Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Les auteurs remercient Helen Crawford pour la préparation de ce manuscrit et Jim Woolace pour la conception graphique et Veronica Nelson Devikha Chandrasekaran pour avoir participé à l’élaboration du protocole. L’élaboration du présent protocole a été pris en charge par des subventions de la NIH National Institute of Allergy et maladies infectieuses (R01 AI135953 et AI138329 à H.P.K.) et le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 et U19 HL129902 à H.P.K.), ainsi que les NIH P51 OD010425 et, en partie par le NIH/NCI Cancer Center, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. est un chercheur de médecine moléculaire Markey et reçu le soutien comme premier récipiendaire de la chaire José Carreras/E. Donnall Thomas doué pour la recherche sur le Cancer et la chaire de Fred huche pour cellulaire et Gene Therapy.

Autologue transplantations de PSN, d’amorçage (mobilisation), la collection de cellules et la modification des gènes sont menées conformes aux protocoles publiés précédemment26. Toutes les procédures expérimentales sont examinées et approuvées par le Comité de l’utilisation de la Fred Hutchinson Cancer Research Center et l’Université de Washington et d’institutionnels animalier (protocole #3235 - 01). Toutes les études sont réalisées en stricte conformité avec les recommand...

Vecteur de LV ingénierie est la méthode la mieux caractérisée de gène-modifier les types de cellules comme CD34+ HSPCs, destinés à la transplantation ultérieure in vivo. Le protocole décrit ici est conçu pour maximiser le nombre de HSPCs modifiées qui persistent à long terme in vivo et fournir des avantages cliniques aux patients atteints de diverses maladies malignes, infectieuses et génétiques. Bien que les stratégies de modification génique ont vu le jour ces dix dernières années, les cell...

Thérapie génique cellules souches est un moyen puissant pour traiter un large éventail de pathologies humaines. Thérapie génique HSPC est une approche particulièrement attractive, en raison de i) la facilité relative de recueillir ces cellules provenant de patients, ii) la richesse de la connaissance qui n’est disponible concernant les surface phénotypes cellulaires et ex vivo paramètres de culture et, comme le domaine s’agrandit, car iii) il présente des scientifiques avec une boîte à outils croissant de stratégies de modification génique adaptés à diverses maladies d’intérêt. Nous étudions activement HSPC gene therapy approches sous plusieurs angles, y compris les connaissances scientifiques fondamentales de biologie HSPC, la greffe de HSPCs modifiées dans les modèles précliniques in vivo et l’application à des populations de patients concernées. Nous et autres avons caractérisé le phénotype de surface cellulaire de fonctionnellement distinctes HSPC sous-ensembles1,2,3, la mobilisation et les régimes de conditionnement qui maximisent le rendement HSPC et greffe tout en minimisant la toxicité4,5et le gène modification et édition de gène des stratégies qui ont été adaptés à un large éventail de tumeurs malignes, génétique et maladies infectieuses6,7,8, 9,10. La fonction et la prise de greffe de HSPCs modifiées peuvent être évalués dans un certain nombre de modèles de petits et grands-animaux, dont des souris, des chiens et PSN. En particulier, les modèles de PSN sont avantageux car nombreux réactifs, par exemple, les anticorps spécifiques aux protéines de surface de cellules HSPC comme CD34 et CD90, peuvent être utilisés indifféremment dans les cellules humaines et PSN. En outre, contrairement aux souris, grands animaux tels les PSN permettent une approximation plus étroite de l’ampleur de la modification des gènes nécessaires à l’efficacité clinique. Enfin, PSN est l’étalon-or pour la modélisation de pathologies humaines telles que HIV-1 infection11 et un nouveau système modèle pour candidat anticancéreux et anti-VIH immunothérapies12,13.
Le but du présent protocole est de définir des méthodes pour purifier, modifier génétiquement et préparation de produits de perfusion NHP HSPC. Bien que hors de la portée du présent protocole, nous avons déjà montré que ces produits greffer chez les hôtes de PSN autologues, donnent lieu à toutes les lignées hématopoïétiques et offrent une efficacité thérapeutique dans un large éventail de modèles de la maladie1. Nous avons également caractérisé la clonalité d’après HSPCs et construit une plate-forme pour suivre la cinétique, le trafic et le phénotype des HSPCs individuelles et de leur progéniture, suivant la transplantation autologue1,14. Les méthodes présentées ici ont été mis au point avec les objectifs suivants : i) d’isoler HSPCs extrêmement purs et à long terme après sous-ensembles HSC, ii) de maintenir autorenouveler primitif au cours ex vivo la culture et iii) d’efficacement gène-modifier soit en vrac HSPCs ou à long terme faire une exception des sous-ensembles HSC. Nous employons magnétique assistée par cellule tri (MACS), ainsi que de la cellule activée par fluorescence triant (FACS), afin d’isoler phénotypiquement/fonctionnellement HSPC populations distinctes, compatibles avec les méthodes de nombreux groupes2,15, 16. L’entretien des CSH primitive culture (c'est-à-dire, minimisant la différenciation de ces cellules en progéniteurs engagés qui donnent lieu à pleinement différenciées des sous-ensembles lymphoïdes et myéloïdes) est un aspect essentiel du protocole décrit ici. Bien que précédemment, nous avons caractérisé les approches pour développer HSPCs tout en conservant un phénotype primitif17,18, ici, les auteurs décrivent un protocole qui met l’accent sur le maintien des CSH via un minime (48 h) et défini ex vivo culture.
La modification efficace des HSPCs et HSC sous-ensembles est des principaux objectifs du présent protocole. Parmi plusieurs approches, nous l’avons signalé, deux sont de loin les plus étudiés dans les essais cliniques : modification de gènes LV et gènes nucléase édition1,6,19. Stratégies de modification génétique parmi un certain nombre de plates-formes de nucléase utilisent spécifiquement modifier un gène ciblé d’intérêt, par exemple, le récepteur de chimiokine C-C type 5 (CCR5) pour le traitement de HIV infection7,19 ou Bcl11A pour le traitement des hémoglobinopathies6. Ici, nous nous concentrons sur la modification des gènes LV, dont des cargaisons transgéniques intègrent semirandomly dans le génome de8,1,20. Un avantage majeur des approches LV est la capacité à livrer de grandes quantités de matériel génétique (jusqu'à 8 ou 9 kilobases). Bien que les stratégies de modification de gènes sont élaborés pour cibler un transgène d’intérêt d’intégrer seulement à un locus spécifié par recombinaison homologue donneur (HDR), ces méthodes doivent être développement in vitro et sur des modèles animaux petits. En revanche, vecteurs de LV ont été utilisés intensivement dans les PSN et les patients21,22. Ce qui est important, le protocole décrit ici, qui utilise amorcée BM comme source HSPC départ, peut être facilement et largement adapté, par exemple, pour isoler le CSSP. Comme décrit ci-dessus, nous profitons du degré élevé de similarité génétique entre les PSN et les humains d’utiliser des réactifs qui sont applicables à ces deux espèces. Enfin, cette approche a été adaptée pour modifier d’autres sous-ensembles hématopoïétiques, à savoir T cellules12,23,24; l’avènement d’efficaces approches d’immunothérapie de lymphocytes T s’est appuyé fortement sur la même plateforme de LV utilisée dans le présent protocole. Ces méthodes conviennent à tout chercheur intéressé en biologie HSPC ou modification de gènes LV. Par exemple, le protocole de purification HSPC présenté ici pourrait servir à caractériser les nouveaux sous-ensembles HSC enrichi, comme décrit plus haut1,15,25. De même, la transduction LV méthodes présentées ici pourraient de même être appliquée et développée pour de nombreux autres types de cellules et les questions expérimentales, aussi bien dans des modèles in vitro et in vivo.
En résumé, nous présentons des méthodes pour isoler et modifier génétiquement le PSN HSPCs. Ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour les autres espèces et d’autres sources de HSPCs. Ce protocole soigneusement contrôlé est très prometteur dans la modélisation des thérapies efficaces pour nombreuses maladies humaines.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

La transplantation de cellules (CSPH) souches et progénitrices hématopoïétique a été une thérapie de pierre angulaire pour la leucémie et autres cancers pendant près d’un demi-siècle, est le seul remède connu d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH-1) à la base et prometteuse immense dans le traitement des maladies génétiques comme la bêta-thalassémie. Notre groupe a élaboré un protocole de thérapie génique HSPC modèle de primates non-humains (PNH), permettant aux scientifiques d’optimiser les mêmes réactifs et techniques qui sont appliqués à la clinique. Nous décrivons ici les méthodes pour purifier le CD34+ HSPCs et des sous-ensembles de cellules souches hématopoïétiques (CSH) persistant à long terme d’apprêté la moelle osseuse (BM). Techniques identiques peuvent être utilisés pour la purification des autres sources HSPC (p. ex., mobilisé de sang périphérique des cellules souches [CSSP]). Décrit est un protocole de 2 jours dans lequel cellules sont purifiés, cultivées, modifiés avec lentivirus (LV) et préparés pour perfusion vers l’hôte autologue. Des lectures clés de succès comprennent la pureté de la CD34+ HSPC population, la capacité de HSPCs purifiés pour former des colonies morphologiquement distinctes dans les milieux semi-solides et, surtout, efficacité de modification génétique. Le principal avantage de la thérapie génique HSPC est la capacité à fournir une source de cellules longue durée de vie qui donnent lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques. Comme tel, ces méthodes ont été utilisées aux thérapies de modèle pour le cancer, les maladies génétiques et maladies infectieuses. Dans chaque cas, l’efficacité thérapeutique est établie en améliorant la fonction de la progéniture HSPC distincte, y compris les globules rouges, lymphocytes T, lymphocytes B ou sous-ensembles myéloïdes. Les méthodes pour isoler, modifier et préparer HSPC produits sont directement applicables et traduisible à plusieurs maladies chez des patients humains.

Le protocole décrit ci-dessus est conçu pour isoler et gène-modifier CD34 PSN+ HSPCs, qui peut ensuite être perfusé dans l’hôte autologue (Figure 1 et Figure 2). En suivant ce protocole, nous avons généralement obtenir jusqu'à 8 x 109 totales globules blancs de BM apprêtée de macaques de queue de cochon et, parfois, double de ce montant de macaques rhésus. Chez les deux espèces, le nombre de C...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Pour évaluer l’efficacité et l’innocuité d’approches prometteuses et novatrices en thérapie génique, l’essai complet des cellules génétiquement modifiées dans les modèles in vivo précliniques validés est crucial. La conservation de la réactivité croisée des réaccente des marqueurs de surface cellulaire pertinente et la capacité d’appliquer les mêmes traitements de soutien administrés aux patients selon des modèles de primates non humains pour imiter étroitement les paramètres cliniques. Anai Perez, technicienne de recherche au laboratoire du Dr Hans-Peter Kiem, fera la démonstration de la procédure avec moi.Commencez par ajouter des aliquots de 10 à 12 millilitres de moelle osseuse isolés d’un donneur sain de primates non humains en tubes coniques de 50 millilitres. Porter le volume du tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon hémolytique et incuber les cellules jusqu’à sept minutes à température ambiante. Enlever les débris cellulaires par centrifugation, et aspirer tous sauf les deux à cinq derniers millilitres du supernatant.Resuspendez la pastille dans le volume résiduel du supernatant en faisant glisser le tube et transférez les suspensions de moelle osseuse dans un nouveau tube de 50 millilitres à l’aide d’une passoire à cellules poreuses de 70 micromètres pour enlever les caillots sanguins. Ajouter un tampon hémolytique frais pour porter le volume jusqu’à 50 millilitres et incuber les cellules pendant encore cinq minutes à température ambiante avant leur collecte par centrifugation. Aspirer tous les supernatants et résusquer les cellules en 10 millilitres de tampon max.Avant de filtrer la suspension cellulaire à travers une autre passoire pore de 70 micromètres, rincer le tube avec 40 millilitres de tampon frais, et mettre le lavage en commun avec la suspension cellulaire. Après l’enrichissement des cellules positives CD34 selon les protocoles standard de tri des cellules magnétiques assistées, lavez les cellules isolées de perles dans jusqu’à 50 millilitres de tampon maximum frais et réutilisez la pastille dans le milieu HSPC. Puis plaque 10 à 20 millilitres des cellules dans les tissus ventilés cultivés traités flacons T75 pour leur culture du jour au lendemain dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour évaluer la pureté avant et après l’enrichissement des échantillons cellulaires de la moelle osseuse créer un protocole de cytométrie de flux avec les parcelles appropriées et la hiérarchie de la population montrant toutes les portes pour tous les événements se disperser, CD34 positif, cellules souches hématopoïétiques, multipotents an-érythro progéniteurs myéloïdes et progéniteurs lympho myéloïdes. Ensuite, exécutez un échantillon de globules blancs non tachés, pré-enrichissement, pour ajuster les tensions pour les paramètres de dispersion avant et latérale, et tous les canaux de fluorescence suivis de perles de compensation tachées unique pour ajuster la compensation entre les canaux adjacents. Ensuite, exécutez tous les échantillons non tachés et tachés restants avec le protocole ajusté et compensé pour documenter l’efficacité d’enrichissement du CD34.Lorsque toutes les compensations ont été réglées configurer le trieur cellulaire pour la purification tri des sous-ensembles CD34 en colonies formant des analyses cellulaires, et charger le tube d’échantillon enrichi CD34 taché sur le cytomètre. Puis enregistrer 2000 à 3000 événements, et amende ajuster les portes de tri pour s’adapter à la force du signal et les populations cibles. Lorsque la configuration est terminée acquérir les cellules ajustant le débit à 500 à 1000 cellules par seconde, et le tri de 800 à 1200 cellules de la dispersion, CD34 positif, cellule souche hématopoïétique, multipotente an-érythro progéniteur myéloïde et lympho myéloïde portes progénitrices dans des tubes distincts contenant 3,6 millilitres de colonie formant milieu cellulaire par tube.À la fin de la sorte vortex les tubes de collecte, et ajouter un millilitre de suspension cellulaire à trois stériles 3,5 centimètres, la culture non tissulaire traité boîtes de Pétri mis dans les boîtes de Pétri individuels de 15 centimètres par population cellulaire pour leur incubation de 10-14 jours à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, utilisez une pipette de 10 millilitres pour rincer doucement les cellules adhérentes du fond de chaque flacon avec du HBSS stérile, et recueillir les cellules récoltées par centrifugation. Resuspendez les cellules dans le milieu de transduction à une concentration de 1 x 10 à la 6ème cellules par millilitre de concentration.Et ajouter un millilitre de cellules pour le contrôle simulé dans un puits d’un fragment recombinant de fibronectine enduit de 12 plaques de puits pour une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire. Ajouter ensuite 10 millilitres aliquots des cellules restantes dans des flacons T75 recouverts de fragments de fibronectine recombinants pour une incubation de 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire avec les bouchons ventilés. Pendant le dégel d’incubation, le virus a conditionné des échantillons moyens et calculé la quantité de virus à ajouter en fonction du titer et du nombre d’unités infectieuses de cellules par millilitre.Sortez le flacon de l’incubateur et ajoutez le volume approprié de milieu conditionné par le virus à chaque flacon avant de retourner les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, transférez les cellules du flacon en tubes coniques individuels de 50 millilitres. Lavez les cellules jusqu’à 50 millilitres de HBSS par lavage, et répétez cette étape jusqu’à trois fois pour éliminer le virus résiduel.Incuber les cellules pendant deux heures dans les médias HSPC complétés par la prostaglandine E2. Ensuite, lavez les cellules et résuspendez les cellules en 10 millilitres de HBSS complétés par 2% de sérum autologue par tube. Aspirez ensuite les suspensions cellulaires à l’aide d’une seringue de 20 millilitres munie d’une aiguille de calibre 16,5. Laver l’intérieur du tube avec du HBSS frais plus 2% sérum autologue, et aspirer dans la seringue.Capuchonez soigneusement la seringue avec le bouchon d’aiguille avant de placer la solution cellulaire sur la glace jusqu’à son infusion dans un hôte autologue. Pour déterminer l’efficacité de modification génétique des cellules transduced, plaque 1 x 10 à la 6ème cellule réservée de maquette ou de transduced par millilitre de milieu de HSPC sur des plaques traitées de culture non tissulaire. Les jours deux, cinq et douze après la transduction, récoltez et comptez les cellules.Les jours deux et cinq, replatez 33% des cellules dans le milieu frais de HSPC à une concentration fraîche de 1 x 10 à 6ème par millilitre. Les jours deux, cinq et douze, congelez 33% des cellules dans le tampon d’extraction d’ADN pour le PCR quantitatif en temps réel, et analysez les 33% finaux des cellules par cytométrie de flux selon les protocoles standard pour évaluer la composition phénotypique de la descendance hématopoïétique. Pour quantifier l’expression transgénique par cytométrie d’écoulement, ajoutez trois scatters latérables supplémentaires par rapport à.parcelles transgéniques;et porte la première parcelle sur les cellules souches hématopoïétiques, la deuxième parcelle sur les progéniteurs myéloïdes multipotents an-érythro, et la troisième parcelle sur les progéniteurs myéloïdes lymphoïdes, tous contre le transgène. Enregistrez ensuite de 2000 à 3000 événements et ajustez finement les portes de tri pour s’adapter à la force du signal et aux populations cibles.En utilisant ce protocole, le nombre de PRIMATES NON humains CD34 positifs HSPC qui sont enrichis est généralement proportionnelle à l’entrée totale des globules blancs. Comme les résultats précédents ont démontré que le produit HSPC positif de CD34 total inclut des cellules qui ne sont pas vraies à long terme et greffent des cellules souches hématopoïétiques, ces techniques de cellules basées sur la cytométrie de flux et de formation de colonie peuvent être employées pour identifier et différencier de manière fiable des sous-ensembles enrichis pour les cellules souches hématopoïétiques à long terme des progéniteurs engagés. Les cellules souches humaines positives CD34 peuvent être modifiées efficacement à l’aide de vecteurs lentiviraux.Les cellules portant une copie non intégrée du vecteur se diluent au cours de la période d’analyse de la culture liquide de 12 jours, tandis que les vecteurs fortement intégrés dans le génome sont transmis à l’ensemble de la descendance. Comme le confirme l’expression du vecteur dans la colonie formant des analyses cellulaires. Cette méthode préclinique peut être utilisée pour isoler génétiquement modifié dans la qualité contrôlée primate non humain hématopoïétique cellules souches et progénitrices pour la thérapie génique.Cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres espèces, sources de cellules hématopoïétiques souches et progénitrices, outils de thérapie génique et maladies. Ce protocole soigneusement examiné montre une grande promesse pour la modélisation des thérapies efficaces pour de nombreuses maladies humaines. Gardez à l’esprit que le travail avec les tissus primates non humains nécessite des mesures de sécurité renforcées, y compris l’équipement de protection individuelle.

Research

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Genetics

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Génétique

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The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Une méthode rapide et Quantitative pour Modification post-traductionnelle et variante compatible cartographie des Peptides aux génomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...