Name: wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het ministerie van nationale defensie (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), het ministerie van wetenschap en technologie (meeste 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, de nationale defensie medisch centrum, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), en Cheng-Hsin General Hospital en samenwerking van de National Defense Medical Center (CH-NDMC-107-8).

Het vetweefsel zijn verkregen van orthopedische ingrepen zoals gecertificeerd door de institutionele Review Board van Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan R.O.C. Procedures waarbij dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op nationaal Defensie Medical Center, Taiwan (R.O.C).
1. nat draaiende proces
<ol><li>
Bereiding van de oplossing
	<ol>
<li>Los 5 g gelatine poeder in tweemaal gedestilleerd water tot 5% (m/v) oplossing conce...

<ol>
	<li>Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+fixation+surgery+for+acute+traumatic+spinal+cord+injury.">Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).</li><li>Fehlings, M. G., Perrin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+and+timing+of+early+decompression+for+cervical+spinal+cord+injury:+update+with+a+review+of+recent+clinical+evidence.">The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence.</a> Injury. 36, 13-26 (2005).</li><li>Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+model+of+post-traumatic+syringomyelia+in+the+rat.">Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat.</a> Spine. 26, 1842-1849 (2001).</li><li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+faces+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+spinal+cord+repair:+a+role+in+microglia/macrophage+activation.">Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation.</a> PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).</li><li>Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulphate+proteoglycans+in+the+central+nervous+system:+changes+and+synthesis+after+injury.">Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).</li><li>Fawcett, J. W., Asher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+scar+and+central+nervous+system+repair.">The glial scar and central nervous system repair.</a> Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).</li><li>Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chitosan/collagen+substrates+on+the+behavior+of+rat+neural+stem+cells.">Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells.</a> Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).</li><li>Chawla, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fibrous Materials. , (1998).</li><li>Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+developments+in+natural+fibre+composites+and+their+mechanical+performance.">A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance.</a> Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).</li><li>Lundgren, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+fibers+made+from+proteins.">Synthetic fibers made from proteins.</a> Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).</li><li>Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+mechanism+in+wet+spinning+of+fibres.">Coagulation mechanism in wet spinning of fibres.</a> Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).</li><li>Yannas, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+and+gelatin+in+the+solid+state.">Collagen and gelatin in the solid state.</a> Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).</li><li>Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+structure+of+collagen+composite+Systems:+lessons+from+biology.">Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology.</a> Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).</li><li>Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+collagen+and+gelatin.">The structure of collagen and gelatin.</a> Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).</li><li>Veis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , (1994).</li><li>Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+materials+as+porous+scaffolds+for+tissue+engineering.">Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering.</a> Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).</li><li>Michalczyk, K., Ziman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin+structure+and+predicted+function+in+cellular+cytoskeletal+organization.">Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization.</a> Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).</li></ol>

Met behulp van een eenvoudige natte spinnen techniek die kan worden toegepast in de studie van natuurlijke polymeren voor weefselregeneratie presenteerden we de ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen. Dit werk aangetoond de mogelijkheid van gelatine fabricage als een grote eiwitbron zonder de toevoeging van andere bronnen, met als doel het optimaliseren van de eigenschappen van gelatine zelf. De ontwikkeling van gelatine gebaseerde biomaterialen werd volledig uitgevoerd bij kamertemperatuur (22-26 ° C). De v...

De nieuwste ontwikkeling in weefselregeneratie impliceert de toepassing van weefselkweek, dat een uitdaging voor de verbetering van nieuwe therapeutische strategieën in medische behandelingen vormt. Bijvoorbeeld, vormt de beperkte mogelijkheden van zenuwstelsel regeneratie, volgende letsel of ziekte, een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd. Als gevolg van de complexiteit van de pathofysiologische processen gekoppeld aan het zenuwstelsel, het gebruik van traditionele autograft of de uitvoering van de stabilisatie chirurgie is aangetoond dat het bieden van voordelen in functionele uitkomsten, maar er is geen sterk bewijs voor de effecten van spinale fixatie chirurgie1,2. Het weefsel op het beschadigde gedeelte is verloren en vervangen door hypertrophically geïnduceerde astrocyten3, uiteindelijk de vorming van een dichte gliale litteken4,5. Deze matrix fungeert als een beveiligingsbarrière dat blokken het herstel van de zenuw functie van6,7 en is dus sterk belemmert regeneratie. Daarom een geschikte vulling kloof materiaal naar verwachting het verlies van weefsel te voorkomen en verminderen van de vorming van bindweefsel litteken-geassocieerde door behoud van de integriteit van het beschadigde gedeelte, alsmede door het verstrekken van de directe vervanging van neurale cellen en circuits ter bevordering van de regeneratie van de axon.
Polymere biomaterialen geweest aangewezen als steigers voor weefsels regeneratie therapie, gebaseerd op de regulering van de cel of het axon gedrag en weefsel progressie via natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) ondersteuning. De indeling van de vezel wordt algemeen beschouwd als een bouwsteen voor verschillende materialen, als gevolg van de eendimensionale structuur8. De vezels kunnen in het algemeen worden verkregen door extrusie smelt of NAT draaiende methode; echter, de grote omvang en de kosten van de uitrusting en de moeilijkheid om het uitvoeren van deze methoden zijn uitdagend. Bovendien heeft de meerderheid van de werkzaamheden in verband met polymeer vezels gericht geweest op synthetische of samengestelde materialen. Natuurlijke polymeren als een bron van biomaterial bieden betere biocompatibiliteit eigenschappen voor het menselijk lichaam. Is echter relatief moeilijker dan synthetisch polymeer bronnen9om te verkrijgen van de uitlijning van de vezels van het natuurlijke polymeren. Vandaar, de omzetting van een natuurlijke polymeer als een rijke bron van eiwit in biomaterial vezels is een belangrijke strategie — niet alleen kunnen de biomaterial vezels worden rechtstreeks geïsoleerd uit de grondstof, dus het vermijden van een niet onnodig transformatie naar monomeren, maar de eiwit vezels hebben ook een goede uiterlijk en gunstige kenmerken10.
We beschrijven in dit verband een goedkope verwerkingsmethode voor de productie van natuurlijke polymeer vezels via het basisconcept van natte spinnen, die kan worden geïmplementeerd op de laboratoriumschaal van het voor weefselengineering. Natte spinnen wordt uitgevoerd door de extrusie en de stolling van de polymeeroplossing van een in een geschikte polymeer nonsolvent. Een passende, viskeuze oplossing doped in coagulatie medium veroorzaakt de polymeermoleculen te ontbinden. Via de faseovergang, de gloeidraden dan verliezen hun oplosbaarheid en zijn neergeslagen in de vorm van een solide polymeer fase11. Verwijzen naar dit concept, breidden we vervolgens de ontwikkeling van gelatine in de vorm van de buis door een molding proces, dat wordt beschouwd als goed voor weefsels regeneratie toepassing. Bovendien, intrinsiek, kunnen we ook ontwikkelen een vorm van materiaal uit gelatine vezels (bijvoorbeeld gelatine conduit opgerolde van verschillende gelatine vezels), voor andere gewenste toepassingen.
Gelatine, een natuurlijke biologisch afbreekbaar polymeer, wordt gevormd door gedenatureerde en gehydrolyseerd collageen, met inbegrip van een semicrystalline, amorf of triple spiraalvormige staat van collageen12. Het is bekend dat collageen is het essentiële structurele eiwit in alle bindweefsels van gewervelde dieren en ongewervelden13,14, die vergelijkbaar is met de structuur van de eiwitten van de belangrijkste ECM dat zenuw groei induceert en, gelijktijdig vervangt een grote hoeveelheid glycosaminoglycaan uitgescheiden tijdens ruggenmerg letsels. Daarom is het gebruik van gelatine als een bron zou een geweldige keuze voor een medische voertuig. Naast een goedkope bron, gelatine is ook biologisch afbreekbaar en cytocompatible en klinisch bewezen als een tijdelijk defect vuller15. Ontwikkeld in de vorm van een buis, in vitro en in vivo tests beschreven hier het tonen aan dat gelatine heeft een uitstekende biocompatibiliteit en geschiktheid voor toekomstige weefsel technische toepassingen. Gekweekte met menselijke obesitas stamcellen, gelatine buizen verbeteren celdifferentiatie in neurale voorlopercellen door positieve nestin kleuring als merkstof neurale cel. Bovendien gelatine als vulling kloof materiaal, geproduceerd door de methode gevestigd in deze studie naar verwachting beheersbaar en veilig zijn en sterk profiteren weefsel ingenieurs die momenteel oereenstemming natuurlijke polymeren voor de verhoging van weefsel ontwikkelen regeneratie strategieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Solution preparation:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B (porcine)</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 10733</td>
			<td>500 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet spinning process:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Model M312</td>
			<td>Minipuls*3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>5A06258541</td>
			<td>26Gx1/2&#34;(0.45 x 12mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00010</td>
			<td>2.5 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone CAPA 6500</td>
			<td>Perstorp</td>
			<td>24980-41-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL03421000</td>
			<td>1 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral venous catheter (Introcan Certo)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1B03258241</td>
			<td>24Gx3/4&#34;(0.7 x 19mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Morphology of the gelatin tube:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter coater machine&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>e1010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>S-3000N</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation of cells on the gelatin tube:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>488625</td>
			<td>100 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>923119</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10744-019</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90025</td>
			<td>VENT type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1209938</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunocytochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>654471</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00697</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 surfactant (Tergitol solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>056K0151</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>20 mL vial, concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23927</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2099</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo biocompatibility test:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine+zolazepam&#160;</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>BC91</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR03227</td>
			<td>10 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Astar</td>
			<td>1406232</td>
			<td>2 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Everstar</td>
			<td>HA161202</td>
			<td>4 L barrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>China Chemical &#38; Pharmaceutical</td>
			<td>18P909</td>
			<td>1 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration

Dit artikel presenteert een goedkope manier om te fabriceren van gelatine, als een natuurlijke polymeer, in monofilamenten vezels of andere passende vormen. Door middel van de natte methode spinnen, worden gelatine vezels geproduceerd door soepele extrusie in een medium geschikt coagulatie. Het vergroten van het functionele oppervlak van deze gelatine vezels en hun vermogen om na te bootsen de kenmerken van de weefsels, kan de gelatine worden gegoten in de vorm van een buis door te verwijzen naar dit concept. Onderzocht door in vitro en in vivo tests, aantonen de gelatine buizen een groot potentieel voor toepassing in weefselengineering. Fungeert als een geschikte vulling kloof materiaal, gelatine buizen kunnen worden gebruikt ter vervanging van het weefsel in het beschadigde gebied (bijvoorbeeld in het nerveus of cardiovasculaire systeem), alsmede ter bevordering van de regeneratie door middel van een directe vervanging van stamcellen en neurale circuits. Dit protocol biedt een gedetailleerde procedure voor het maken van een biomaterial op basis van een natuurlijke polymeer, en de uitvoering ervan wordt verwacht sterk profiteren van de ontwikkeling van oereenstemming natuurlijke polymeren, die bijdragen tot het realiseren van weefsel regeneratie strategieën.

In deze studie ontwikkeld we met succes de gelatine in vezels(Figuur 2)en buizen (Figuur 2B, C) via het gebruiksvriendelijke natte spinnen concept. Deze gelatine gebaseerde materialen kunnen worden gebruikt als een medisch hulpmiddel, afhankelijk van hun vormen. Gezien het feit dat de functionele oppervlak en het frame van een zodanig materiaal meer geschikt voor weefselregeneratie zijn, onderzoc...

Watch this Scientific Journal Video about Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration at JoVE.com

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Wij beschrijven een protocol gebaseerd op het concept van de natte spinnen, voor de bouw van gelatine gebaseerde biomaterialen gebruikt voor de toepassing van weefselkweek en ontwikkeld.

NAT-spinnen-gebaseerde Molding proces van gelatine voor weefselregeneratie

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Dit protocol verbetert een basisconcept van nat-spinnen om een materiaal van één enkele vezelstrip in diverse stroken te ontwikkelen die voor om het even welke aangewezen medische toepassing kunnen worden gebruikt. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en vereist niet de toevoeging van synthetische polymeren voor aanpassing van de natuurlijke polymeren in een bron van eiwitten voor materialen van belang. Deze techniek kan worden uitgebreid tot biomateriaal ontwikkeling voor het doden van koude therapie, zoals centrale of perifere zenuwstelsel behandeling, bloedvat vervanging, of directe reconstructie van de urinewegen.Deze methode is bedoeld voor medische toepassing, waaronder als een strategie voor weefsel neuralisatie of regeneratieve geneeskunde. Deze techniek kan eenvoudig worden geïmplementeerd door beginners. Merk op dat, na verschillende vormen herhalingen, de kwaliteit van de oplossing moet altijd worden gecontroleerd om een optimale vorming te behouden.Om de natte draaiende buis te vormen, eerst dompel een 24 meter door drie kwart inch perifere veneuze katheter in vers bereide gelatine oplossing voor drie seconden, gevolgd door onderdompeling in vers bereide aceton oplossing voor een minuut. Herhaal deze stappen 20 keer. Na de laatste aceton onderdompeling, laat de gegoten buis droog gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en gebruik een hemostat om zorgvuldig de gelatine buis van de katheter in een glas Pasteur pipet met 2,5%polycaprolactone dichloormethaan oplossing voor een overnachting onder de motorkap incubatie bij kamertemperatuur.De volgende ochtend steriliseert u de gelatine gedurende twee uur onder ultraviolet licht voordat u de buis kort onderdompelt in 75% ethanol. Was vervolgens de buis twee keer met stamcelmedium om de resterende ethanol te verwijderen. Om de gelatinebuis te cultiveren met de celcultuur, vervang het supinaat einde van menselijke vetstamcellen uit een kweekkolf door een milliliter van 0,25%Trypsin-EDTA voor een 3,5 minuten incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, arresteer de reactie met één milliliter foetaal runderserum en breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in een milliliter stamcelmedium. Plaats vervolgens de gelatinebuis in een put van een zes-put plaat met drie milliliter stamcelmedium.Na het tellen van de cellen, zaad vier keer 10 tot de vierde van de menselijke vetcellen stamcellen in de buis voor een twee weken incubatie in de celcultuur incubator. Na het bevestigen van het juiste niveau van sedatie door gebrek aan reactie op teen knijpen in een vrouwelijke acht weken oude Sprague Dawley rat, scheer het haar uit de trapezius gebied en steriliseren de blootgestelde huid met povidone-jodium oplossing. Bedek de rat met steriele chirurgische gordijnen om de bacteriële besmetting van de chirurgische plaats te verminderen en gebruik een chirurgische schaar om een ondiepe, twee centimeter lange huidincisie te maken.Plaats de gelatine buis direct in de laag tussen de fascia en de spier en gebruik een nylon hechting om de wond te sluiten. Steriliseer vervolgens de incisie met povidone-jodiumoplossing. Induceer de rat via een intramusculaire injectie van ketoprofen en cefazolin en onderhoud het dier zeven dagen onder aseptische omstandigheden.Dit gebruiksvriendelijke wet spinning concept kan worden gebruikt om gelatine te ontwikkelen tot vezels en buizen. Morfologische waarnemingen van de gelatinebuis door het scannen van elektronenmicroscopie onthult een niet erg glad oppervlak met een binnendiameter van meer dan 200 micrometer en een dikte van ongeveer 20 micrometer. Kleuring van een menselijke vetcellen stamcel cultuur gelatine buis voor neurale cel marker expressie toont een positieve kleuring voor de marker samen met meerdere gedetecteerde kernen suggereren dat de cellen kunnen doordringen en zich hechten aan de gelatine buis en onderscheiden in neurale voorvader cellen.Implantatie van de gelatinebuis in de fascia-laag bevestigt de veiligheid en biocompatibiliteit, omdat er geen indicatie is van roodheid, zwelling of andere ontstekingssymptomen in het lokale weefsel en de buis wordt omringd door goed ontwikkeld bindweefsel. Terwijl het proberen van deze procedure van twee punt een, ervoor te zorgen onderdompeling van de mal in de specifieke coating tijd in elke oplossing zijn zeer belangrijk voor het opbouwen van een precieze buis vorm. Volgens deze procedure kunnen onze experimenten gebruik maken van dierlijk model van menselijke ziekte om de uitkomst van de biomaterialen voor weefselregeneratiestrategie nauwkeurig te onderzoeken.Na de ontwikkeling ervan, deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de ontwikkeling van eenvoudige correlatieve natuur polymeren in elk type materiaal voor een besloten medische toepassing. Onder normale gebruiksomstandigheden wordt de polycaprolactone dichloormethaanoplossing beschouwd als een minimaal gevaar voor het milieu, maar vergeet niet om stappen met deze chemische stof uit te voeren in een geschikte bioveiligheidskast.

wet-spinning-based-molding-process-of-gelatin-for-tissue-regeneration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Expressie, isolatie en zuivering van oplosbare en onoplosbare Biotinylated Eiwitten voor Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Snelle en Low-cost Prototyping van medische hulpmiddelen met behulp van 3D-Gedrukt Mallen voor Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de Airway Muur

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Kwalitatieve Karakterisering van de waterfractie van hydrothermale liquefactie van algen gebruiken 2D gaschromatografie met Time-of-flight massaspectrometrie

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

Wisselend magneetveld-Responsive Hybrid Gelatine Microgels voor Controlled Drug release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Een gepaarde kraal en magneet Array voor Molding Microwells met variabele concaaf geometrieën

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...