Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
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作者感谢海伦·克劳福德为编写这份手稿, 吉姆·伍拉斯为平面设计, 以及维罗妮卡·纳尔逊和德维卡·钱德拉塞卡兰参与了协议的制定。该议定书的制定得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所 (r01 ai135953 和 AI135953 向香港) 和国家心脏、肺和血液研究所 (r01 hl136135、hl1116、p01 hl121773 和 u19) 的资助。hl129902 至 h. p. k., 以及 nih p51 od010425, 部分通过 nihxnci 癌症中心, 支持 grant p30 ca015704。h. p. k. 是马基分子医学研究员, 作为 josécarrasse. donnall thomas 为癌症研究主席和弗雷德·哈奇担任细胞和基因治疗主席的首次接受者, 得到了支持。

自体 nhp 移植、启动 (动员)、细胞收集和基因修饰都是按照先前公布的协议26进行的。所有实验程序都由弗雷德·哈钦森癌症研究中心和华盛顿大学动物护理和使用机构委员会审查和批准 (议定书 #3235-01年)。所有研究都严格按照《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》 (《指南》) 中的建议进行;动物被随机分配到研究中。
1. 丰富 cd34+ hspc 和夜间文化...

lv 载体工程是最有特征的基因修饰细胞类型的方法, 如 cd34 + hspc,用于随后的体内移植。这里描述的协议旨在最大限度地增加长期在体内持续存在的基因修饰 hspc 的数量, 并为各种恶性、传染性和遗传疾病患者提供临床好处。尽管在过去十年中出现了基因编辑策略, 但 lv 修饰细胞是在体外、动物模型和 1、8、20<sup...

干细胞基因治疗是解决各种人类疾病的有力手段。hspc 基因治疗是一种特别有吸引力的方法, 因为 (i) 从患者中收集这些细胞相对容易, ii) 关于细胞表面表型和体外培养参数的丰富知识, 并且, 随着该领域的扩展,因为它为科学家们提供了一个不断增长的针对各种感兴趣的疾病的基因修饰策略工具箱。我们正在从多个角度积极研究 hspc 基因治疗方法, 包括 hspc 生物学基础科学、基因修饰 hspc 在临床前活体模型中的植入以及在相关患者群体中的应用。我们和其他人已经描述了功能不同的 hspc 子集 1,2, 3 的细胞表面表型, 动员和调理方案, 最大限度地提高 hspc 产量和植入, 同时尽量减少毒性4,5, 以及基因修饰和基因编辑策略, 已被定制的广泛的恶性, 遗传和传染病 6,7,8, 9,10。基因修饰 hspc 的功能和雕刻可在许多小型和大型动物模型中进行评估, 包括小鼠、狗和 nhp。特别是, nhp 模型是有利的, 因为许多试剂, 例如 hspc 细胞表面蛋白 (如 cd34 和 cd90) 特有的抗体, 可以在人和 nhp 细胞中互换使用。此外, 与小鼠不同的是, nhp 等大型动物可以更接近临床疗效所需的基因修饰规模。最后, nhp 是人类疾病 (如 hiv-1 感染11 ) 建模的黄金标准, 也是候选抗癌和抗艾滋病毒免疫疗法12,13的新兴模型系统。
本协议的目的是概述纯化、基因改造和制备 nhp hspc 输液产品的方法。虽然在本协议的范围之外, 我们已经表明, 这些产品在自体 nhp 主机中移植, 产生所有的造血谱系, 并提供治疗效果, 在广泛的疾病模型1。我们还描述了移植 hspc 的克隆性, 并建立了一个平台, 以跟踪单个 hspc 及其后代的动力学、贩运和表型, 经过自体移植1,14。本文提出的方法有以下目标: (i) 分离高纯度 hspc 和长期移植 hsc 子集, ii) 在体外培养过程中保持原始 hsc; (三) 有效地基因修饰大容量 hspc 或长期基因修饰嫁接 hsc 子集。我们采用磁辅助细胞分选 (macs), 以及荧光活化细胞分选 (facs), 与许多第2、15组的方法一致, 分离出功能不同的 hspc 人群. 16岁维持培养过程中的原始 hsc (即最大限度地减少这些细胞分化为承诺的祖细胞, 从而产生完全分化的淋巴和髓质亚群) 是这里描述的协议的一个重要方面。尽管我们以前已经描述了扩展 hspc 的方法, 同时保留了一个原始的表型17,18, 在这里, 我们描述了一个协议, 重点是通过最小 (48小时) 和定义的体外培养来维护 hsc。
hspc 和 hsc 子集的有效修改是该协议的中心目标。在我们报告的几种方法中, 有两种是迄今为止临床试验中研究最多的方法: lv 介导的基因修饰和核酸介导的基因编辑1,6,19。基因编辑策略使用多个核酸酶平台中的一个专门修改感兴趣的靶向基因, 例如, c-c 趋化因子受体5型 (ccr5) 用于治疗艾滋病毒感染7、19或 bcl11a血红蛋白病 6。在这里, 我们集中在 lv 介导的基因修饰, 其中转基因货物半整合到基因组1,8,20。lv 方法的一个关键优势是能够提供大量的遗传物质 (高达8或9千比)。虽然基因编辑策略正在制定, 以一个感兴趣的转基因为目标, 只通过同源供体重组 (hdr) 在指定的位点进行整合, 但这些方法需要在体外和小动物模型中进一步发展。相比之下, lv 载体在 nhp 和21、22 患者中得到了广泛的应用。重要的是, 此处描述的协议将引信 bm 用作启动 hspc 源, 可以轻松、广泛地进行调整, 例如, 用于隔离 pbsc。如上所述, 我们利用 nhp 和人类之间高度的遗传相似性, 使用适用于这两个物种的试剂。最后, 该方法已被调整为修改其他造血亚群, 即 t 细胞12,23,24;有效的 t 细胞免疫治疗方法的出现在很大程度上依赖于本协议中使用的相同的 lv 平台。这些方法适用于任何对 hspc 生物学或 lv 介导基因修饰感兴趣的研究人员。例如, 这里介绍的 hspc 纯化协议可用于描述新的 hsc 丰富子集, 如前面所述的1,15,25。同样, 这里介绍的 lv 转导方法也同样可以应用于许多其他细胞类型和实验问题, 包括体外模型和体内模型。
总之, 我们提出了分离和基因改造 nhp hspc 的方法。这些方法可以很容易地适应其他物种和其他来源的 hspc。这个经过彻底审查的协议在对许多人类疾病的有效疗法的建模中显示出很大的希望。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

近半个世纪以来, 造血干细胞和祖细胞移植一直是白血病和其他癌症的基石治疗方法, 是人类免疫缺陷病毒 (hiv-1) 感染的唯一已知治疗方法的基础, 并显示出巨大的希望。遗传性疾病的治疗, 如β地中海贫血。我们的小组已经开发了一个协议, 以模型 hspc 基因治疗的非人类灵长类动物 (nhp), 使科学家优化许多相同的试剂和技术, 应用于临床。在这里, 我们描述了纯化 cd34+ hspc 和长期持续的造血干细胞 (hsc) 亚群的方法从启动骨髓 (bm)。相同的技术可用于纯化其他 hspc 来源 (例如, 动员的外周血干细胞 [pbsc])。概述是一个2天的协议, 其中细胞纯化, 培养, 修改与慢病毒 (lv), 并准备输注回自体宿主。成功的关键读数包括 cd34+ hspc 种群的纯度、纯化后的 hspc 在半固态培养基中形成形态上明显菌落的能力, 以及最重要的基因修饰效率。hspc 基因治疗的主要优势是能够提供长寿命细胞的来源, 从而产生所有造血细胞类型。因此, 这些方法被用来模拟癌症、遗传疾病和传染病的疗法。在每一种情况下, 治疗效果是通过增强不同的 hspc 后代的功能, 包括红细胞, t 细胞, b 细胞, 和/或骨髓亚群。分离、修改和制备 hspc 产品的方法直接适用于人类患者的多种疾病。

上述协议旨在分离和基因修饰 nhp cd34 + hspc,这些方法随后可以重新注入自体主机 (图 1和图 2)。当遵循这一协议时, 我们通常从猪尾猕猴的底漆 bm 中获得高达 8 x 10 9 的 wbc, 有时, 从恒河猴那里获得两倍的金额.在这两个物种中, 我们丰富的 cd34+ hspc 的数量与 wbc 总数的输入成正比 (图 3)...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

非人类灵长类动物造血干细胞和祖细胞的制备及基因修饰

该方案的目标是从启动的骨髓中分离出非人类灵长类动物 cd34+细胞, 用慢病毒载体对这些细胞进行基因修饰, 并准备一种产品, 用于注入自体宿主。协议的总长度约为48小时。

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

为了评估有前景和新颖的基因治疗方法的效率和安全性，在经过验证的临床前细胞体内进行基因修饰细胞的综合测试至关重要。相关细胞表面标记物的保存，试剂的交叉反应，以及应用与非人类灵长类动物模型相同的支持性治疗，以密切模仿临床参数的能力。与我展示这个程序的将是阿奈·佩雷斯，他是汉斯-彼得·基姆博士实验室的研究技术员。首先将从健康的非人类灵长类动物捐赠者中分离出来的10至12毫升等同骨髓加入50毫升锥形管中。用血液缓冲液将管的体积调至50毫升，并在室温下孵育细胞长达7分钟。通过离心去除细胞碎片，吸气除最后两到五毫升的上经剂。通过轻拂管将颗粒重新悬浮在残留上流液量中，并使用 70 微米孔细胞过滤器将骨髓悬浮液转移到新的 50 毫升管中，以去除任何血块。加入新鲜的解血缓冲液，使体积达到50毫升，并在室温下再孵育细胞5分钟，然后通过离心收集。吸气所有上流液，并在10毫升的最大缓冲液中重新暂停细胞。在通过另外一个70微米孔隙滤株过滤细胞悬浮液之前，用40毫升的新鲜缓冲液冲洗管子，然后用细胞悬浮液进行清洗。根据标准磁辅助细胞分选方案对CD34阳性细胞进行浓缩后，将珠子分离细胞洗涤至50毫升的新鲜最大缓冲液，并在HSPC介质中重新悬浮颗粒。然后将10至20毫升的细胞板入通风组织培养处理T75烧瓶，在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中进行隔夜培养。为了评估骨髓细胞样本的富原前和后扩充纯度，创建一个流动细胞学方案，其适当的图谱和种群层次结构显示所有事件散射的所有门、CD34 阳性、造血干细胞、多能性一个红细胞性骨髓祖体和淋巴骨髓祖体祖细胞。接下来，运行一个未染色的、预富集的白细胞样本，以调整前向和侧散射参数的电压，以及所有荧光通道，然后用单染色补偿珠来调节相邻通道之间的补偿。然后使用经过调整和补偿的协议运行所有剩余的未染色和染色样品，以记录 CD34 浓缩效率。当所有补偿都设置后，配置细胞分拣机，用于将CD34子集的排序纯化到聚落形成细胞测定中，并加载染色的CD34富集样品管到细胞仪上。然后记录 2000 到 3000 事件，并微调排序门以适应信号强度和目标群体。当设置完成后，获取将流速调整为500至1000个细胞/秒的细胞，从散射、CD34阳性、造血干细胞、多能性抗红细胞性骨髓祖细胞和淋巴骨髓祖细胞门分拣800至1200个细胞，每个管含有3.6毫升的菌群形成细胞介质。在排序漩涡收集管结束时，并添加一毫升细胞悬浮液到三个无菌3.5厘米，非组织培养处理的培养处理培养皿设置在个别15厘米的培养皿每个细胞群体为10-14天孵育在37摄氏度。第二天早上，使用10毫升移液器用无菌HSS从每个烧瓶底部轻轻冲洗粘附细胞，通过离心收集收获的细胞。每毫升浓度为1 x 10至第6个细胞，在转导介质中重新发送细胞。并在一个井中加入一毫升细胞，用于模拟控制涂覆12井板的重组纤维素片段，在细胞培养箱中隔夜孵化。然后将剩余细胞的10毫升等同物加入重组纤维素片段中，涂上T75烧瓶，在细胞培养箱中孵化30分钟，并加入瓶盖。在孵育过程中解冻病毒条件介质样本，并计算要添加的病毒数量，根据滴度和每毫升细胞的传染性单位数量。将烧瓶从培养箱中取出，在每个烧瓶中加入适当量的病毒调节介质，然后将细胞返回37摄氏度和5%的二氧化碳。第二天早上，将细胞从烧瓶转移到单独的50毫升锥形管中。每次洗涤时，将细胞洗涤至多达 50 毫升的 HBSS，并重复此步骤多达三次以清除残留病毒。在HSPC介质中孵育细胞两小时，辅以前列腺素E2。然后清洗细胞，在10毫升的HSSS中重新补充细胞，每管补充2%的自体血清。然后使用装有 16.5 量针的 20 毫升注射器吸升细胞悬浮液。用新鲜的HSS加上2%的自体血清清洗管内，吸进注射器。小心地用针盖盖住注射器，然后将细胞溶液放在冰上，直到其输注到自体宿主。为了确定转导细胞的基因修饰效率，将每毫升HSPC培养的板1 x 10到第6个保留模拟或转导细胞放到非组织培养处理板上。第二天、第五天和十二天转导后，收获并计算细胞数。在第二天和第五天，以每毫升浓度1 x 10至第6次，在新鲜HSPC介质中重新镀33%的细胞。在第二天、第五天和第十二天，冻结33%的细胞在DNA提取缓冲液中进行定量实时PCR，然后根据标准方案通过流式细胞分析最终33%的细胞，以评估造血后代的表型成分。要通过流式细胞学量化转基因表达式，请添加三个额外的侧散射与转基因图;并门在造血干细胞上的第一个情节，第二个情节的多能性骨髓祖细胞，第三个情节在淋巴骨髓祖细胞上，所有与转基因。然后记录 2000 到 3000 事件，并微调排序门以适应信号强度和目标群体。使用此协议，富集的非人类灵长类动物 CD34 阳性 HSPC 的数量通常与输入的白细胞总数成正比。正如先前的发现已经证明，总CD34阳性HSPC产品包括细胞不是真正的长期和移植造血干细胞，这些流细胞学为基础的和菌落形成细胞技术可用于可靠地识别和区分从承诺的祖先长期造血干细胞丰富的子集。CD34阳性的人类干细胞富集细胞可以有效地利用白细胞载体进行基因修饰。携带非整合载体拷贝的细胞在12天的液体培养测定期内稀释出来，而基因组中稳定整合的载体被传递给所有后代。如菌落形成细胞测定中向量的表达所证实的。这种临床前方法可用于分离基因改造在质量控制的非人类灵长类体造血干细胞和祖细胞的基因治疗。这种方法可以很容易地适应其他物种，造血干细胞和祖细胞的来源，基因治疗工具和疾病。这种经过彻底审查的协议为许多人类疾病的疗效疗法建模显示出了巨大的希望。请记住，使用非人类灵长类动物组织需要加强安全措施，包括个人防护设备。

Research

JoVE Journal

Genetics

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科研

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