeye başlamak için kaba el tekerleğine dönün. Numunenin yüzeyi neredeyse açığa çıktıktan sonra kalınlığı kontrol eden kolu beş veya 10 mikrometreye ayarlayın. Numunenin yüzeyine ulaşıldığında kesmeyi durdurun.Bir buz kutusunu buzla doldurun ve parafin bloğunu doğrudan buza dokunmaktan koruyacak kadar su doldurun. Eski mikrotom bıçağını atın ve kesit için yeni bir tane yerleştirin. Parafin bloğunu gazlı bezle kurulayın ve mikrotome yerleştirin.Parafin kesitbaşlamak için kaba el tekerleği açın. Sonra 42 derece Santigrat su banyosu parafin şerit aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın. Forceps eğrisi kullanarak, iki parafin bölümleri arasında forceps yerleştirin ve yavaşça ayrı bölümleri itin.Ayrılmış bölümleri pozitif yüklü yapışma mikroskop slaytlarına itmek için nemli boya fırçasını kullanın. İlk olarak, 20 dakika boyunca 60 santigrat derece bir metal raf slaytlar kuluçka parafin eritin. Daha sonra metin protokolüne göre oda sıcaklığında bir re-hidrasyon treninde kuluçka yoluyla slaytlar deparaffinize.Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için slaytları musluk suyunda saklayın. Bundan sonra, 125 santigrat derece santigrat 30 saniye ve 10 saniye için 90 derece santigrat slaytlar kuluçka. Damıtılmış su ile beş kez durulama önce slaytlar soğumasını bekleyin.Daha sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.3 hidrojen peroksit slaytlar kuluçka. Daha sonra, hafif ajitasyon ile tampon yıkama üç kez, beş dakika slaytlar yıkayın. Seyreltilmiş primer antikor ile dört santigrat dereceye ayarlanmış nemli bir odada bir gecede slaytlar kuluçka.Bundan sonra, hafif ajitasyon ile beş dakika boyunca slaytlar üç kez yıkayın. Daha sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında seyreltilmiş biyotinylated ikincil antikor slaytlar kuluçka. Hafif ajitasyon ile tampon yıkama beş dakika slaytlar üç kez yıkayın.Daha sonra, bir saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında avidin-biyotinylated horseradish peroksidaz kompleksinde slaytlar kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi yıkamayı tekrarlayın. Bundan sonra, oda sıcaklığında iki ila beş dakika DAB hidrojen peroksit substrat markaları ile slaytlar inkübasyon.Musluk suyu ile slaytlar durulayın ve onları karşı leke için hematoksin çözeltisi slaytlar daldırma. Daha sonra su temizlenene kadar kaydırakları musluk suyunda iyice durulayın. Slaytları metin protokolüne göre susuz kalın.Son olarak, ksilen bazlı montaj ortamı ile slaytlar coverslip ve oda sıcaklığında düz bir yüzeyüzerinde kurumasını bekleyin. Bu protokolde NS sabit ve agarose ve parafin gömülüdür. Ve sonra belirli glioma biyobelirteçleri için lekeli.Kromatin yapısına aracılık eden bir şaperon proteini olan ATRX'in ifade düzeyi düşüktür. Ki67, hücre proliferasyonu bir biyomarker, glioma NS pozitif. Son olarak, NS de OLIG2, oligodendrocyte farklılaşma aracılık bir transkripsiyon faktörü için pozitif. Hatırlanması gereken en önemli şey, nörosferlerin eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için, buza geçmeden önce sıcak agarose'daki hücreleri yeniden askıya almaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Parafin üzerinde elastik boyama-pT3N0M0 gastrik kanser dokusu gömülü slaytlar

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...