Name: wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00
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Cette étude a été financée par le ministère de la défense nationale (MAB-105-070 ; MAB-106-077 ; MAB-107-032 ; MAB-107-065), le ministère de la Science et la technologie (la plupart 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, le National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C106-046 ; TSGH-C106-115 ; TSGH-C107-041) et Cheng-Hsin General Hospital et la coopération (CH-CMDN-107-8) de la National Defense Medical Center.

Les tissus adipeux ont été obtenues de chirurgies orthopédiques, attestée par l’institutionnel Conseil examen de hôpital général pour le Tri-Service, Taipei, Taiwan, R.O.C. procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux au National Centre médical de la défense, Taiwan (équipe R.O.C).
1. Imprégnez processus de filature
<ol><li>
Préparation de la solution
	<ol>
<li>Dissoudre 5 g de poudre de gélatine dans...

<ol>
	<li>Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+fixation+surgery+for+acute+traumatic+spinal+cord+injury.">Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).</li><li>Fehlings, M. G., Perrin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+and+timing+of+early+decompression+for+cervical+spinal+cord+injury:+update+with+a+review+of+recent+clinical+evidence.">The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence.</a> Injury. 36, 13-26 (2005).</li><li>Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulphate+proteoglycans+in+the+central+nervous+system:+changes+and+synthesis+after+injury.">Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).</li><li>Fawcett, J. W., Asher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+scar+and+central+nervous+system+repair.">The glial scar and central nervous system repair.</a> Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).</li><li>Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chitosan/collagen+substrates+on+the+behavior+of+rat+neural+stem+cells.">Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells.</a> Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).</li><li>Chawla, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fibrous Materials. , (1998).</li><li>Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+developments+in+natural+fibre+composites+and+their+mechanical+performance.">A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance.</a> Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).</li><li>Lundgren, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+fibers+made+from+proteins.">Synthetic fibers made from proteins.</a> Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).</li><li>Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+mechanism+in+wet+spinning+of+fibres.">Coagulation mechanism in wet spinning of fibres.</a> Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).</li><li>Yannas, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+and+gelatin+in+the+solid+state.">Collagen and gelatin in the solid state.</a> Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).</li><li>Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+structure+of+collagen+composite+Systems:+lessons+from+biology.">Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology.</a> Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).</li><li>Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+collagen+and+gelatin.">The structure of collagen and gelatin.</a> Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).</li><li>Veis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , (1994).</li><li>Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+materials+as+porous+scaffolds+for+tissue+engineering.">Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering.</a> Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).</li><li>Michalczyk, K., Ziman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin+structure+and+predicted+function+in+cellular+cytoskeletal+organization.">Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization.</a> Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).</li></ol>

Nous avons présenté le développement des biomatériaux à base de gélatine en utilisant un simple humide filage technique qui peut être appliquée dans l’étude des polymères naturels pour la régénération des tissus. Ce travail a démontré la possibilité de fabrication de la gélatine comme source de protéines grande sans l’ajout d’autres sources, dans le but d’optimiser les propriétés de la gélatine lui-même. Le développement des biomatériaux axée sur la gélatine a été entièrement réalis?...

Le dernier développement dans la régénération des tissus implique l’application de l’ingénierie tissulaire, ce qui représente un défi pour l’amélioration de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les traitements médicaux. Par exemple, le potentiel limité de régénération du système nerveux, suivant les blessures ou les maladies, pose un problème de santé important dans le monde entier. En raison de la complexité des processus physiopathologiques associés au système nerveux, l’utilisation d’autogreffe traditionnelle ou la mise en œuvre de la chirurgie de stabilisation a été démontré d’offrir des avantages dans les résultats fonctionnels, mais il n’y a aucune preuve solide pour les effets de fixation vertébrale chirurgie1,2. Le tissu à la zone endommagée est perdu et remplacé par des astrocytes induit hypertrophically3, formant éventuellement une cicatrice gliale dense4,5. Cette matrice agit comme une barrière que bloque la récupération du nerf fonctionne6,7 et est, ainsi, grandement entrave la régénération. Donc, un matériau d’écart de remplissage approprié devrait empêcher la perte de tissus et de réduire la formation du tissu conjonctif, associée à cicatrice en maintenant l’intégrité de la zone endommagée, ainsi qu’en fournissant le remplacement direct des cellules neuronales et circuits pour promouvoir la régénération axonale.
Biomatériaux polymériques ont été préféré comme échafaudages pour la thérapie de régénération des tissus, basée sur la régulation des cellules ou axone comportement et tissu la progression grâce à l’appui naturel de la matrice extracellulaire (mec). Le format de la fibre est communément considéré comme un bloc de construction pour différents matériaux, en raison de sa structure de dimension8. Les fibres peuvent généralement être obtenus par extrusion de fonte ou humide filature méthode ; Cependant, la grande taille et le coût de l’équipement et de la difficulté à effectuer ces méthodes sont difficiles. En outre, la majorité des travaux lié aux fibres de polymère a été axée sur les matériaux synthétiques ou composites. Polymères naturels comme source de biomatériau offrent de meilleures propriétés de biocompatibilité pour le corps humain. Néanmoins, pour obtenir un alignement des fibres polymères naturels est relativement plus difficile que de polymère synthétique sources9. Par conséquent, la conversion d’un polymère naturel comme une source riche de protéines, en fibres de biomatériau est une stratégie importante — non seulement les fibres du biomatériau peuvent être directement isolées de la matière première, évitant ainsi une transformation inutile aux monomères, mais la fibres de protéine ont également un bon aspect et les caractéristiques favorables10.
À cet égard, les auteurs décrivent une méthode de traitement peu coûteux pour la fabrication des fibres de polymère naturel à travers le concept de base du filage humide, pouvant être mises en œuvre sur l’échelle de laboratoire pour l’ingénierie tissulaire. Filage humide est réalisée par l’extrusion et la coagulation d’une solution de polymère dans une nonsolvent de polymère adapté. Une solution appropriée, visqueuse dopée dans le milieu de coagulation entraîne les molécules de polymère dissoudre. Par le biais de la phase de transition, les filaments puis perdent leur solubilité et sont précipités sous la forme d’un polymère solide étape11. Se référant à ce concept, nous avons élargi puis le développement de la gélatine dans la forme du tube par un procédé de moulage, qui est considérée comme approprié pour application de régénération tissulaire. En outre, intrinsèquement, nous pouvons également développer toutes les formes de matière de fibres de gélatine (par exemple, conduit de gélatine enroulé plusieurs fibres de gélatine), pour d’autres voulu des applications.
Gélatine, un polymère naturel biodégradable, est formée de collagène dénaturé et hydrolysée, y compris n’importe quel état hélicoïdale semi-cristallin, amorphe ou triple de collagène12. Il est bien connu que le collagène est la protéine structurale essentielle dans tous les tissus conjonctifs de vertébrés et invertébrés13,14, qui est similaire à la structure de la protéine de l’ECM principal qui induit la croissance nerveuse et, simultanément, remplace une grande quantité de glycosaminoglycanes sécrétée au cours de la moelle épinière. Par conséquent, l’utilisation de la gélatine en tant que source serait un excellent choix pour n’importe quel véhicule médicalisé. En plus d’être une source peu coûteuse, gélatine est aussi biodégradable et cytocompatible et cliniquement prouvé pour être temporaire défaut remplissage15. Est devenue une forme de tube, des essais in vitro et in vivo décrits ici démontrent que la gélatine a une excellente biocompatibilité et l’aptitude au tissu futur applications d’ingénierie. Cultivés avec des cellules souches humaines adipeuses, tubes de gélatine améliorent la différenciation cellulaire dans les cellules progénitrices neurales à l’aide de nestin coloration positive comme un marqueur de cellules neurales. En outre, gélatine comme garnissage d’écart, sont produits par la méthode établie dans la présente étude, devrait être facile à gérer en toute sécurité et profiter grandement ingénieurs de tissus qui sont en train de développer des polymères naturels corrélatives pour le renforcement du tissu stratégies de régénération.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Solution preparation:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B (porcine)</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 10733</td>
			<td>500 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet spinning process:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Model M312</td>
			<td>Minipuls*3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube connector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>1 box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>5A06258541</td>
			<td>26Gx1/2&#34;(0.45 x 12mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00010</td>
			<td>2.5 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycaprolactone CAPA 6500</td>
			<td>Perstorp</td>
			<td>24980-41-4</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>CL03421000</td>
			<td>1 L vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral venous catheter (Introcan Certo)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1B03258241</td>
			<td>24Gx3/4&#34;(0.7 x 19mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Morphology of the gelatin tube:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion sputter coater machine&#160;</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>e1010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>S-3000N</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation of cells on the gelatin tube:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>488625</td>
			<td>100 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>923119</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10744-019</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90025</td>
			<td>VENT type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>1209938</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunocytochemistry:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate-buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>654471</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Ferak</td>
			<td>Art. -Nr. 00697</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 surfactant (Tergitol solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>056K0151</td>
			<td>500 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>20 mL vial, concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin (primary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-23927</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2099</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo biocompatibility test:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine+zolazepam&#160;</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>BC91</td>
			<td>5 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer korea</td>
			<td>KR03227</td>
			<td>10 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Astar</td>
			<td>1406232</td>
			<td>2 mL vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Everstar</td>
			<td>HA161202</td>
			<td>4 L barrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>China Chemical &#38; Pharmaceutical</td>
			<td>18P909</td>
			<td>1 g vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Shinetec instruments</td>
			<td>ST-B021</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wet-spinning-based molding process of gelatin for tissue regeneration

Cet article présente une méthode peu coûteuse pour fabriquer la gélatine, comme un polymère naturel, en fibres monofilament ou toute autre forme appropriée. Par le biais de l’humide méthode de filature, fibres de gélatine sont produits par extrusion lisse dans un milieu approprié de coagulation. Pour augmenter la surface fonctionnelle de ces fibres de gélatine et de leur capacité à imiter les caractéristiques des tissus, la gélatine peut être moulé en forme de tube en se référant à ce concept. Examinés par des essais in vitro et in vivo, les tubes de gélatine démontrent un grand potentiel d’application en génie tissulaire. Agissant comme un matériau de remplissage approprié gap, gélatine tubes peuvent être utilisés pour remplacer les tissus dans la zone endommagée (par exemple, dans le système nerveux ou cardiovasculaire), ainsi que pour favoriser la régénération en fournissant un remplacement direct des cellules souches et des circuits neuronaux. Ce protocole prévoit une procédure détaillée pour la création d’un biomatériau basé sur un polymère naturel, et sa mise en œuvre devrait grandement favoriser le développement de polymères naturels corrélatives, permettant de réaliser des stratégies de régénération des tissus.

Dans cette étude, nous avons développé avec succès la gélatine en fibres (Figure 2A) et les tubes (Figure 2B, C) à travers le concept convivial filage humide. Ces matériaux à base de gélatine peut être utilisées comme n’importe quel outil médical, selon leurs formes. Considérant que la surface fonctionnelle et la trame de ces matériaux sont plus adaptés pour la régénération de...

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Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Nous avons développé et décrire un protocole basé sur le concept de filage humide, pour la construction des biomatériaux axée sur la gélatine utilisée pour l’application de l’ingénierie tissulaire.

Processus de moulage humide-filage à base de gélatine pour la régénération des tissus

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Ce protocole améliore un concept de base de filature humide pour développer un matériau à partir d’une seule bande de fibre en différentes bandes qui peuvent être utilisés pour toute application médicale préférée. Cette technique est simple, peu coûteuse, et ne nécessite pas l’ajout de polymères synthétiques pour la personnalisation des polymères naturels en une ressource de protéines pour les matériaux d’intérêt. Cette technique peut être étendue au développement de biomatériaux pour tuer la thérapie froide telle que le traitement central ou périphérique de système nerveux, le remplacement de vaisseau sanguin, ou la reconstruction directe d’appareil urinaire.Cette méthode est destinée à l’application médicale, y compris comme une stratégie pour la névralisation tissulaire ou la médecine régénérative. Cette technique peut être facilement mise en œuvre par les débutants. Notez qu’après plusieurs répétitions de moulage, la qualité de la solution doit toujours être vérifiée pour maintenir une formation optimale.Pour former le tube de filature humide, submergez d’abord un cathéter veineux périphérique de trois quarts de pouce de calibre 24 dans une solution de gélatine fraîchement préparée pendant trois secondes, suivi d’une immersion dans une solution d’acétone fraîchement préparée pendant une minute. Répétez ces étapes 20 fois. Après la dernière immersion d’acétone, laisser sécher le tube moulé pendant cinq minutes à température ambiante, et utiliser un hémèque pour transférer soigneusement le tube de gélatine du cathéter dans une pipette pasteur en verre avec 2,5% de solution de dichloromethane polycaprolactone pour une incubation sous le capot pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain matin, stériliser la gélatine pendant deux heures sous la lumière ultraviolette avant de submermer brièvement le tube dans 75% d’éthanol. Lavez ensuite le tube deux fois avec le milieu des cellules souches pour éliminer l’éthanol résiduel. Pour cultiver le tube de gélatine avec la culture cellulaire, remplacez l’extrémité supinate des cellules souches adipeuses humaines d’un flacon de culture par un millilitre de 0,25%Trypsin-EDTA pour une incubation de 3,5 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec un millilitre de sérum bovin fœtal et transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille en un millilitre de milieu de cellules souches. Placez ensuite le tube de gélatine dans un puits d’une plaque de six puits contenant trois millilitres de milieu de cellules souches.Après avoir compté les cellules, semer quatre fois 10 à la quatrième des cellules souches adipeuses humaines dans le tube pour une incubation de deux semaines dans l’incubateur de culture cellulaire. Après avoir confirmé le niveau approprié de sedation par manque de réponse au pincement d’orteil dans un rat femelle de huit semaines de Sprague Dawley, rasez les cheveux de la région trapèze et stérilisez la peau exposée avec la solution povidone-iode. Couvrez le rat de rideaux chirurgicaux stériles pour réduire la contamination bactérienne du site chirurgical et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision superficielle de deux centimètres de long sur la peau.Placez le tube de gélatine directement dans la couche entre le fascia et le muscle et utilisez une suture en nylon pour fermer la plaie. Ensuite, stériliser l’incision avec la solution povidone-iode. Induire le rat par injection intramusculaire de kétoprofène et de cefazolin et maintenir l’animal dans des conditions aseptiques pendant sept jours.Ce concept convivial de filature humide peut être utilisé pour développer la gélatine en fibres et tubes. Les observations morphologiques du tube de gélatine en scannant la microscopie électronique révèlent une surface pas très lisse avec un diamètre intérieur supérieur à 200 micromètres et une épaisseur d’environ 20 micromètres. La coloration d’un tube de gélatine de culture de cellules souches adipeuses humaines pour l’expression de marqueur de cellules neurales démontre une coloration positive pour le marqueur avec les noyaux détectés multiples suggérant que les cellules peuvent pénétrer et adhérer au tube de gélatine et se différencier en cellules progénitrices neurales.L’implantation du tube de gélatine dans la couche de fascia confirme son innocuité et sa biocompatibilité, car aucune indication de rougeur, gonflement, ou d’autres symptômes d’inflammation sont observés dans le tissu local et le tube est entouré par le tissu conjonctif bien développé. Tout en essayant cette procédure de deux points un, assurant l’immersion du moule dans le temps de revêtement spécifique dans chaque solution sont très importants pour construire une forme précise de tube. Suite à cette procédure, nos expériences utilisent le modèle animal de la maladie humaine peut être effectuée pour étudier avec précision les résultats des biomatériaux pour la stratégie de régénération des tissus.Après son développement, cette technique a ouvert la voie pour les chercheurs dans le développement de polymères de nature corrélative simple dans n’importe quel type de matériau pour une application médicale décidée. Dans un état d’utilisation normal, la solution de dichloromethane polycaprolactone est considérée comme présente un risque minimal pour l’environnement, mais n’oubliez pas d’effectuer des étapes avec ce produit chimique dans une armoire de biosécurité appropriée.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Recherche

Bio-ingénierie

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Prototypage rapide et à faible coût des dispositifs médicaux utilisant 3D Imprimé moules pour injection de liquide

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caractérisation qualitative de la fraction aqueuse de hydrothermale Liquéfaction d&#39;algues Utilisation 2D chromatographie en phase gazeuse avec le temps de vol Spectrométrie de masse

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

Magnétique alternatif microgels de gélatine hybride sensible au champ de libération contrôlée de médicaments

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

Une perle apparié et aimant tableau pour le moulage des micropuits avec des géométries variables Concave

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocoles de bioimpression 3D de Gelatin Methacryloyl Hydrogel Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...