Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Forfatterne takke Helen Crawford for at forberede dette manuskript, Jim Woolace til grafisk design, og Veronica Nelson og Devikha Chandrasekaran for at deltage i udviklingen af protokollen. Udviklingen af denne protokol blev støttet af tilskud fra NIH National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (R01 AI135953 og AI138329 til H.P.K.) og National Heart, Lung og Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 og U19 HL129902 til H.P.K.), samt NIH P51 OD010425 og dels gennem NIH/NCI Cancer Center, støtte Grant P30 CA015704. H.P.K. er en Markey Molekylær medicin Investigator og modtaget støtte som konstituerende modtageren af José Carreras/E. Donnall Thomas begavet stol til kræftforskning og Fred Hutch begavet stol for celle og Gene Therapy.

Autolog PHN transplantationer, priming (mobilisering), samlingen af celler og gen-modifikation er udført i overensstemmelse med tidligere publicerede protokoller26. Alle eksperimentelle procedurer gennemgås og godkendes af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Washington (protokol #3235 - 01). Alle undersøgelser er udført i nøje overensstemmelse med anbefalinger i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National ...

LV vektor engineering er de bedst karakteriserede metode til at gen-ændre celletyper såsom CD34+ HSPCs, til efterfølgende transplantation in vivo. Protokollen beskrevet her er designet til at maksimere antallet af gen-modificerede HSPCs, der eksisterer langsigtede i vivo, og kliniske udrede patienter med forskellige maligne, smitsomme og genetiske sygdomme. Selv om redigering af genet strategier er dukket op i det sidste årti, LV-modificerede celler er bedst undersøgt in vitro, i dyremodeller og i patient...

Stem cell genterapi er et effektivt middel til at løse en bred vifte af menneskelige patologier. HSPC genterapi er et særligt attraktivt tilgang, på grund af i) den relative lethed indsamle disse celler fra patienter, ii) rigdommen af viden, der er tilgængelig om celle overflade fænotyper og ex vivo kultur parametre, og udvider sig som feltet, fordi iii) det præsenterer forskere med en stigende værktøjskasse af genet ændring strategier skræddersyet til forskellige sygdomme af interesse. Vi undersøger aktivt HSPC gen terapi metoder fra flere vinkler, herunder de grundlæggende videnskab HSPC biologi, engraftment af gen-modificerede HSPCs i prækliniske undersøgelser in vivo modeller og ansøgning til relevante patientgrupper. Vi og andre har præget den celle overflade Fænotypen af funktionelt adskilte HSPC delmængder1,2,3, mobilisering og conditioning regimer, at Maksimer HSPC udbytte og engraftment samtidig minimere toksicitet4,5, og genet ændring og gen-redigering strategier, der er skræddersyet til en bred vifte af ondartede, genetiske og infektionssygdomme6,7,8, 9,10. Funktion og engraftment af gen-modificerede HSPCs kan evalueres i et antal små - og store-dyr modeller, herunder mus, hunde og primaterne. Især er PHN modeller fordelagtig, fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer specifikke for HSPC celle overflade proteiner som CD34 og CD90, kan blive brugt i flæng i menneskelige og NHP celler. Desuden, i modsætning til mus, store dyr som primaterne tillade et tættere indbyrdes tilnærmelse af omfanget af gen ændring nødvendig for klinisk effekt. Endelig primaterne er guld standard for modellering af menneskers sygdomme såsom HIV-1 infektion11 og er en spirende modelsystem for kandidat anticancer og anti-HIV immunoterapi12,13.
Formålet med denne protokol er at skitsere metoder til rensning, genetisk ændring, og tilbereder NHP HSPC infusion produkter. Selv om uden for anvendelsesområdet for denne protokol, har vi tidligere vist at disse produkter indpode autolog PHN hosts, give anledning til alle hæmatopoietisk lineages og give terapeutisk virkning i en bred vifte af sygdom modeller1. Vi har også præget clonality af engrafting HSPCs og bygget en platform for at spore kinetik, menneskehandel og fænotype af individuelle HSPCs og deres afkom, følgende autolog transplantation1,14. De metoder, der præsenteres her er blevet udviklet med følgende mål: i) at isolere meget rene HSPCs og langsigtede engrafting HSC delmængder, ii) at opretholde primitive HSCs under ex vivo kultur, og iii) til effektivt gen-ændre enten bulk HSPCs eller langsigtede engrafting HSC undersæt. Vi ansætter magnetisk-assisteret celle sortering (MLA), samt fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), for at isolere fænotype/funktionelt adskilte HSPC befolkninger, i overensstemmelse med metoderne, der af mange grupper2,15, 16. Vedligeholdelse af primitive HSCs i kultur (dvs., minimere differentieringen af disse celler i engageret progenitorceller, som giver anledning til fuldt differentierede lymfoide og myeloide delmængder) er en vigtig facet af den protokol, der er beskrevet her. Selv om vi har tidligere karakteriseret tilgange for at udvide HSPCs samtidig bevare en primitiv fænotype17,18, her, beskriver vi en protokol, der fokuserer på at fastholde HSCs via en minimal (48 h) og defineret ex vivo kultur.
Den effektive ændring af HSPCs og HSC delmængder er et centralt mål i denne protokol. Blandt flere metoder vi har rapporteret, to er langt de mest undersøgte i kliniske forsøg: LV-medieret gen ændring og nukleasen-medieret gen redigering1,6,19. Gen-redigering strategier bruger en af en række nukleasen platforme specifikt ændre en målrettet gen af interesse, for eksempel, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) til behandling af HIV infektion7,19 eller Bcl11A til behandling af hemoglobinopathies6. Her fokuserer vi på LV-medieret gen ændring, hvor transgene ladninger integrere semirandomly i genom1,8,20. En vigtig fordel af LV tilgange er evnen til at levere store mængder af genetisk materiale (op til 8 eller 9 kilobases). Selv om redigering af genet strategier udvikles for at målrette en transgen af interesse at integrere kun på en bestemt locus af homologe donor rekombination (HDR), kræver disse metoder yderligere udvikling af in vitro og i små dyremodeller. Derimod har LV vektorer været brugt i udstrakt grad i primaterne og patienter21,22. Vigtigere, kan protokollen beskrevet her, som benytter primet BM som udgangspunkt HSPC kilde, nemt og generelt tilpasses, for eksempel, for at isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, drage vi fordel af den høje grad af genetisk lighed mellem primaterne og mennesker at bruge reagenser, der anvendes til begge arter. Endelig, denne tilgang er blevet tilpasset for at ændre andre hæmatopoietisk delmængder, nemlig T celler12,23,24; fremkomsten af virkningsfuldt T-celle immunterapi tilgange har påberåbt sig stærkt samme LV platformen udnyttes i denne protokol. Disse metoder er hensigtsmæssige for enhver interesseret i enten HSPC biologi eller LV-medieret gen ændring forsker. For eksempel, HSPC rensning protokollen præsenteres her kunne bruges til at karakterisere romanen HSC-beriget delmængder, som tidligere beskrevet1,15,25. Ligeledes, LV transduktion metoder præsenteres her kunne ligeledes anvendes og yderligere udviklet til talrige andre celletyper og eksperimenterende spørgsmål, både i in vitro- og in vivo modeller.
I sammendrag præsenterer vi metoder for at isolere og genetisk ændre PHN HSPCs. Disse metoder kan være let tilpasses til andre arter og andre kilder til HSPCs. Denne grundigt undersøgt protokollen viser meget lovende i modellering af effektive behandlinger for mange menneskelige sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Hæmatopoietisk stilk og stamfader celle (HSPC) transplantation har været en hjørnesten terapi for leukæmi og andre kræftformer i næsten et halvt århundrede, ligger til grund for den eneste kendte kur af human immundefekt virus (HIV-1) infektion og viser enorme løfte i behandling af genetiske sygdomme som beta thalassemia. Vores gruppe har udviklet en protokol til model HSPC genterapi i humane primater (primaterne), gør det muligt videnskabsfolk til at optimere mange af de samme reagenser og teknikker, der anvendes i klinikken. Her, vi beskriver metoder til rensning af CD34+ HSPCs og langsigtede vedvarende hæmatopoietisk stamcelle (HSC) delmængder fra PRIMES knoglemarv (BM). Samme teknikker kan anvendes til rensning af andre HSPC kilder (f.eks. mobiliserede perifert blodstamceller [PBSCs]). Skitseret er en 2-dages protokol, hvor celler er renset, kulturperler, modificeret med lentivirus (LV) og forberedt til infusion tilbage ind i autolog værten. Centrale udlæsninger af succes omfatter renheden af CD34+ HSPC befolknings, renset HSPCs evne til at danne morfologisk adskilte kolonier i halvfaste medier og vigtigst gen ændring effektivitet. Den vigtigste fordel ved HSPC genterapi er evnen til at give en kilde af langlivede celler, der giver anledning til alle hæmatopoietisk celletyper. Som sådan, har disse metoder været anvendt til model behandlingsformer for kræft, genetiske sygdomme og infektionssygdomme. I hvert tilfælde konstateres terapeutiske virkning ved at øge funktionen distinct HSPC afkom, herunder røde blodlegemer, T-celler, B-celler eller myeloide delmængder. Metoder til at isolere, redigere og forberede HSPC produkter er direkte gældende og oversættes til flere sygdomme i menneskelige patienter.

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er designet til at isolere og gen-ændre PHN CD34+ HSPCs, som efterfølgende kan være infunderes tilbage ind i autolog værten (figur 1 og figur 2). Efter denne protokol, vi indhente normalt op til 8 x 109 samlede WBCs fra PRIMES BM fra grisehale makakaber og, undertiden, fordoble dette beløb fra rhesus makakaber. I begge arter, antallet af CD34+ HSPCs, som...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller

Målet med denne protokol er at isolere rettighedsbegrebet primat CD34+ celler fra PRIMES knoglemarv, gen-redigere disse celler med lentiviral vektorer og forberede et produkt til infusion til den autologe vært. Den samlede protokol længde er ca. 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

For at vurdere effektiviteten og sikkerheden af lovende og nye genterapi tilgange, omfattende test af gen-modificerede celler i validerede prækliniske in vivo modeller er afgørende. Bevarelse af relevante celleoverflademarkører's krydsreaktivitet af reagenser og evnen til at anvende de samme understøttende behandlinger, der gives til patienter langs ikke-menneskelige primatmodeller, for nøje at efterligne kliniske parametre. At demonstrere proceduren med mig vil være Anai Perez, en forskningstekniker fra Dr. Hans-Peter Kiem's laboratorium.Begynd med at tilsætte 10 til 12 milliliter aliquots af knoglemarv isoleret fra en sund ikke-menneskelig primat donor i 50 milliliter koniske rør. Rørvolumenet bringes op til 50 milliliter med hæmolytisk buffer, og cellerne inkuberes i op til syv minutter ved stuetemperatur. Fjern cellerester ved centrifugering, og aspirere alle, men de sidste to til fem milliliter af supernatanten.Opslæm pellet i den resterende supernatant volumen ved at svippe røret, og overføre knoglemarvssuspensioner i en ny 50 milliliter rør ved hjælp af en 70 mikrometer pore celle si til at fjerne eventuelle blodpropper. Tilføj frisk hæmolytisk buffer for at bringe volumen op til 50 milliliter, og inkubere cellerne i yderligere fem minutter ved stuetemperatur før deres indsamling ved centrifugering. Inspirer alle supernatanten og resuspend cellerne i 10 milliliter max buffer.Før cellesuspensionen filtreres gennem en anden 70 mikrometer pores si, skylles røret med 40 milliliter frisk buffer, og vasken med cellesuspensionen. Efter berigelse for CD34-positive celler i henhold til standard magnetiske assisterede cellesorteringsprotokoller vaskes perleisolerede celler i op til 50 milliliter frisk max buffer, og pelleten i HSPC-medium opbruges igen. Derefter plade 10 til 20 milliliter af cellerne i udluftet væv dyrket behandlet T75 kolber for deres natten kultur i en 37 grader celsius og 5% kuldioxid inkubator.At vurdere før og efter berigelse renhed af knoglemarvens celleprøver skabe en flow cytometri protokol med de relevante parceller og befolkningshierarkiet viser alle portene til alle begivenheder scatter, CD34 positive, hæmatopoietiske stamceller, multipotente an-erythro myeloid stamfader og lymfemi myeloid stamfader. Dernæst køre en unstained, forberigelse, hvide blodlegemer prøve for at justere spændingerne for fremad og side scatter parametre, og alle fluorescens kanaler efterfulgt af enkelt farvede kompensation perler til at justere kompensationen mellem tilstødende kanaler. Kør derefter alle de resterende uindgroede og farvede prøver med den justerede og kompenserede protokol for at dokumentere CD34-berigelseseffektiviteten.Når alle kompensationer er blevet indstillet konfigurere cellesortering til sortering rensning af CD34 delmængder i koloni danner celle assays, og indlæse den farvede CD34 beriget prøve rør på cytometeret. Derefter optage 2000 til 3000 begivenheder, og fint justere sortere porte til at passe signalstyrken og målpopulationer. Når opsætningen er færdig erhverve cellerne justere strømningshastigheden til 500 til 1000 celler i sekundet, og sortering 800 til 1200 celler fra scatter, CD34 positive, hæmatopoietiske stamceller, multipotent an-erythro myeloid stamfader og lymfealoid stamfader porte i separate rør, der indeholder 3,6 milliliter koloni danner celle medium per rør.I slutningen af den slags vortex samlingen rør, og tilsæt en milliliter celle suspension til tre sterile 3,5 centimeter, ikke-væv kultur behandlet petriskåle sat inden for individuelle 15 centimeter petriskåle pr cellepopulation for deres 10-14 dages inkubation ved 37 grader celsius. Næste morgen skal du bruge en 10 milliliterpipette til forsigtigt at skylle de klæbende celler fra bunden af hver kolbe med sterile HBSS og indsamle de høstede celler ved centrifugering. Cellerne opslænnes i transduktionsmedium ved 1 x 10 til 6.Og tilsæt en milliliter celler til mock kontrol i en brønd af en rekombinant fibronectin fragment belagt 12 godt plade til en overnatning inkubation i cellen kultur inkubator. Derefter tilsættes 10 milliliter aliquots af de resterende celler i rekombinant fibronectin fragmenter belagt T75 kolber til en 30 minutters inkubation i cellen kultur inkubator med hætter udluftet. Under inkubationen tø virus konditioneret medium prøver og beregne mængden af virus, der skal tilføjes baseret på titer og antallet af smitsomme enheder af celler pr milliliter.Kolben ud af inkubatoren og tilsættes det passende mængde virustilstandet medium til hver kolbe, før cellerne bringes tilbage til 37 grader celsius og 5 % kuldioxid. Næste morgen overføres cellerne fra kolben til individuelle 50 milliliter koniske rør. Cellerne vaskes i op til 50 milliliter HBSS pr. vask, og dette trin gentages op til tre gange for at fjerne resterende virus.Inkuber cellerne i to timer i HSPC-medier suppleret med prostaglandin E2. Derefter vaskes cellerne og resuspend cellerne i 10 milliliter HBSS suppleret med 2% autolog serum pr. rør. Derefter aspirere celle suspensioner ved hjælp af en 20 milliliter sprøjte udstyret med en 16,5 gauge nål. Vask indersiden af røret med frisk HBSS plus 2% autolog serum, og aspirere ind i sprøjten.Hætten oversprøjt forsigtigt sprøjten med kanylehætten, før celleopløsningen anbringes på is, indtil den infusion ind i en autolog vært. For at bestemme gen-modifikation effektivitet af transduced celler, plade 1 x 10 til den 6.reserverede mock eller transduced celler pr milliliter HSPC medium på ikke-væv kultur behandlede plader. På dag to, fem og tolv post-transduktion, høste og tælle cellerne.På dag to og fem, replate 33% af cellerne i frisk HSPC medium på en 1 x 10 til 6th per milliliter koncentration. På dag to, fem og tolv fryses 33% af cellerne i DNA-ekstraktionsbufferen for kvantitativ realtids-PCR, og de sidste 33% af cellerne ved flowcytometri i henhold til standardprotokoller for at vurdere den fænotopiske sammensætning af hæmatopoietisk afkom. Hvis du vil kvantificere transgeneudtrykket ved flowcytometri, skal du tilføje tre ekstra side scatter vs.transgene plots;og gate det første plot på hæmatopoietiske stamceller, det andet plot på multipotente an-erythro myeloid stamfader, og den tredje plot på lymfeknuder myeloid stamfader, alle vs transgene. Derefter optage 2000 til 3000 begivenheder og fint justere sortere porte til at passe signalstyrken og målpopulationer.Ved hjælp af denne protokol er antallet af ikke-menneskelige primat CD34 positive HSPC'er, der er beriget, typisk proportional med det samlede antal hvide blodlegemer. Som tidligere resultater har vist, at det samlede CD34 positive HSPC-produkt omfatter celler, der ikke er sande på lang sigt, og podning af hæmatopoietiske stamceller, kan disse flowcytometribaserede og kolonidannende celleteknikker anvendes til pålideligt at identificere og differentiere delmængder beriget til langtids hæmatopoietiske stamceller fra engagerede stamfader. CD34 positive humane stamceller berigede celler kan effektivt gen modificeres ved hjælp af lentiviral vektorer.Celler, der bærer en ikke-integreret kopi af vektoren fortyndes i løbet af de 12 dages flydende kultur assay periode, mens stabilt integrerede vektorer i genomet bliver videregivet til alle afkom. Som bekræftet af ekspressionen af vektoren i koloni danner celleanalyser. Denne prækliniske metode kan bruges til at isolere genetisk modificerede i kvalitetskontrolleret ikke-menneskelige primat hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller til genterapi.Denne metode kan let tilpasses til andre arter, kilder til hæmatopoietiske stængel og progenitor celler, genterapi værktøjer og sygdomme. Denne grundigt undersøgt protokol viser store løfter for modellering af effektive behandlinger for mange sygdomme hos mennesker. Husk, at arbejde med ikke-menneskelige primatvæv kræver forbedrede sikkerhedsforanstaltninger, herunder personlige værnemidler.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion og oprensning af Baculovirus for genterapi ansøgning

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En Fast og kvantitativ metode til posttranslationel modifikation og Variant aktiveret kortlægning af peptider til genomer

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk encellede tilgang til at karakterisere de molekylære og Immunophenotypic heterogenitet af menneskelige stamceller og stamfader populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...