Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

يشكر المؤلفون كراوفورد هيلين لإعداد هذه المخطوطة وجيم وولسي لتصميم الرسوم البيانية، ونيلسون فيرونيكا وكريموو ديفيكا للمشاركة في تطوير البروتوكول. تم دعم هذا البروتوكول من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية في المعاهد الوطنية للصحة والأمراض المعدية (R01 AI135953 و AI138329 إلى H.P.K.) والوطني للقلب والرئة والدم معهد (R01 HL136135، HL116217، P01 HL122173، وآسيا تحت 19 عاماً HL129902 إلى H.P.K.)، فضلا عن OD010425 P51 المعاهد الوطنية للصحة، وفي جزء آخر من خلال "مركز السرطان" المعاهد الوطنية للصحة/NCI، CA015704 P30 منحة الدعم. H.P.K. هو "محقق الطب الجزيئي ماركي" وتلقى الدعم كمستلم خوسيه كاريراس/هاء "دونال توماس هبت الرئيس" الافتتاحية لأبحاث السرطان ورئيسة وهبت القفص فريد للخلية والعلاج الجيني.

وتجري زرع الخطتين ذاتي، فتيلة (تعبئة)، والمجموعة من الخلايا، وتعديل الجينات متسقة مع البروتوكولات المنشورة سابقا26. جميع إجراءات تجريبية يتم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان وجامعة واشنطن (البروتوكول #3235-01...

ناقل LV الهندسة هو الأسلوب الأفضل تتسم للجينات-تعديل أنواع الخلايا مثل CD34+ هسبكس، لزرع اللاحقة المجراة في. تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا لزيادة عدد هسبكس المعدلة وراثيا التي ما زالت قائمة طويلة الأجل في فيفو، وتوفير الفوائد السريرية للمرضى بمختلف الأمراض الخبيثة والمعدية والوراثي...

العلاج الجيني في الخلايا الجذعية وسيلة قوية للتصدي لمجموعة واسعة من الأمراض البشرية. العلاج الجيني هسبك هو نهج جاذبية خاصة، بسبب ط) السهولة النسبية لجمع هذه الخلايا من المرضى، والثاني) ثروة المعارف التي تتوفر بخصوص تعمل الخلية السطحية والسابقين فيفو ثقافة المعلمات، كالمجال يتسع، لأن الثالث) ويقدم العلماء مربع أدوات استراتيجيات تعديل الجينات لتلائم مختلف الأمراض ذات الأهمية المتزايدة. أننا نحقق بنشاط هسبك نهج العلاج الجيني من زوايا متعددة، بما في ذلك العلوم الأساسية هسبك علم الأحياء وانجرافتمينت من هسبكس المعدلة وراثيا الإكلينيكية في النماذج الحية، وتطبيق للسكان المريض ذات الصلة. نحن وآخرون اتسمت خلية النمط الظاهري السطحي متميزة وظيفيا هسبك مجموعات فرعية،1،2،3، وتعبئة وتكييف الأنظمة العلاجية التي تعظم العائد هسبك وانجرافتمينت مع التقليل سمية4،5، والجينات استراتيجيات تحرير الجينات التي تلائم مجموعة واسعة الخبيثة، والوراثية، والأمراض المعدية6،،من78، وتعديل 9،10. يمكن تقييم وظيفة وانجرافتمينت من هسبكس المعدلة وراثيا في عدد من نماذج الحيوانات الصغيرة والكبيرة، بما في ذلك الفئران والكلاب ونهبس. على وجه الخصوص، نماذج الخطتين مفيداً نظراً لأن العديد من الكواشف، على سبيل المثال، الأجسام المضادة المحددة هسبك الخلية البروتينات السطحية مثل CD34 و CD90، يمكن استخدامها بشكل تبادلي في الإنسان وخلايا الخطتين. وعلاوة على ذلك، خلافا للفئران، الحيوانات الكبيرة مثل نهبس السماح لتقريب أكثر قربا من نطاق تعديل الجينات اللازمة للفعالية السريرية. وأخيراً، نهبس هي المعيار الذهبي لنماذج الأمراض البشرية مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-111 ونظام نموذج الناشئ للمرشح السرطان، ومكافحة فيروس نقص المناعة البشرية إيمونوثيرابيس12،13.
والغرض من هذا البروتوكول تحديد أساليب لتنقية وتعديل وراثيا، وإعداد منتجات ضخ هسبك الخطتين. على الرغم من خارج نطاق هذا البروتوكول، وقد أظهرنا سابقا أن هذه المنتجات انجرافت في ذاتي الخطتين المضيفين، تؤدي إلى جميع الأنساب المكونة للدم، وتوفير الفعالية العلاجية في طائفة واسعة من النماذج المرض1. كما تتميز كلوناليتي هسبكس انجرافتينج وبناء منصة لتتبع حركية والاتجار بالأشخاص، والنمط الظاهري هسبكس الفردية وذرياتهم، الزرع الذاتي التالية1،14. الأساليب المقدمة هنا قد وضعت مع الأهداف التالية: ط) لعزل هسبكس نقية جداً وطويلة الأجل انجرافتينج HSC مجموعات فرعية، الثاني) للحفاظ على هسكس البدائية خلال السابقين فيفو ثقافة، والثالث) لكفاءة الجينات تعديل الجملة أما هسبكس أو طويلة الأجل انجرافتينج HSC مجموعات فرعية. نحن نوظف المغناطيسي ساعد الخلية فرز (ماك)، فضلا عن تنشيط fluorescence الخلية الفرز (الأصول)، لعزل phenotypically/وظيفيا متميزة هسبك السكان، تمشيا مع أساليب العديد من المجموعات2،15، 16. صيانة هسكس البدائية في الثقافة (التقليل من التفريق بين هذه الخلايا إلى فروعه ملتزمة التي تؤدي بالكامل متمايزة أي مجموعات فرعية اللمفاوية والنقوي) جانبا أساسيا من جوانب البروتوكول هو موضح هنا. على الرغم من أننا تميزت سابقا النهج بتوسيع هسبكس مع الاحتفاظ النمط الظاهري بدائية17،18، هنا، نحن تصف بروتوكول الذي يركز على الحفاظ على هسكس عبر الحد أدنى (ح 48) وتعريف السابقين فيفو ثقافة.
تعديل كفاءة هسبكس و HSC مجموعات فرعية هدف الرئيسي لهذا البروتوكول. بين عدة نهج أبلغنا، هما حتى الآن أكثر من التحقيق في التجارب السريرية: التعديل الجيني بوساطة LV والجينات بوساطة nuclease التحرير1،،من619. استخدام استراتيجيات تحرير الجينات واحدة من عدد من منصات نوكلاس لتعديل جينات مستهدفة للفائدة على وجه التحديد، على سبيل المثال، اكتب مستقبلات تشيموكيني ج ج 5 (CCR5) لعلاج الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية7،19 أو Bcl11A لعلاج من هيموجلوبينوباثيس6. هنا، علينا أن نركز على التعديل الجيني بوساطة LV، الذي دمج الشحنات المعدلة وراثيا سيميراندوملي في الجينوم1،،من820. مزايا رئيسية للنهج LV هو القدرة على توفير كميات كبيرة من المواد الوراثية (ما يصل إلى 8 أو 9 كيلوبس). على الرغم من أن يجري وضع استراتيجيات تحرير الجينات لاستهداف التحوير فائدة لدمج فقط في مكان محدد حسب الجهات المانحة مثلى جزئ (HDR)، هذه الأساليب يتطلب مزيدا من التطوير في المختبر وفي نماذج حيوانية صغيرة. وفي المقابل، ناقلات LV قد استخدمت على نطاق واسع في نهبس والمرضى21،22. الأهم من ذلك، البروتوكول هو موضح هنا، الذي يستخدم أعدادا BM كمصدر هسبك بداية، يمكن بسهولة وعلى نطاق واسع تكييفها، على سبيل المثال، لعزل ببسكس. كما هو موضح أعلاه، يمكننا الاستفادة من درجة عالية من التشابه الوراثي بين نهبس والبشر لاستخدام الكواشف التي تنطبق على كلا من الأنواع. وأخيراً، تم تكييف هذا النهج تعديل المجموعات الفرعية الأخرى المكونة للدم، أي تي الخلايا12،،من2324؛ ظهور نهج العلاج المناعي خلايا تي ناجع وقد تعتمد اعتماداً كبيرا على منصة LV نفسها المستخدمة في هذا البروتوكول. هذه الأساليب مناسبة لأي باحث المهتمة في البيولوجيا هسبك أو التعديل الجيني بوساطة LV. على سبيل المثال، يمكن استخدام البروتوكول تنقية هسبك المعروضة هنا لتميز رواية HSC إثراء مجموعات فرعية، كما هو موضح سابقا1،،من1525. وبالمثل، توصيل LV الأساليب المعروضة هنا يمكن كذلك تطبيقها وتطويرها للعديد من أنواع الخلايا الأخرى والأسئلة التجريبية، سواء في نماذج في المختبر والمجراه.
وباختصار، نقدم طرق لعزل وتعديلها وراثيا "هسبكس الخطتين". هذه الطرق يمكن تكييفها بسهولة للأنواع الأخرى ومصادر أخرى من هسبكس. ويبين هذا البروتوكول فحص دقة وعدا كبيرا في نماذج العلاجات الناجعة للعديد من الأمراض البشرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

زرع الخلايا (هسبك) الجذعية والسلف المكونة للدم كان حجر زاوية في علاج لسرطان الدم وغيرها من أنواع السرطان لما يقرب من نصف قرن، يكمن وراء العلاج الوحيد المعروف للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، وتبشر بخير هائلة في علاج الأمراض الوراثية مثل الثلاسيميا بيتا. مجموعتنا قد وضعت بروتوكولا للعلاج الجيني هسبك النموذجي في المقدمات نونومان (NHPs)، يسمح للعلماء لتحسين العديد من نفس الكواشف والتقنيات التي تطبق في العيادة. هنا، يمكننا وصف طرق لتنقية CD34+ هسبكس وطويلة الأجل استمرار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) مجموعات فرعية من معبي نخاع العظم (بي أم). يمكن أن تستخدم تقنيات مماثلة لتنقية مصادر هسبك أخرى (مثلاً، الدم المحيطي تعبئة الخلايا الجذعية [ببسكس]). المبين هو بروتوكول يوم 2 التي الخلايا هي تنقية ومثقف وتعديل مع لينتيفيروس (LV) وعلى استعداد لضخ العودة إلى المضيف ذاتي. قراءات أساسية للنجاح تشمل نقاء CD34+ هسبك السكان، وقدرة هسبكس المنقي تشكل مستعمرات شكلياً متميزة في وسائل الإعلام سيميسوليد، والأهم من ذلك، كفاءة التعديل الجيني. أن الميزة الأساسية للعلاج الجيني هسبك هو القدرة على توفير مصدر للخلايا المعمرة التي تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا المكونة للدم. على هذا النحو، استخدمت هذه الأساليب للعلاج النموذجي للسرطان والأمراض الوراثية والأمراض المعدية. في كل حالة، أنشأتها الفعالية العلاجية هو تعزيز وظيفة ذرية هسبك متميزة، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء وخلايا T وخلايا ب، مجموعات فرعية النقوي. الأساليب لعزل، تعديل، وإعداد هسبك المنتجات مباشرة المنطبقة وقابل للنقل لأمراض متعددة في المرضى البشرية.

بروتوكول الموصوفة أعلاه يهدف إلى عزل والجينات-تعديل الخطتين CD34+ هسبكس، التي يمكن أن تكون غرست فيما بعد العودة إلى المضيف ذاتي (الشكل 1 و الشكل 2). عند اتباع هذا البروتوكول، نحن عادة الحصول على تصل إلى 8 × 109 مجموع الكريات البيضاء م...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

والهدف من هذا البروتوكول عزل الرئيسيات نونومان CD34+ الخلايا من نخاع العظم معبي، للجينات-تعديل هذه الخلايا مع ناقلات لينتيفيرال، وإعداد منتج لضخ في المضيف ذاتي. طول إجمالي البروتوكول ما يقرب من 48 ساعة.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

لتقييم كفاءة وسلامة نهج العلاج الجيني الواعدة والرواية ، فإن الاختبار الشامل للخلايا المعدلة جينيًا في قبل الفحص المعتمد في نماذج vivo أمر بالغ الأهمية. الحفاظ على علامات سطح الخلية ذات الصلة'عبر التفاعل من الكواشف، والقدرة على تطبيق نفس العلاجات الداعمة تدار للمرضى على طول نماذج الرئيسيات غير البشرية لمحاكاة المعلمات السريرية عن كثب. إظهار الإجراء معي سيكون أنا بيريز، فني أبحاث من مختبر الدكتور هانز بيتر كيم.تبدأ بإضافة 10 إلى 12 ملليلتر aliquots من نخاع العظام معزولة عن متبرع رئيسي غير الإنسان صحية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. جلب حجم أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر مع العازلة النزفية، واحتضان الخلايا لمدة تصل إلى سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي، وتشعّر جميع ما عدا آخر اثنين إلى خمسة ملليلترات من عظمى.Resuspend بيليه في حجم السوبر المتبقية عن طريق نفض الغبار الأنبوب, ونقل تعليق نخاع العظام في أنبوب جديد 50 ملليلتر باستخدام مصفاة خلية المسام 70 ميكرومتر لإزالة أي جلطات الدم. إضافة عازلة انحلالية جديدة لجعل حجم يصل إلى 50 ملليلتر، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة قبل جمعها عن طريق الطرد المركزي. استلهم جميع من افراط و resuspend الخلايا في 10 ملليلتر من الحد الأقصى العازلة.قبل تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة أخرى 70 ميكرومتر المسام، شطف الأنبوب مع 40 ملليلتر من المخزن المؤقت الطازج، وبركة الغسيل مع تعليق الخلية. بعد إثراء للخلايا إيجابية CD34 وفقا للمعايير المغناطيسي بمساعدة الخلايا بروتوكولات الفرز، وغسل الخلايا المعزولة حبة في ما يصل إلى 50 ملليلتر من العازلة ماكس الطازجة، وإعادة تثبيت بيليه في HSPC المتوسطة. ثم لوحة 10 إلى 20 ملليلتر من الخلايا في الأنسجة تنفيس مثقف يعالج قارورة T75 لثقافتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.لتقييم نقاء ما قبل ما بعد التخصيب لعينات خلايا نخاع العظم إنشاء بروتوكول تدفق الخلايا مع المؤامرات المناسبة والتسلسل الهرمي للسكان تظهر جميع البوابات لجميع الأحداث مبعثر، CD34 إيجابية، الخلايا الجذعية الدموية، متعددة القدرات a-erythro النخاعي progenitors وprogenitors النخاعي اللمفاوي. المقبل، تشغيل غير المطّوع، قبل التخصيب، عينة خلايا الدم البيضاء لضبط الفولتية لالمعلمات إلى الأمام والجانب مبعثر، وجميع القنوات المفلورة تليها حبات التعويض الملون واحد لضبط التعويض بين القنوات المجاورة. ثم تشغيل جميع العينات المتبقية غير الملطخة والملطخة مع بروتوكول المعدلة والمعوضة لتوثيق كفاءة التخصيب CD34.عندما تم تعيين جميع التعويضات تكوين فرز الخلية لتنقية الفرز من المجموعات الفرعية CD34 في مستعمرة تشكيل الخلية المقايسات، وتحميل أنبوب عينة CD34 المخصب الملون على مقياس الخلايا. ثم سجل 2000 إلى 3000 الأحداث ، وضبط غرامة بوابات الفرز لتناسب قوة الإشارة والسكان المستهدفين. عند اكتمال الإعداد الحصول على الخلايا ضبط معدل التدفق إلى 500 إلى 1000 خلية في الثانية الواحدة، وفرز 800 إلى 1200 الخلايا من مبعثر، CD34 إيجابية، الخلايا الجذعية الدموية، متعددة القدرات a-erythro السلف النخاعي وبوابات السلف النخاعي اللمفاوي في أنابيب منفصلة تحتوي على 3.6 ملليلتر مستعمرة تشكيل خلية متوسطة لكل أنبوب.في نهاية دوامة النوع أنابيب الجمع ، وإضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى ثلاثة معقمة 3.5 سنتيمتر ، عالجت ثقافة غير الأنسجة أطباق بيتري محددة داخل أطباق بتري فردية 15 سنتيمترًا لكل مجموعة خلايا لاحتضانها لمدة 10-14 يومًا عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي استخدام ماصة 10 ملليلتر لشطف بلطف الخلايا الملتصمة من أسفل كل قارورة مع HBSS العقيمة، وجمع الخلايا المحصودة عن طريق الطرد المركزي. resuspend الخلايا في وسيطة النقل في 1 × 10 إلى الخلايا 6 لكل ملليلتر التركيز.وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا للسيطرة وهمية في بئر واحد من جزء الليفي المؤتلف المغلفة 12 لوحة جيدا لاحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية. ثم إضافة 10 ملليلتر aliquots من الخلايا المتبقية في الليفية المؤتلفة قارورة T75 المغلفة لاحتضان 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية مع أغطية تنفيس. أثناء الاحتضان ذوبان الفيروس مشروطة عينات متوسطة وحساب كمية الفيروس إلى أن تضاف على أساس titer وعدد وحدات معدية من الخلايا لكل ملليلتر.اتخاذ قارورة من الحاضنة وإضافة حجم مناسب من الفيروس مشروطة المتوسطة لكل قارورة قبل العودة إلى الخلايا 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي نقل الخلايا من قارورة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية. اغسل الخلايا بما يصل إلى 50 ملليلتر من HBSS لكل غسل، وكرر هذه الخطوة حتى ثلاث مرات لإزالة الفيروس المتبقي.احتضان الخلايا لمدة ساعتين في وسائل الإعلام HSPC تكمل مع بروستاغلاندين E2. ثم غسل الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من HBSS تستكمل مع مصل 2٪autologous لكل أنبوب. ثم pirate تعليق الخلية باستخدام حقنة 20 ملليلتر مجهزة إبرة قياس 16.5. غسل داخل الأنبوب مع HBSS الطازجة بالإضافة إلى مصل 2٪ الذاتية، وpirpirate في الحقنة.اِحتفَ الحقنة بعناية بغطاء الإبرة قبل وضع محلول الخلية على الجليد حتى ضخها في مضيف ذاتي. لتحديد كفاءة التعديل الجيني للخلايا المستحثة، لوحة 1 × 10 إلى الخلايا الصورية أو المستحثة 6 محفوظة لكل ملليلتر من HSPC المتوسطة على غير الأنسجة ثقافة اللوحات المعالجة. في الأيام الثانية والخامسة والثانية عشر بعد النقل، حصاد وفرز الخلايا.في اليومين الثاني والخامس، اُعيد 33٪ من الخلايا في وسط HSPC الطازج بتركيز 1 × 10 إلى 6 لكل ملليلتر. في أيام اثنين وخمسة واثني عشر، تجميد 33٪ من الخلايا في العازلة استخراج الحمض النووي لPCR في الوقت الحقيقي الكمية، وتحليل 33٪ النهائي من الخلايا عن طريق تدفق الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية لتقييم تكوين فينوتيبيك من ذرية الدم. لقياس التعبير عبر الجنين بواسطة عملية تدفق، إضافة ثلاثة جانب إضافي مبعثر مقابل.transgene المؤامرات؛ وبوابة المؤامرة الأولى على الخلايا الجذعية الدموية، والمؤامرة الثانية على متعدد القدرات وSethro السلف النخاعية، والمؤامرة الثالثة على النسل النخاعي اللمفاوي، كل مقابل transgene. ثم سجل 2000 إلى 3000 الأحداث وغرامة ضبط بوابات الفرز لتناسب قوة الإشارة والسكان المستهدفين.باستخدام هذا البروتوكول عدد غير البشرية الرئيسيات CD34 إيجابية HSPC التي يتم إثراء عادة متناسبة مع إجمالي عدد خلايا الدم البيضاء الإدخال. كما أثبتت النتائج السابقة أن مجموع CD34 إيجابية المنتج HSPC يشمل الخلايا التي ليست صحيحة على المدى الطويل وتطعيم الخلايا الجذعية الدموية، وهذه الخلايا الخلوية تدفق القائمة والمستعمرة تشكيل تقنيات الخلايا يمكن استخدامها لتحديد موثوق وتفريق المجموعات الفرعية المخصبة لالخلايا الجذعية الدموية على المدى الطويل من progenitors ملتزمة. يمكن أن تكون الخلايا الجذعية البشرية الإيجابية CD34 المخصبة الخلايا بكفاءة الجينات تعديل باستخدام ناقلات العدسي الفيروسات.الخلايا التي تحمل نسخة غير متكاملة من المتجه تمييع على مدى فترة اختبار الثقافة السائلة لمدة 12 يومًا ، في حين أن النواقل المتكاملة في الجينوم تنتقل إلى جميع النسل. كما أكد التعبير عن ناقلات في القولون تشكيل الخلية المقايسة. ويمكن استخدام هذه الطريقة قبل السريرية لعزل المعدلة وراثيا في نوعية الخاضعة للرقابة غير الإنسان الرئيسيات الجذعية الدموية والخلايا السلف للعلاج الجيني.ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لأنواع أخرى، ومصادر الجذعية والخلايا السلف، وأدوات العلاج الجيني والأمراض. هذا البروتوكول فحص بدقة يظهر وعدا كبيرا لنمض النمذجة من العلاجات فعالة للعديد من الأمراض البشرية. ضع في اعتبارك أن العمل مع أنسجة الرئيسيات غير البشرية يتطلب تدابير أمنية معززة بما في ذلك معدات الحماية الشخصية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

طريقة سريعة والكمية لتعديل بوستترانسلاشونال والخيار تمكين تعيين الببتيدات للجينوم

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...