Name: wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00
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这项研究得到了国防部的支持 (mab-105-070);ma6-106-077;ma6-107-032;maba-107-065), 科技部 (最低 107-2320-b016-016), 三科总医院, 国防医疗中心, 台湾 (tgh-c106-046;tgh-c106-115;tgh-c107-041), 和成新总医院和国防医疗中心合作 (ch-ndmc-107-8)。

这些脂肪组织是经台湾台北市三服务总医院机构审查委员会认证的骨科手术中获得的, 涉及动物主体的程序已得到国家动物护理委员会的批准国防医疗中心, 台湾 (r. c.)
1. 湿法纺纱工艺
<ol><li>
解决方案准备
	<ol>
<li>将5克明胶粉溶解在100毫升的双蒸馏水中, 得到 5% (w v) 溶液浓度。</li>
		<li>在60-70°c 下一夜慢慢搅拌混合物, 以实现完全均匀的分散, 而不会产生任何气?...

<ol>
	<li>Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+fixation+surgery+for+acute+traumatic+spinal+cord+injury.">Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).</li><li>Fehlings, M. G., Perrin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+and+timing+of+early+decompression+for+cervical+spinal+cord+injury:+update+with+a+review+of+recent+clinical+evidence.">The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence.</a> Injury. 36, 13-26 (2005).</li><li>Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+model+of+post-traumatic+syringomyelia+in+the+rat.">Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat.</a> Spine. 26, 1842-1849 (2001).</li><li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+faces+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+spinal+cord+repair:+a+role+in+microglia/macrophage+activation.">Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation.</a> PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).</li><li>Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulphate+proteoglycans+in+the+central+nervous+system:+changes+and+synthesis+after+injury.">Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).</li><li>Fawcett, J. W., Asher, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+developments+in+natural+fibre+composites+and+their+mechanical+performance.">A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance.</a> Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).</li><li>Lundgren, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+fibers+made+from+proteins.">Synthetic fibers made from proteins.</a> Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).</li><li>Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+mechanism+in+wet+spinning+of+fibres.">Coagulation mechanism in wet spinning of fibres.</a> Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).</li><li>Yannas, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+and+gelatin+in+the+solid+state.">Collagen and gelatin in the solid state.</a> Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).</li><li>Baer, E., Cassidy, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+materials+as+porous+scaffolds+for+tissue+engineering.">Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering.</a> Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).</li><li>Michalczyk, K., Ziman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin+structure+and+predicted+function+in+cellular+cytoskeletal+organization.">Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization.</a> Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).</li></ol>

我们介绍了明胶基生物材料的发展, 使用简单的湿法纺丝技术, 可用于研究天然聚合物的组织再生。这项工作证明了明胶制造作为一个伟大的蛋白质来源, 而无需添加其他来源的可能性, 目的是优化明胶本身的性能。基于明胶的生物材料的开发完全是在室温 (22-26°c) 下进行的。温和的溶液制备是协议中的关键一步, 因为保持精确的溶液浓度和非常平稳地搅拌溶液以避免任何气泡也是如此。溶液中气泡...

组织再生的最新发展涉及组织工程的应用, 这对改进医疗新的治疗策略提出了挑战。例如, 在受伤或疾病之后, 神经系统再生的潜力有限, 在全世界造成了严重的健康问题。由于与神经系统相关的病理生理过程的复杂性, 传统的自体移植或稳定手术的实施已被证明在功能结果方面有好处, 但没有有力的证据表明脊柱固定手术的效果 1,2。受损部位的组织丢失, 取而代之的是肥大诱导的星形胶质细胞3, 最终形成致密的胶质瘢痕 4,5。这个基质作为一个屏障, 阻止恢复神经功能6, 7, 因此, 极大地阻碍了再生。因此, 通过保持受损区域的完整性, 以及通过直接替换神经细胞和电路, 以促进轴突再生。
聚合物生物材料被首选为组织再生治疗的支架, 基于调节细胞或轴突行为和组织进展, 通过自然细胞外基质 (ecm) 的支持。纤维格式通常被认为是各种材料的组成部分, 因为它是一维结构8。纤维一般可以通过熔体挤出或湿法纺丝获得;然而, 设备的大尺寸和成本以及执行这些方法的难度是具有挑战性的。此外, 与聚合物纤维相关的大部分工作都集中在合成材料或复合材料上。天然聚合物作为生物材料的来源, 为人体提供了更好的生物相容性。然而, 要获得天然聚合物纤维的对齐是相对困难的比合成聚合物来源9。因此, 将天然聚合物作为丰富的蛋白质来源转化为生物材料纤维是一项重要的策略--不仅可以直接从原料中分离出生物材料纤维, 从而避免不必要地转化为单体, 而且蛋白质纤维也具有良好的外观和良好的特性10。
在这方面, 我们通过湿法纺丝的基本概念描述了一种制造天然聚合物纤维的廉价加工方法, 该方法可在组织工程的实验室规模上实施。湿法纺丝是通过将聚合物溶液挤压和凝固成合适的聚合物非溶剂来进行的。适当的粘性溶液掺杂到凝固介质中, 会使聚合物分子溶解。通过相变, 细丝失去其溶解度,并以固体聚合物11相的形式沉淀。参照这一概念, 我们通过成型工艺将明胶的发展扩展到管形, 这被认为适合组织再生应用。此外, 本质上, 我们还可以开发任何形状的材料从明胶纤维 (例如, 明胶导管卷起从几个明胶纤维), 为其他所需的应用。
明胶是一种可生物降解的天然聚合物, 由变性和水解胶原蛋白形成, 包括胶原蛋白12的任何半晶、无定形或三重螺旋状态.众所周知, 胶原蛋白是脊椎动物和无脊椎动物13,14的所有结缔组织中必不可少的结构蛋白, 这类似于诱导神经生长的主要 ecm 的蛋白质结构,同时, 取代脊髓损伤过程中分泌的大量糖胺多糖。因此, 使用明胶作为来源将是一个伟大的选择, 任何医疗车辆。除了是一个廉价的来源, 明胶也是生物降解和细胞兼容和临床证明是一个临时缺陷填充 15.在这里描述的体外和体内测试中发展成一种管状,表明明胶具有优异的生物相容性, 适合未来的组织工程应用。明胶管利用人脂肪干细胞培养, 以阳性 nestin 染色为神经细胞标记, 改善细胞分化为神经祖细胞的作用。此外, 明胶作为填充间隙材料, 由本研究中建立的方法, 预计将是可控和安全的, 并大大有利于组织工程师谁目前正在开发相关的天然聚合物, 以增强组织再生策略。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Solution preparation:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B (porcine)</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 10733</td>
			<td>500 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet spinning process:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Model M312</td>
			<td>Minipuls*3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>5A06258541</td>
			<td>26Gx1/2&#34;(0.45 x 12mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00010</td>
			<td>2.5 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone CAPA 6500</td>
			<td>Perstorp</td>
			<td>24980-41-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL03421000</td>
			<td>1 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral venous catheter (Introcan Certo)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1B03258241</td>
			<td>24Gx3/4&#34;(0.7 x 19mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Morphology of the gelatin tube:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter coater machine&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>e1010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>S-3000N</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation of cells on the gelatin tube:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>488625</td>
			<td>100 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>923119</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10744-019</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90025</td>
			<td>VENT type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1209938</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunocytochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>654471</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00697</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 surfactant (Tergitol solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>056K0151</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>20 mL vial, concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23927</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2099</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo biocompatibility test:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine+zolazepam&#160;</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>BC91</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR03227</td>
			<td>10 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Astar</td>
			<td>1406232</td>
			<td>2 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Everstar</td>
			<td>HA161202</td>
			<td>4 L barrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>China Chemical &#38; Pharmaceutical</td>
			<td>18P909</td>
			<td>1 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration

本文提出了一种廉价的方法, 以制备明胶, 作为一种天然聚合物, 成单丝纤维或其他适当的形式。通过湿法纺丝法, 在合适的凝固介质中, 通过光滑挤压生产明胶纤维。为了增加这些明胶纤维的功能表面和它们模仿组织特征的能力, 明胶可以通过参考这个概念被塑造成一个管状。通过体外和体内试验, 明胶管在组织工程中具有巨大的应用潜力。明胶管作为合适的填充间隙材料, 可用于替代受损区域 (如神经或心血管系统) 的组织, 并通过直接替代干细胞和神经电路来促进再生。该协议提供了一个基于天然聚合物的生物材料的详细过程, 其实施有望极大地有利于相关天然聚合物的开发, 这有助于实现组织再生策略。

在这项研究中, 我们成功地将明胶开发成纤维 (图 2a) 和管 (图 2b, c), 通过用户友好的湿纺概念。这些基于明胶的材料可作为任何医疗工具使用, 具体取决于其形状。考虑到这种材料的功能表面和框架更适合组织再生, 我们通过体外和体内试验来检测明胶管的生物相容性。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

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Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

我们开发并描述了一种基于湿法纺纱概念的协议, 用于构建用于组织工程应用的明胶基生物材料。

明胶湿纺成型工艺促进组织再生

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

该协议改进了湿纺的基本概念，将材料从单个纤维条开发成各种条状材料，可用于任何首选医疗应用。该技术简单、价格低廉，无需添加合成聚合物，将天然聚合物定制为感兴趣的材料的蛋白质资源。该技术可推广至生物材料开发，用于杀死感冒治疗，如中枢或外周神经系统治疗、血管置换或直接尿路重建。此方法用于医疗应用，包括作为组织神经化或再生医学的策略。这种技术可以很容易地由初学者实现。请注意，经过几次成型重复后，应始终检查溶液的质量，以保持最佳形成。要形成湿纺管，首先将一个 24 表由三英寸外周静脉导管浸入新鲜准备的明胶溶液中三秒钟，然后浸入新鲜准备的丙酮溶液中浸泡一分钟。重复这些步骤 20 次。最后一次丙酮浸入后，让成型管在室温下干燥五分钟，并使用 hemostat 小心地将明胶管从导管转移到玻璃巴斯德移液器中，并采用 2.5%聚丙酮二氯甲烷溶液，在室温下进行过夜下浸渍孵化。第二天早上，在紫外线下对明胶进行两个小时的消毒，然后短暂地将管子淹没在75%乙醇中。然后用干细胞培养器清洗管两次，去除残留乙醇。要培养与细胞培养的明胶管，用一毫升0.25%的三氯丁二和5%的二氧化碳，将培养方的人类脂肪干细胞的末端替换为0.25%的三氯丁二。当细胞分离后，用一毫升胎儿牛血清停止反应，将细胞悬浮液转移到微离心管中。通过离心收集细胞，将颗粒重新塞在一毫升干细胞培养中等物中。然后将明胶管放在含有三毫升干细胞培养的六井板的一个井中。在计算细胞后，将四倍十至四分之一的人类脂肪干细胞植入管中，在细胞培养箱中孵化两周。在确认适当的水平的解合后，对雌性8周大的Sprague Dawley大鼠的"手趾捏"反应不足，剃掉梯形区域的头发，用波维酮碘溶液对暴露的皮肤进行消毒。用无菌手术窗帘盖住大鼠，以减少手术部位的细菌污染，并使用手术剪刀制作浅两厘米长的皮肤切口。将明胶管直接放入筋膜和肌肉之间的层中，并使用尼龙缝合线关闭伤口。然后用波维酮碘溶液对切口进行消毒。通过肌肉注射酮普罗芬和西法佐林诱导大鼠，并在无菌条件下保持动物七天。这种用户友好的湿纺概念可用于将明胶开发成纤维和管。通过扫描电子显微镜对明胶管进行形态学观察，发现表面不太光滑，内径大于200微米，厚度约为20微米。为神经细胞标记表达而染色人类脂肪干细胞培养明胶管，表明标记物的正染色以及多个检测到的核表明细胞可以穿透并粘附在明胶管上，并分化成神经祖细胞。将明胶管植入筋膜层可证实其安全性和生物相容性，因为在局部组织内未观察到发红、肿胀或其他炎症症状的迹象，且管内被发育良好的结缔组织包围。在尝试两点一的这一步骤时，确保模具在每个溶液的特定涂层时间浸入，对于建立精确的管形非常重要。按照这个程序，我们的实验利用人类疾病的动物模型可以进行，以准确调查生物材料的结果，组织再生策略。该技术开发后，为研究人员将简单的相关性质聚合物开发成任何类型的材料，用于确定的医疗应用铺平了道路。在正常使用条件下，聚丙酮二氯甲烷溶液被认为对环境危害最小，但不要忘记在适当的生物安全柜中对这种化学品执行任何步骤。

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