Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Die Autoren danken Helen Crawford für die Vorbereitung dieses Manuskript, Jim Woolace für Grafik-Design, und Veronica Nelson und Devikha Chandrasekaran für die Teilnahme an der Entwicklung des Protokolls. Die Entwicklung dieses Protokolls wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (R01 AI135953 und AI138329, H.P.K.) und der National Heart, Lung and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 und U19 HL129902, H.P.K.), sowie NIH P51 OD010425 und teilweise durch das NIH/NCI Cancer Center, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. ist ein Markey molekulare Medizin Ermittler und unterstützt als erste Empfänger der José Carreras/E. Donnall Thomas Stiftungslehrstuhl für Krebsforschung und Fred Hutch-Stiftungsprofessur für Zellen und Gene Therapy.

Autologe NHP-Transplantationen, Grundieren (Mobilisierung), die Sammlung von Zellen und gentechnische Veränderung sind konsistent mit den zuvor veröffentlichten Protokolle26durchgeführt. Alle experimentelle Verfahren überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Fred Hutchinson Cancer Research Center und der University of Washington genehmigt (Protokoll #3235 - 01). Alle Studien erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pfl...

LV-Vektor Engineering ist die am besten charakterisierten Methode zum gen ändern-Zelltypen wie CD34+ HSPCs, für die anschließende Transplantation in-vivo. Das hier beschriebene Protokoll soll maximiert die Anzahl der gen-modifizierte HSPCs, die langfristig in Vivo beibehalten und bieten klinischen Vorteile für Patienten mit verschiedenen malignen, infektiöse und genetischen Krankheiten. Obwohl gen Bearbeitung Strategien im letzten Jahrzehnt entstanden, LV-modifizierten Zellen sind die besten studierte in ...

Gen der Stammzelltherapie ist ein mächtiges Mittel, um ein breites Spektrum der Erkrankungen des Menschen. HSPC Gentherapie ist ein besonders attraktiver Ansatz, durch (i) die relative Leichtigkeit des Sammelns dieser Zellen von Patienten, (Ii) die Fülle des Wissens, die verfügbar ist, in Bezug auf Zelle Oberfläche Phänotypen und ex-Vivo-Kultur-Parameter, und, wie das Feld erweitert, denn Iii) Es stellt Wissenschaftler mit einer immer größer werdenden Toolbox Gen Modifikation Strategien abgestimmt auf verschiedene Krankheiten von Interesse. Wir sind aktiv HSPC gen Therapieansätze aus verschiedenen Blickwinkeln, darunter die grundlegende Wissenschaft der Biologie, das Engraftment gen veränderten HSPCs im vorklinischen in-vivo-Modelle und die Anwendung relevanten Patientenpopulationen HSPC untersucht. Wir und andere haben die Zelle Oberfläche Phänotyp der funktionell unterschiedliche HSPC Teilmengen1,2,3, die Mobilisierung und Klimaanlage-Regimen, die HSPC Ertrag und Engraftment bei gleichzeitiger Minimierung der maximieren gekennzeichnet Toxizität4,5, und das Gen Modifikation und gen-Bearbeitung-Strategien, die auf eine Vielzahl von bösartigen, genetische und Infektionskrankheiten6,7,8, zugeschnitten 9,10. Die Funktion und Engraftment gen veränderten HSPCs können in einer Reihe von kleinen und großen Tier-Modelle, darunter Mäuse, Hunde und NHP ausgewertet werden. NHP-Modelle sind insbesondere vorteilhaft, weil viele Reagenzien, z. B. Antikörper spezifisch für HSPC Zelle Oberflächenproteine wie CD34 und CD90, in Menschen- und NHP Zellen austauschbar verwendet werden. Außerdem gibt es im Gegensatz zu Mäusen, große Tiere wie NHP eine größere Annäherung der Skala der gentechnische Veränderung für klinische Wirksamkeit notwendig. Zu guter Letzt NHP sind der Goldstandard für die Modellierung von menschlichen Krankheiten wie HIV-1 Infektion11 und einer aufstrebenden Modellsystem für Kandidaten gegen Krebs und Anti-HIV-Immuntherapien12,13.
Der Zweck dieses Protokolls ist, Methoden zur Reinigung, genetisch verändern und Vorbereitung NHP HSPC Infusion Produkte zu skizzieren. Obwohl nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls haben wir bereits gezeigt, dass diese Produkte in autologen NHP Gastgeber weiterhin, Anlass zu allen hämatopoetischen Linien und therapeutische Wirksamkeit bei den unterschiedlichsten Krankheiten Modelle1 bieten. Wir haben auch charakterisiert die Infektionsstaus anwachsen HSPCs und bauten eine Plattform zur Verfolgung der Kinetik, Menschenhandel und Phänotyp der einzelnen HSPCs und deren Nachkommen, folgende autologe Transplantation1,14. Die hier vorgestellten Methoden wurden mit den folgenden Zielen entwickelt: (i) zum Isolieren von hochreinen HSPCs und langfristige anwachsen HSC Teilmengen, Ii) primitive HSCs während ex-Vivo-Kultur zu pflegen, und Iii) effizient gen ändern-entweder lose HSPCs oder langfristige anwachsen HSC Teilmengen. Wir beschäftigen magnetische unterstützt-Zellsortierung (MACS), sowie Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS), um phänotypisch/funktionell unterschiedliche HSPC Populationen, konsistent mit den Methoden der vielen Gruppen2,15, isolieren 16. Die Aufrechterhaltung der primitiven HSCs in Kultur (d. h. die Differenzierung der Zellen in engagierten Stammväter, die Anlass zu voll zu minimieren differenziert lymphatischen und myeloische Teilmengen) ist eine wesentliche Facette des hier beschriebenen Protokolls. Obwohl wir zuvor Ansätze gekennzeichnet haben, um HSPCs zu erweitern, unter Beibehaltung einer primitiven Phänotyp17,18, hier beschreiben wir eine Protokoll, die konzentriert sich auf die Erhaltung der HSCs über eine minimale (48 h) und ex-Vivo-Kultur definiert.
Die effiziente Modifikation von HSPCs und HSC Teilmengen ist ein zentrales Ziel dieses Protokolls. Unter mehreren Ansätzen haben wir berichtet, zwei sind bei weitem die am meisten untersuchten in klinischen Studien: LV-vermittelten gentechnische Veränderung und Nuklease-vermittelten gen Bearbeitung1,6,19. Gen-Bearbeitung Strategien verwenden Sie eine der Nuklease-Plattformen, um insbesondere eine gezielte gen von Interesse zu ändern, z. B. C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) für die Behandlung der HIV-Infektion7,19 oder Bcl11A für die Behandlung Hämoglobinopathien6. Hier konzentrieren wir uns auf LV-vermittelten gentechnische Veränderung, in denen transgene Ladungen Genom1,8,20semirandomly integrieren. Ein wesentlicher Vorteil von LV Ansätze ist die Fähigkeit, große Mengen von genetischem Material (bis zu 8 oder 9 Kilobases) liefern. Obwohl gen Bearbeitung Strategien entwickelt werden, um gezielt ein Transgen von Interesse, nur auf einen bestimmten Ort zu integrieren durch Spender homologe Rekombination (HDR), erfordern diese Methoden weiter Entwicklung in-vitro- und in kleiner Tiermodelle. Im Gegensatz dazu wurden LV Vektoren ausgiebig in NHP und Patienten21,22eingesetzt. Wichtig ist, kann das Protokoll hier beschrieben wird, welche Nutzung BM als Ausgangspunkt HSPC Quelle grundiert, leicht und im großen und ganzen, z. B. angepasst werden um PBSCs zu isolieren. Wie oben beschrieben, nutzen wir die hohe genetische Ähnlichkeit zwischen Menschen und NHP Reagenzien zu verwenden, die auf beide Arten anwendbar sind. Schließlich wurde dieser Ansatz angepasst, um anderen blutbildenden Teilmengen, nämlich T Zellen12,23,24zu ändern; das Aufkommen der wirksame Ansätze der T-Zell-Immuntherapie hat stark auf die gleiche LV-Plattform genutzt, die in diesem Protokoll verlassen. Diese Methoden eignen sich für jeden Forscher HSPC Biologie oder LV-vermittelten gentechnische Veränderung interessiert. Zum Beispiel das HSPC Reinigung Protokoll hier vorgestellten Roman HSC-angereicherten Teilmengen zu charakterisieren genutzt werden wie zuvor beschrieben,1,15,25. Ebenso werden die LV-Transduktion, die hier vorgestellte Methoden in ähnlicher Weise könnte angewendet und für zahlreiche andere Zelltypen und experimentelle Fragen, sowohl im in-vitro und in vivo Modellen weiterentwickelt.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir Ihnen Methoden zum isolieren und NHP HSPCs genetisch zu verändern. Diese Methoden können für andere Arten und anderen Quellen der HSPCs leicht angepasst werden. Dieses sorgfältig geprüfte Protokoll zeigt viel versprechend in der Modellierung von wirksamen Therapien für zahlreiche Krankheiten des Menschen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC) Stammzelltransplantation wurde ein Grundstein zur Therapie Leukämie und anderen Krebsarten seit fast einem halben Jahrhundert, das einzige bekannte Heilmittel des humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) Infektion zugrunde liegt, und zeigt große Versprechen in die Behandlung von Erbkrankheiten wie Beta-Thalassämie. Unsere Gruppe entwickelte ein Protokoll zum Modell HSPC Gentherapie bei nichtmenschlichen Primaten (NHP), so dass Wissenschaftler zur Optimierung vieler der gleichen Reagenzien und Techniken, die in der Klinik angewendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Reinigung von CD34+ HSPCs und langfristig anhaltenden hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Teilmengen aus grundiert Knochenmark (BM). Identische Techniken können für die Reinigung von anderen HSPC-Quellen (z. B. mobilisiertem peripherem Blutstammzellen [PBSCs]) eingesetzt werden. Dargestellt ist ein 2-Tages-Protokoll in der Zellen werden gereinigt, kultiviert, geändert mit Lentivirus (LV) und Infusionslösung zurück in die autologe Host vorbereitet. Wichtige Messwerte des Erfolgs sind die Reinheit der CD34+ HSPC Bevölkerung, die Fähigkeit der gereinigten HSPCs morphologisch unterschiedliche Kolonien in halbfesten Medien und vor allem Gen Modifikation Effizienz zu bilden. Der entscheidende Vorteil HSPC Gentherapie ist die Fähigkeit, eine Quelle der langlebigen Zellen, die alle blutbildenden Zelltypen hervorbringen. Als solche wurden diese Methoden zu Modell Therapien gegen Krebs, genetische Erkrankungen und Infektionskrankheiten eingesetzt. In jedem Fall wird die therapeutische Wirksamkeit von verbessern die Funktion der unterschiedlichen HSPC nachkommen, einschließlich der roten Blutkörperchen, T-Zellen, B-Zellen und/oder myeloische Teilmengen gegründet. Die Methoden zu isolieren, zu ändern, und bereiten HSPC Produkte sind direkt anwendbar und übersetzbar für mehrere Krankheiten bei menschlichen Patienten.

Das oben beschriebene Protokoll soll isolieren und gen-ändern NHP CD34+ HSPCs, die anschließend wieder in die autologe Host (Abbildung 1 und Abbildung 2) infundiert werden können. Wenn Sie dieses Protokoll folgen, wir in der Regel erhalten bis zu 8 x 109 insgesamt Leukozyten von grundiert BM aus Zopf Makaken und, manchmal, das Doppelte von Rhesus-Makaken. Bei beiden Spezies, die Anzahl der CD34+</sup...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Für die Bewertung der Effizienz und Sicherheit vielversprechender und neuartiger Gentherapieansätze ist die umfassende Prüfung genmodifizierter Zellen in validierten präklinischen In-vivo-Modellen von entscheidender Bedeutung. Die Erhaltung der Kreuzreaktivität von Reagenzien von relevanten Zelloberflächenmarkern und die Fähigkeit, die gleichen unterstützenden Behandlungen anzuwenden, die Patienten entlang nichtmenschlicher Primatenmodelle verabreicht werden, um klinische Parameter genau nachzuahmen. Mit mir wird Anai Perez, eine Forschungstechnikerin aus dem Labor von Dr.Hans-Peter Kiem, das Verfahren demonstrieren.Beginnen Sie mit 10 bis 12 Milliliter Aliquots Knochenmark isoliert von einem gesunden nichtmenschlichen Primatenspender in 50 Milliliter konische Röhren. Bringen Sie das Volumen der Röhre auf 50 Milliliter mit hämolytischem Puffer und inkubieren Sie die Zellen für bis zu sieben Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Zellablagerungen durch Zentrifugation, und aspirieren Sie alle bis auf die letzten zwei bis fünf Milliliter des Überstandes.Setzen Sie das Pellet im Restüberstandvolumen wieder auf, indem Sie das Rohr durchstreichen, und übertragen Sie die Knochenmarksuspensionen in ein neues 50-Milliliter-Rohr mit einem 70-Mikrometer-Porenzellsieb, um Blutgerinnsel zu entfernen. Fügen Sie einen frischen hämolytischen Puffer hinzu, um das Volumen auf 50 Milliliter zu erhöhen, und brüten Sie die Zellen für weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur vor ihrer Entnahme durch Zentrifugation. Aspirieren Sie alle Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter max Puffer.Bevor Sie die Zellsuspension durch ein weiteres 70 Mikrometer Porensieb filtern, spülen Sie das Rohr mit 40 Millilitern frischer Puffer ab und bündeln Sie die Wäsche mit der Zellsuspension. Nach der Anreicherung für CD34-positive Zellen nach Standard-Magnetunterstützten-Zell-Sortierprotokollen die Perlenisolierten zellen in bis zu 50 Milliliter frischer Maximalpuffer waschen und das Pellet im HSPC-Medium wieder aufhängen. Dann Platte 10 bis 20 Milliliter der Zellen in belüfteten Gewebe kultiviert behandelt T75-Flaschen für ihre Nachtkultur in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator.Um die Reinheit der Zellproben des Knochenmarks vor und nach der Anreicherung zu bewerten, wird ein Flow-Zytometrie-Protokoll mit den entsprechenden Plots und der Populationshierarchie erstellt, das alle Tore für alle Ereignisse Streuung, CD34-positive, hämatopoetische Stammzellen, multipotente an-erythro myeloische Vorläufer und lymphomyeloische Vorläufer zeigt. Führen Sie anschließend eine ungefärbte, voranreicherte, weiße Blutkörperchenprobe durch, um die Spannungen für die vorderen und seitlichen Streuparameter und alle Fluoreszenzkanäle, gefolgt von einzelnen gebeizten Kompensationsperlen, anzupassen, um die Kompensation zwischen benachbarten Kanälen anzupassen. Führen Sie dann alle verbleibenden ungefärbten und gebeizten Proben mit dem angepassten und kompensierten Protokoll aus, um die Anreicherungseffizienz des CD34 zu dokumentieren.Wenn alle Kompensationen gesetzt sind, konfigurieren Sie den Zellsortierer für die Sortierung der CD34-Teilmengen in koloniebildende Zellassays und laden Sie das mit Dercd34 angereicherte Probenrohr auf das Zytometer. Dann zeichnen Sie 2000 bis 3000 Ereignisse auf, und passen Sie die Sortierungstore fein an die Signalstärke und die Zielpopulationen an. Wenn das Setup abgeschlossen ist, erfassen Sie die Zellen, die die Durchflussrate auf 500 bis 1000 Zellen pro Sekunde einstellen, und sortieren 800 bis 1200 Zellen aus der Streuung, CD34-positive, hämatopoetische Stammzelle, multipotente an-erythro myeloische Progenitor und Lympho myeloische Vorläufertore in separate Röhren mit 3,6 Millilitern koloniebildenden Zellmediums pro Tube.Am Ende des Sortexs die Sammelröhrchen, und fügen Sie einen Milliliter Zellsuspension zu drei sterilen 3,5 Zentimeter, Nicht-Gewebe-Kultur behandelt Petrischalen in einzelnen 15 Zentimeter Petrischalen pro Zellpopulation für ihre 10-14-Tage-Inkubation bei 37 Grad Celsius gesetzt. Am nächsten Morgen verwenden Sie eine 10 Milliliter Pipette, um die anhaftenden Zellen von der Unterseite jedes Kolbens mit sterilem HBSS sanft zu spülen und die geernteten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie die Zellen im Transduktionsmedium bei einer Konzentration von 1 x 10 auf die 6. Zelle pro Milliliter wieder aus.Und fügen Sie einen Milliliter Zellen für die Mock-Kontrolle in einem Brunnen eines rekombinanten Fibronectin-Fragments beschichtet 12 Well-Platte für eine nachtübernachtige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Dann fügen Sie 10 Milliliter Aliquots der verbleibenden Zellen in rekombinante Fibronectin-Fragment beschichtet T75-Flaschen für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit den Kappen entlüftet. Während der Inkubation Tauwetter viruskonditionierte mittlere Proben und berechnen die Menge des Virus hinzugefügt werden, basierend auf dem Titer und die Anzahl der infektiösen Einheiten der Zellen pro Milliliter.Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fügen Sie jedem Kolben das entsprechende Volumen des viruskonditionierten Mediums hinzu, bevor Sie die Zellen auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zurückbringen. Am nächsten Morgen übertragen Sie die Zellen aus dem Kolben in einzelne 50 Milliliter konische Röhren. Waschen Sie die Zellen in bis zu 50 Milliliter HBSS pro Wäsche, und wiederholen Sie diesen Schritt bis zu dreimal, um Restviren zu entfernen.Inkubieren Sie die Zellen für zwei Stunden in HSPC-Medien, ergänzt durch Prostaglandin E2. Dann waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter HBSS mit 2% autologem Serum pro Tube ergänzt. Dann die Zellsuspensionen mit einer 20-Milliliter-Spritze mit einer 16,5-Spur-Nadel ansaugen. Waschen Sie die Innenseite des Rohres mit frischem HBSS plus 2% autologem Serum und aspirieren Sie in die Spritze.Verschließen Sie die Spritze vorsichtig mit der Nadelkappe, bevor Sie die Zelllösung auf Eis legen, bis ihre Infusion in einen autologen Wirt gelangt. Zur Bestimmung der Genmodifikationseffizienz der transduzierten Zellen wird die Platte 1 x 10 bis zur 6. reservierten Mock- oder Transduced-Zellen pro Milliliter HSPC-Medium auf nicht-gewebekulturbehandelte Platten bestimmt. An den Tagen zwei, fünf und zwölf nach der Transduktion, Ernten und zählen Sie die Zellen.An den Tagen zwei und fünf 33% der Zellen in frischem HSPC-Medium mit einer Konzentration von 1 x 10 bis zur 6. Milliliter-Konzentration neu aufteilen. An den Tagen zwei, fünf und zwölf, einfrieren 33% der Zellen in DNA-Extraktionspuffer für quantitative Echtzeit-PCR, und analysieren die letzten 33% der Zellen durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen, um die phänotytische Zusammensetzung der hämatopoetischen Nachkommen zu bewerten. Um die Transgenexpression durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, fügen Sie drei zusätzliche Seitenstreuung vs.Transgenplots;und Tor der ersten Handlung auf den hämatopoetischen Stammzellen, das zweite Diagramm auf den multipotenten an-erythro myeloischen Vorläufern und das dritte Diagramm auf den lymphomyeloischen Vorläufern, alle gegen das Transgen. Dann rekorde 2000 bis 3000 Ereignisse auf und justieren die Sortierungstore fein an die Signalstärke und die Zielpopulationen.Mit diesem Protokoll ist die Anzahl der nichtmenschlichen Primaten-CD34-positiven HSPCs, die angereichert sind, in der Regel proportional zur Gesamtanzahl der weißen Blutkörperchen. Da frühere Ergebnisse gezeigt haben, dass das gesamte CD34-positive HSPC-Produkt Zellen enthält, die nicht wirklich langfristig sind, und hämatopoetische Stammzellen pfropfen, können diese strömungszytometriebasierten und koloniebildenden Zelltechniken verwendet werden, um Submengen, die für langfristige hämatopoetische Stammzellen von engagierten Vorläufern angereichert sind, zuverlässig zu identifizieren und zu unterscheiden. CD34 positive menschliche Stammzell angereicherte Zellen können effizient genmodifiziert werden, indem lentivirale Vektoren verwendet werden.Zellen, die eine nicht integrierte Kopie des Vektors tragen, verdünnen sich über die 12-tägige Flüssigkultur-Assay-Periode, während stabil integrierte Vektoren im Genom an alle Nachkommen weitergegeben werden. Wie durch die Expression des Vektors in koloniebildenden Zell-Assays bestätigt. Diese präklinische Methode kann verwendet werden, um genetisch veränderte in qualitätskontrollierten nichtmenschlichen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für die Gentherapie zu isolieren.Diese Methode kann leicht für andere Arten angepasst werden, Quellen von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, Gentherapie-Tools und Krankheiten. Dieses gründlich geprüfte Protokoll ist vielversprechend für die Modellierung wirksamer Therapien für zahlreiche menschliche Krankheiten. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit nichtmenschlichen Primatengeweben verbesserte Sicherheitsmaßnahmen erfordert, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Forschung

Genetik

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Eine schnelle und Quantitative Methode für Post-translationale Modifikation und Variante aktiviert Mapping von Peptiden mit Genomen

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...