Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

De auteurs bedanken Helen Crawford voor het opstellen van dit manuscript, Jim Woolace voor grafische vormgeving, en Veronica Nelson en Devikha Chandrasekaran voor deelname aan de ontwikkeling van het protocol. De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door subsidies van de NIH National Institute of Allergy en besmettelijke ziekten (R01 AI135953 en AI138329 naar H.P.K.) en het National Heart, Lung en bloed Instituut (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 en U19 HL129902 naar H.P.K.), evenals NIH P51 OD010425 en deels door de NIH/NCI Cancer Center, steun Grant P30 CA015704. H.P.K. is een Markey-moleculaire geneeskunde-Detective en steun gekregen als de inaugurele ontvanger van de José Carreras/E. Donnall Thomas begiftigd stoel voor kankeronderzoek en de Fred Hutch begiftigd stoel voor cel en Gene Therapy.

Autologe Waterprogramma transplantaties, priming (mobilisatie), de verzameling cellen en genetische modificatie worden uitgevoerd conform eerder gepubliceerde protocollen26. Alle experimentele procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en de Universiteit van Washington (Protocol #3235 - 01). Alle studies worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en h...

LV vector engineering is de best gekarakteriseerd methode gen-wijzigen celtypes zoals CD34+ HSPCs, voor latere transplantatie in vivo. Het protocol hier beschreven is ontworpen om te maximaliseren van het aantal genetische gemodificeerde HSPCs, die nog bestaan op lange termijn in vivo, en klinische voordelen bieden aan patiënten met verschillende genetische, kwaadaardige en besmettelijke ziekten. Hoewel bewerken van gene strategieën in het afgelopen decennium opgedoken, LV gemodificeerde cellen zijn de beste...

De therapie van het gen van de cel van de stam is een krachtig middel om aan te pakken van een breed scala van menselijke pathologie. De therapie van het gen van de HSPC is een bijzonder aantrekkelijk benadering, als gevolg van i) het relatieve gemak van het verzamelen van deze cellen van de patiënten, ii) de schat aan kennis die beschikbaar is met betrekking tot cel oppervlakte fenotypes en ex vivo cultuur parameters, en, als het veld groeit, omdat iii) het presenteert wetenschappers met een steeds groter wordende toolbox van gene wijziging strategieën die zijn toegesneden op de verschillende ziekten van belang. We zijn actief onderzoekt HSPC gene therapie benaderingen vanuit meerdere invalshoeken, met inbegrip van de fundamentele wetenschap van HSPC biologie, de engraftment van HSPCs gen gemodificeerde in preklinische in vivo modellen, en de toepassing op relevante patiënt populaties. Wij en anderen hebben gekenmerkt het fenotype cel oppervlakte van functioneel verschillende HSPC deelverzamelingen1,2,3, de mobilisatie en de conditionering regimes die maximaliseren van de opbrengst van de HSPC en engraftment terwijl het minimaliseren van toxiciteit4,5, en het gen wijziging en bewerken van gene strategieën die zijn aangepast aan een breed scala van kwaadaardige, genetische en infectieziekten6,7,8, 9,10. De functie en de engraftment van HSPCs gen-gewijzigd kunnen worden geëvalueerd in een aantal kleine - en grote-dierlijke modellen, waaronder muizen, honden en NHPs. In het bijzonder zijn Waterprogramma modellen voordelig omdat vele reagentia, bijvoorbeeld antilichamen specifiek voor de HSPC cel oppervlakte eiwitten zoals CD34 en CD90, kunnen door elkaar worden gebruikt in mens en Waterprogramma cellen. Bovendien, in tegenstelling tot de muizen, grote dieren zoals NHPs toestaan een nauwere onderlinge aanpassing van de omvang van de genetische modificatie nodig zijn voor de klinische werkzaamheid. Ten slotte NHPs zijn de gouden standaard voor het modelleren van menselijke aandoeningen zoals HIV-1 infectie11 en een opkomende modelsysteem voor kandidaat-antikanker en anti-HIV immuuntherapie12,13.
Het doel van dit protocol is te schetsen van de methoden voor het zuiveren, genetisch te wijzigen, en het voorbereiden van NHP HSPC infusie producten. Hoewel buiten het toepassingsgebied van dit protocol, wij hebben eerder aangetoond dat deze producten in autologe Waterprogramma hosts engraft, aanleiding geven tot alle hematopoietische geslachten, en therapeutische werking in een brede waaier van ziekte modellen1. Wij hebben ook gekenmerkt van de tentiemechanismen van enten HSPCs en bouwde een platform voor het bijhouden van de kinetiek, mensenhandel en fenotype van individuele HSPCs en hun nakomelingen, volgende autologe transplantatie1,14. De hier gepresenteerde methoden zijn ontwikkeld met de volgende doelstellingen: i) te isoleren van zeer zuivere HSPCs en lange termijn enten HSC deelverzamelingen, ii) om te houden van de primitieve HSCs tijdens ex vivo cultuur, en iii) bij het efficiënt gen-wijzig beide bulk HSPCs of lange termijn enten HSC deelverzamelingen. We gebruiken magnetische-bijgewoonde (MACS), cel-Sorteren en fluorescentie-activated cell sorting (FACS), om te isoleren van de fenotypische/functioneel verschillende HSPC populaties, consistent met de methoden van vele groepen2,15, 16. Het onderhoud van primitieve HSCs in cultuur (dat wil zeggen, het minimaliseren van de differentiatie van deze cellen in gepleegd progenitoren die aanleiding tot volledig geven gedifferentieerde lymfoïde en myeloïde subsets) is een essentieel aspect van het protocol beschreven hier. Hoewel we eerder benaderingen om te vouwen HSPCs gekenmerkt hebben met behoud van een primitieve fenotype17,18, hier beschrijven we een protocol dat is gericht op het behoud van de HSCs via een minimale (48 uur) en gedefinieerd ex vivo cultuur.
De efficiënte wijziging van HSPCs en HSC deelverzamelingen is een centrale doelstelling van dit protocol. Verschillende benaderingen hebben we gemeld, twee behoren tot verreweg het meest onderzocht in klinische proeven: LV-gemedieerde genetische modificatie en nuclease-gemedieerde gene bewerken van1,6,19. Bewerken van Gene strategieën gebruikt u een van een aantal nuclease platformen specifiek wijzigen een gerichte gen van belang, bijvoorbeeld, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) voor de behandeling van HIV-infectie7,19 of Bcl11A voor de behandeling Hemoglobinopathieën6. Hier, richten we ons op LV-gemedieerde genetische modificatie, waarin transgene lading semirandomly in het genoom1,8,20 integreren. Een belangrijk voordeel van LV benaderingen is de mogelijkheid om grote hoeveelheden van genetisch materiaal (tot 8 of 9 kilobases) leveren. Hoewel bewerken van gene strategieën worden ontwikkeld te richten op een transgenic van belang om te integreren alleen op een opgegeven locus door donor van homologe recombinatie (HDR), vereisen deze methoden verdere ontwikkeling in vitro en in kleine dierlijke modellen. In tegenstelling, hebben LV vectoren is gebruikt uitgebreid in NHPs en patiënten21,22. Nog belangrijker is, kan het protocol hier beschreven, die gebruik maakt primer BM als startende HSPC bron, gemakkelijk en in grote lijnen aangepast worden, bijvoorbeeld isoleren van PBSCs. Zoals hierboven beschreven, is we profiteren van de hoge mate van genetische gelijkenis tussen NHPs en mens te gebruiken reagentia die voor beide soorten gelden. Ten slotte, deze benadering is aangepast om aan te passen andere hematopoietische deelverzamelingen, namelijk T cellen12,23,24; de komst van doeltreffend T-cel immunotherapie benaderingen heeft leunde zwaar op hetzelfde platform LV die in dit protocol wordt gebruikt. Deze methoden zijn geschikt voor elke onderzoeker kochten HSPC biologie of LV-gemedieerde genetische modificatie. Bijvoorbeeld, de HSPC zuivering protocol hier gepresenteerd kan worden gebruikt te karakteriseren roman HSC-verrijkt deelverzamelingen, zoals eerder beschreven van1,15,25. Ook worden de LV transductie methoden hier gepresenteerd ook kunnen toegepast en verder ontwikkeld voor talloze andere celtypes en experimentele vragen, zowel in in vitro en in vivo modellen.
Kortom presenteren we methoden om te isoleren en Waterprogramma HSPCs genetisch te wijzigen. Deze methoden kunnen gemakkelijk aan te passen voor andere soorten en andere bronnen van HSPCs. Dit grondig doorgelicht protocol toont grote belofte in de modellering van de effectieve therapieën voor talrijke ziekten bij de mens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Hematopoietische stamcellen en voorlopercellen transplantatie van de cel (HSPC) is een therapie van de hoeksteen voor leukemie en andere kankers voor bijna een halve eeuw, ten grondslag ligt aan de enige bekende remedie van infectie van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) en toont enorme belofte in de behandeling van genetische ziekten zoals bèta-thalassemie. Onze fractie heeft ontwikkeld van een protocol bij de therapie van het gen van de HSPC van het model in niet-menselijke primaten (NHPs), zodat wetenschappers voor het optimaliseren van veel van de dezelfde reagentia en technieken die worden toegepast in de kliniek. Hier, we worden methoden beschreven voor het zuiveren van CD34+ HSPCs en lange termijn aanhoudende deelverzamelingen van hematopoietische stamcellen (HSC) uit primer beenmerg (BM). Dezelfde technieken kunnen worden toegepast voor het zuiveren van andere bronnen van de HSPC (bijvoorbeeld gemobiliseerde Perifere bloedstamcellen [PBSCs]). Geschetst is een 2 daagse-protocol waarin cellen zijn gezuiverd, gekweekt, bewerkt met lentivirus (LV) en voorbereid voor infusie terug in de autologe host. Belangrijkste uitlezingen succes omvatten de zuiverheid van de CD34+ HSPC bevolking, de mogelijkheid van gezuiverde HSPCs vormen morfologisch verschillende kolonies in halfvaste media, en, belangrijker nog, gene wijziging efficiëntie. Het belangrijkste voordeel van de therapie van het gen van de HSPC is de mogelijkheid om een bron van langlevende cellen die aanleiding tot alle soorten van hematopoietische cellen geven. Als zodanig hebben deze methoden zijn gebruikt om model therapieën voor genetische ziekten, kanker en infectieziekten. In elk geval, wordt therapeutische werkzaamheid vastgesteld door de verbetering van de functie van verschillende HSPC nageslacht, met inbegrip van rode bloedcellen, T-cellen, B-cellen en/of myeloïde deelverzamelingen. De methoden om te isoleren, wijzigen en HSPC te bereiden producten zijn rechtstreeks toepasselijk en vertaalbare aan meerdere ziektes in menselijke patiënten.

Het protocol dat hierboven beschreven is ontworpen om te isoleren en gen-Wijzig Waterprogramma CD34+ HSPCs, die vervolgens terug in de autologe gastheer (Figuur 1 en Figuur 2) kan worden toegediend. Wanneer dit protocol volgen, we meestal verkrijgen tot 8 x 109 totale WBCs primer BM van FM makaken en soms het dubbele van dat bedrag van rhesus makaken. In beide soorten, het aantal CD34+ HSPCs die w...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Om de efficiëntie en veiligheid van veelbelovende en nieuwe gentherapiebenaderingen te evalueren, is het is van cruciaal belang dat gengemodificeerde cellen worden getest in gevalideerde preklinische in vivo-modellen. Het behoud van de kruisreactiviteit van reagentia van het gebied van het celoppervlak van reagentia en het vermogen om dezelfde ondersteunende behandelingen toe te passen die aan patiënten worden toegediend langs niet-menselijke primatenmodellen om klinische parameters nauw na te bootsen. Het aantonen van de procedure met mij zal Anai Perez, een onderzoekstechnicus van dr. Hans-Peter Kiem's laboratorium.Begin met het toevoegen van 10 tot 12 milliliter aliquots van beenmerg geïsoleerd van een gezonde niet-menselijke primatendonor in 50 milliliter conische buizen. Breng het volume van de buis tot 50 milliliter met hemolytische buffer, en incubeer de cellen gedurende maximaal zeven minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de cel puin door centrifugatie, en aanzuigen alle, maar de laatste twee tot vijf milliliter van de supernatant.Resuspend de pellet in de resterende supernatant volume door flicking de buis, en breng de beenmerg suspensaties in een nieuwe 50 milliliter buis met behulp van een 70 micrometer porie cel zeef om eventuele bloedstolsels te verwijderen. Voeg verse hemolytische buffer toe om het volume tot 50 milliliter te brengen en de cellen nog eens vijf minuten bij kamertemperatuur uit te broeden vóór hun verzameling door middel van centrifugatie. Aspirate alle supernatant en resuspend de cellen in 10 milliliter van max buffer.Voor het filteren van de cel suspensie door nog eens 70 micrometer porie zeef, spoel de buis met 40 milliliter verse buffer, en vul de was met de cel suspensie. Na het verrijken van cd34 positieve cellen volgens standaard magnetische ondersteunde celsordende protocollen, was de geïsoleerde cellen van de kraal in maximaal 50 milliliter verse maximumbuffer en resuspend de pellet in HSPC-medium. Dan plaat 10 tot 20 milliliter van de cellen in geventileerde weefsel gekweekte behandelde T75 flessen voor hun nachtelijke cultuur in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide incubator.Om de pre- en postverrijkingszuiverheid van de celmonsters van het beenmerg te beoordelen, wordt een stroomcytometrieprotocol gemaakt met de juiste plots en populatiehiërarchie met alle poorten voor alle gebeurtenissen verspreid, CD34 positieve, hematopoietische stamcellen, multipotente an-erythro myeloïde voorlopers en lymfoele myeloïde voorlopers. Voer vervolgens een onvervangd, voorverrijkingsmonster uit om de spanningen voor de voorwaartse en zijverstrooiingsparameters aan te passen, en alle fluorescentiekanalen, gevolgd door enkele gekleurde compensatiekralen om de compensatie tussen aangrenzende kanalen aan te passen. Voer vervolgens alle resterende niet-gekleurde en gekleurde monsters uit met het aangepaste en gecompenseerde protocol om de CD34-verrijkingsefficiëntie te documenteren.Wanneer alle compensaties zijn ingesteld configureren van de celsorteerder voor het soort zuivering van de CD34 subsets in kolonie vormen celtesten, en laad de gekleurde CD34 verrijkte monster buis op de cytometer. Dan record 2000 tot 3000 gebeurtenissen, en prima aanpassen van de soort poorten aan de signaalsterkte en doelgroep te passen. Wanneer de setup is voltooid verwerven van de cellen aanpassing van de stroomsnelheid tot 500 tot 1000 cellen per seconde, en het sorteren van 800 tot 1200 cellen uit de scatter, CD34 positieve, hematopoietische stamcel, multipotente an-erythro myeloïde voorloper en lymfe myeloïde voorloper poorten in afzonderlijke buizen met 3,6 milliliter kolonie vormen cel per medium buis.Aan het einde van het soort vortex de collectie buizen, en voeg een milliliter van cel suspensie tot drie steriele 3,5 centimeter, niet-weefsel cultuur behandeld petrischaaltjes ingesteld binnen individuele 15 centimeter petrischaaltjes per cel populatie voor hun 10-14 dagen incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend gebruik maken van een 10 milliliter pipet om voorzichtig spoelen van de aanhangende cellen uit de bodem van elke fles met steriele HBSS, en het verzamelen van de geoogste cellen door middel van centrifugatie. Resuspend de cellen in transductiemedium bij een 1 x 10 tot de 6e cellen per milliliterconcentratie.En voeg een milliliter cellen voor de mock controle in een put van een recombinant fibronectine fragment gecoate 12 put plaat voor een nachtelijke incubatie in de cel cultuur incubator. Voeg vervolgens 10 milliliter aliquots van de resterende cellen toe in recombinant fibronectine fragment gecoate T75-kolven voor een 30 minuten durende incubatie in de celkweek incubator met de doppen geventileerd. Tijdens de incubatie dooi virus geconditioneerd medium monsters en berekenen van de hoeveelheid virus toe te voegen op basis van de titer en het aantal infectieuze eenheden van cellen per milliliter.Neem de kolf uit de couveuse en voeg het juiste volume van het virus geconditioneerd medium aan elke kolf toe voordat u de cellen terugk. De volgende ochtend breng de cellen uit de kolf in individuele 50 milliliter conische buizen. Was de cellen in maximaal 50 milliliter HBSS per wasbeurt en herhaal deze stap tot drie keer om het restvirus te verwijderen.Incubeer de cellen gedurende twee uur in HSPC media aangevuld met prostaglandine E2. Was vervolgens de cellen en resuspend de cellen in 10 milliliter HBSS aangevuld met 2%autoloog serum per buis. Dan aspirate de cel suspensies met behulp van een 20 milliliter spuit uitgerust met een 16,5 meter naald. Was de binnenkant van de buis met verse HBSS plus 2%autoloog serum en zuig in de spuit.Dop de spuit voorzichtig met de naalddop voordat u de celoplossing op ijs plaatst totdat de infusie in een autologe gastheer wordt geplaatst. Om de genmodificatie-efficiëntie van de getransduceerde cellen te bepalen, plaat 1 x 10 tot de 6e gereserveerde nep- of getransduceerde cellen per milliliter van HSPC-medium op niet-weefselkweek behandelde platen. Op dag twee, vijf en twaalf na de transductie, oogst en tel de cellen.Op dag twee en vijf, replate 33% van de cellen in verse HSPC medium op een 1 x 10 tot de 6e per milliliter concentratie. Op dag twee, vijf en twaalf bevriezen 33% van de cellen in DNA-extractiebuffer voor kwantitatieve real-time PCR en analyseer de laatste 33% van de cellen door stroomcytometrie volgens standaardprotocollen om de fenotypische samenstelling van het hematopoietische nageslacht te beoordelen. Als u de transgene expressie wilt kwantificeren door cytometrie van de stroom, voegt u drie extra zijverstring vs.transgene percelen;en poort de eerste plot op de aamvaders stamcellen, de tweede plot op de multipotente an-erythro myeloïde voorlopers, en de derde plot op de lymfe myeloïde voorlopers, alle vs. de transgene. Dan record 2000 tot 3000 gebeurtenissen en prima aanpassen van de soort poorten aan de signaalsterkte en doelgroep te passen.Met behulp van dit protocol is het aantal niet-menselijke primaten CD34 positieve HSPC's die zijn verrijkt meestal evenredig aan het totale aantal witte bloedcellen. Zoals eerdere bevindingen hebben aangetoond dat het totale CD34 positieve HSPC-product cellen omvat die niet waar zijn op lange termijn en hematopoietische stamcellen enten, kunnen deze flow cytometrie gebaseerde en kolonievormende celtechnieken worden gebruikt om op betrouwbare wijze subsets te identificeren en te differentiëren die zijn verrijkt voor lange termijn hematopoietische stamcellen van geëngageerde voorlopers. CD34 positieve menselijke stamcel verrijkte cellen kunnen efficiënt worden gegenereerde met behulp van lentivirale vectoren.Cellen met een niet-geïntegreerde kopie van de vector verdunnen gedurende de 12 dagen vloeibare kweektestperiode, terwijl stabiel geïntegreerde vectoren in het genoom worden doorgegeven aan alle nakomelingen. Zoals bevestigd door de expressie van de vector in kolonie vormen celtesten. Deze preklinische methode kan worden gebruikt om genetisch gemodificeerde in kwaliteit gecontroleerde niet-menselijke primaten hematopoietische stam en voorloper cellen te isoleren voor gentherapie.Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor andere soorten, bronnen van hematopoietische stam- en voorlopercellen, gentherapietools en ziekten. Dit grondig doorgelicht protocol toont grote belofte voor het modelleren van effectieve therapieën voor tal van menselijke ziekten. Houd er rekening mee dat het werken met niet-menselijke primatenweefsels verbeterde beveiligingsmaatregelen vereist, waaronder persoonlijke beschermingsmiddelen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Een snelle en kwantitatieve methode voor de posttranslationele wijziging en Variant ingeschakeld toewijzing van peptiden aan Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...