Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

המחברים מודים הלן קרופורד על הכנת את כתב היד, ג'ים Woolace לעיצוב גרפי, ואת ורוניקה נלסון Devikha Chandrasekaran עבור השתתפות בפיתוח של הפרוטוקול. הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים של NIH המכון הלאומי לאלרגיה, מחלות זיהומיות (R01 AI135953 ו- AI138329 כדי H.P.K.) הלאומי ללב, ריאות, ואת מכון דם (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ו U19 HL129902 אל H.P.K.), כמו גם NIH P51 OD010425, בחלקו דרך מרכז הסרטן NIH/NCI, תמיכה גרנט P30 CA015704. H.P.K. הוא חוקר רפואה מולקולרית מרקי קיבל תמיכה כנמען ההשבעה של חוסה קאררס/דגלס Donnall תומאס ניחן הכיסא לחקר הסרטן, הכיסא ניחן פרד. האץ ' תא, ריפוי גנטי.

עצמיים NHP השתלות, הטרמה (גיוס), האוסף של תאים, שינוי ג'ין מתנהלים בקנה אחד עם פרוטוקולים שפורסמו בעבר26. בכל ההליכים ניסיוני נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה את פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן, באוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול #3235 - 01). כל מחקרים מבוצעים בהתאמה ?...

LV וקטור הנדסה היא השיטה הכי מאופיין ג'ין-לשנות סוגי תאים כגון CD34+ HSPCs, כבר אין ויוו עוקבות. הפרוטוקול המתואר כאן מיועד על מנת למקסם את מספר גנים-לאחרונה HSPCs זה נמשכות לטווח ארוך ויוו, לספק יתרונות קליניים בחולים עם מחלות ממאירות, זיהומיות, גנטי שונות. למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין הופיעו ב...

ריפוי גנטי בתאי גזע הוא אמצעי רב עוצמה כדי לטפל מגוון רחב של פתולוגיות אנושי. ריפוי גנטי HSPC היא גישה אטרקטיביים במיוחד, בשל i) בקלות יחסית של איסוף תאים אלה מחולים, ii) שפע של ידע זה אינו זמין לגבי פנוטיפים פני שטח התא, ex-vivo תרבות פרמטרים,, כשדה מתרחב, כי השלישי) הוא מציג מדענים עם ארגז הכלים ההולכת וגדלה של אסטרטגיות שינוי גנטי המותאמים במחלות שונות של עניין. אנו לחקור באופן פעיל HSPC ג'ין גישות טיפול מזוויות מרובות, כולל המדע הבסיסיים של ביולוגיה HSPC, את engraftment של ג'ין-השתנה HSPCs במודלים פרה ויוו, היישום לאוכלוסיות החולה הרלוונטיים. אנחנו ואחרים שאפיינו את תא השטח גן # מושגים בסיסיים של נפרדים פונקציונלית HSPC קבוצות משנה1,2,3, גיוס משטרי מיזוג למקסם את התשואה HSPC engraftment תוך מזעור רעילות4,5והגן השינוי ואסטרטגיות לעריכת ג'ין יש כבר למידותיו של מגוון רחב של ממאירות, גנטית, מחלות זיהומיות6,7,8, 9,10. ניתן להעריך את תפקוד ואת engraftment של HSPCs ג'ין-לאחרונה במספר דגמים קטנים, גדולים-מוצרים מהחי, כולל עכברים, כלבים ו NHPs. בפרט, מודלים NHP הם יתרון כי נוגדנים רבים, למשל, נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים פני שטח התא HSPC כמו CD34 ו- CD90, ניתן להשתמש בקבצים של האדם ותאים NHP. יתר על כן, בניגוד עכברים, חיים גדולים, כגון NHPs מאפשרים הערכה קרובה יותר של הסקאלה של התאמת גנים הדרושים עבור יעילות קלינית. לבסוף, NHPs תקן זהב עבור עיצוב אנושי פתולוגיות כגון זיהום ב- HIV-111 והם מערכת מודל המתעוררים המועמד נגד סרטן, אנטי-איידס immunotherapies12,13.
המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר שיטות טיהור, גנטית שינוי והכנת המוצרים אינפוזיה NHP HSPC. למרות שמחוץ להיקף של פרוטוקול זה, אנחנו בעבר הראו כי מוצרים אלה engraft ב hosts NHP עצמיים, להצמיח כל שושלות hematopoietic, מספקים יעילות טיפולית במגוון רחב של דגמים המחלה1. יש גם שאפיינה את clonality של engrafting HSPCs ואנו נבנה פלטפורמה כדי לעקוב אחר קינטיקה, סחר, של פנוטיפ של HSPCs בודדים, הצאצאים שלהם, עצמיים השתלת הבאות1,14. השיטות המובאות כאן פותחו עם היעדים הבאים: i) כדי לבודד HSPCs מאוד טהור ו לטווח ארוך engrafting HSC קבוצות משנה, ii) כדי לשמור על HSCs פרימיטיביים במהלך ex-vivo תרבות, ו- iii) לשינוי ביעילות ג'ין-גם בתפזורת HSPCs או לטווח ארוך קבוצות משנה של מועדון הכדורגל מונפלייה engrafting. אנו מעסיקים מגנטי בסיוע-מיון תא (מקינטוש), וכן תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), לבודד phenotypically/פונקציונלית ברורים HSPC אוכלוסיות, בקנה אחד עם שיטות רבות קבוצות2,15, 16. קיום פרימיטיבי HSCs בתרבות (קרי, למזער את הבידול של תאים אלה לתוך אבות מחויבת לתת עלייה במלואה הבדיל קבוצות משנה הלימפה ואת מיאלואידית) היא היבט חיוני של הפרוטוקול המתואר כאן. למרות שאנחנו בעבר אפיינו גישות כדי להרחיב את HSPCs תוך שמירה על פנוטיפ פרימיטיביים17,18, כאן, אנו מתארים פרוטוקול זה מתמקד שמירה על HSCs ויה מינימלי (h 48) ומוגדר ex-vivo תרבות.
השינוי יעיל של HSPCs ומועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה היא המטרה המרכזית של פרוטוקול זה. בין מספר גישות דיווחנו, שניכם עד כה הניסויים הקליניים ובדוקים ביותר ב: שינוי ג'ין בתיווך LV, בתיווך נוקלאז גן לעריכת6,1,19. אסטרטגיות לעריכת גן אחד של מספר פלטפורמות נוקלאז לשינוי במיוחד גן יישוב עניין, לדוגמה, C-C כימוקין קולטן הקלד 5 (CCR5) לטיפול ב- HIV זיהום7,19 או Bcl11A לטיפול פתולוגיות של המוגלובין6. כאן, אנו מתמקדים שינוי ג'ין בתיווך LV, שבו מטענים הטרנסגניים להשתלב semirandomly8,1,20הגנום. יתרון מפתח של LV גישות היא היכולת לספק כמויות גדולות של חומר גנטי (עד 8 או 9 kilobases). למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין מפותחים למטרה transgene עניין לשלב רק בשעה לוקוס שצוין על-ידי רקומבינציה הומולוגית התורם (HDR), שיטות אלה דורשים יותר לפיתוח במבחנה, במודלים של בעלי חיים קטנים. לעומת זאת, LV וקטורים נעשה שימוש נרחב ב- NHPs וב -חולים21,22. חשוב, הפרוטוקול המתואר כאן, שמשתמשת בשלה מוניטור כמקור HSPC ההתחלתי, ניתן בקלות, בהרחבה להתאים, למשל, לבודד PBSCs. כמתואר לעיל, עלינו לנצל של רמה גבוהה של דמיון גנטי בין NHPs לבין בני האדם להשתמש ריאגנטים הרלוונטיים בשני המינים. לבסוף, הותאם בגישה זו כדי לשנות קבוצות משנה hematopoietic אחרים, כלומר T תאים12,23,24; כניסתו של גישות חיסוני יעיל של T-cell הסתמכה בכבדות על פלטפורמה זהה LV מנוצל פרוטוקול זה. שיטות אלה מתאימים עבור כל חוקר מעוניין HSPC ביולוגיה או שינוי בתיווך LV ג'ין. לדוגמה, פרוטוקול טיהור HSPC המובאת כאן יכול לשמש כדי לאפיין את הרומן מועשר-מועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה, כפי שתואר לעיל15,1,25. באופן דומה, התמרה חושית LV השיטות המובאות כאן יכול באופן דומה להיות מיושם, פיתוח נוסף עבור רבים סוגי תאים אחרים, שאלות ניסיוני, שניהם במודלים במבחנה ו ויוו.
לסיכום, אנו מציגים שיטות כדי לבודד ולשנות גנטית NHP HSPCs. שיטות אלה ניתן להתאים בקלות עבור מינים אחרים ומקורות אחרים של HSPCs. פרוטוקול זה ביסודיות vetted מציגה הבטחה גדולה הדגמים של טיפולים אפקטיבי עבור מחלות אנושיות רבות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

השתלת תא (HSPC) hematopoietic של גזע, קדמון היה טיפול אבן הפינה של לוקמיה, סרטן אחרים במשך כמעט חצי מאה, ביסוד התרופה היחידה הידועה של זיהום וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), ואני מראה הבטחה עצומה הטיפול במחלות גנטיות כגון בטא תלסמיה. הקבוצה שלנו פיתחה פרוטוקול טיפול גנטי HSPC דגם במוסר פרימטים (NHPs), מאפשרת למדענים למטב את רבים של ריאגנטים אותו טכניקות מוחלים במרפאה. כאן, אנו מתארים שיטות לטיהור CD34+ HSPCs, לטווח ארוך שמירת תאי גזע hematopoietic (HSC) קבוצות משנה של מח העצם כאשר הבחינה (מוניטור). טכניקות זהה יכול להיות מועסק ולטיהור מקורות HSPC אחרים (למשל, גויסו דם היקפיים בתאי גזע [PBSCs]). בקווים כלליים הוא פרוטוקול 2 יום שבו תאים מטוהרים, תרבותי, שונה עם lentivirus (LV), הכין אינפוזיה בחזרה לתוך המארח עצמיים. המפרט מפתח להצלחה כוללים את טוהר CD34+ HSPC האוכלוסייה, היכולת של HSPCs מטוהרים להקים מושבות נפרדות מורפולוגית מדיה חצי קשות, ויעילות, והכי חשוב, ג'ין השינוי. היתרון המפתח כדי ריפוי גנטי HSPC היא היכולת לספק מקור של תאים חיים ארוכים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. ככזה, שיטות אלה שימשו מודל טיפולים עבור סרטן, מחלות גנטיות מחלות זיהומיות. בכל מקרה, היעילות הטיפולית היא הוקמה על ידי שיפור הפונקציה צאצאי HSPC ברורים, לרבות תאי דם אדומים, תאי T, תאים B, ו/או מיאלואידית קבוצות משנה. השיטות לבודד אותו, לשנות, להכין HSPC המוצרים הם ישירות הרלוונטיים לתרגום מרובים למחלות בחולים אנושיים.

הפרוטוקול המתואר לעיל נועד לבודד ולשנות ג'ין-NHP CD34+ HSPCs, אשר לאחר מכן להיות חדורים בחזרה לתוך המחשב המארח עצמיים (איור 1 ואיור 2). כאשר בעקבות פרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להשיג עד 8 x 109 WBCs הכולל של מוניטור להתקפת מ שהצטיירה קופי מקוק, ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

כדי להעריך את היעילות והבטיחות של גישות מבטיחות וחידוש ריפוי גנטי, הבדיקה המקיפה של תאים שעברו שינוי גנים במודלים פרה-קליניים מאומתים ב-vivo היא קריטית. שימור תגובתיות צולבת של סמני פני תאים רלוונטיים של מגיבים, ויכולת ליישם את אותם טיפולים תומכים המנוהלים לחולים לאורך מודלים פרימטים לא אנושיים כדי לחקות מקרוב פרמטרים קליניים. הדגמת ההליך איתי תהיה אני פרז, טכנאי מחקר מהמעבדה של ד"ר הנס-פיטר קיאם.התחל על ידי הוספת 10 עד 12 aliquots מיליליטר של מח עצם מבודד מתורם פרימטים לא אנושי בריא לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר. מביאים את נפח הצינור עד 50 מיליליטר עם חיץ המוליטי, ו דגירה התאים עד שבע דקות בטמפרטורת החדר. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה, ושואפים את כל 2-5 המיליליטרים האחרונים של העל-טבעי.תן מחדש את גלולה בנפח על טבעי שיורית על ידי הבהוב הצינור, ולהעביר את מתלי מח העצם לתוך צינור חדש 50 מיליליטר באמצעות מסננת תא נקבובית 70 מיקרומטר כדי להסיר את כל קרישי הדם. מוסיפים חיץ המוליטי טרי כדי להביא את עוצמת הקול עד 50 מיליליטר, ו דגירה התאים במשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר לפני האוסף שלהם על ידי צנטריפוגה. שאף את כל העל-טבעי והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של חיץ מרבי.לפני סינון ההשעיה התא דרך מסננת נקבובית נוספת של 70 מיקרומטר, שטפו את הצינור עם 40 מיליליטר של חיץ טרי, ובריכה לשטוף עם המתלה התא. לאחר העשרה עבור תאים חיוביים CD34 על פי פרוטוקולי מיון תאים בסיוע מגנטי סטנדרטי, לשטוף את התאים מבודדים חרוזים עד 50 מיליליטר של מאגר מרבי טרי, ו resuspend את גלולה במדיום HSPC. ואז צלחת 10 עד 20 מיליליטר של התאים לתוך רקמות מאווררות בתרבות מטופלים T75 flasks לתרבות הלילה שלהם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.כדי להעריך את טוהר ההעשרה לפני ולאחר של דגימות התא של מח העצם ליצור פרוטוקול cytometry זרימה עם חלקות מתאימות היררכיה האוכלוסייה מראה את כל השערים עבור כל האירועים להתפזר, CD34 חיובי, תאי גזע hematopoietic, רב תכליתי א-אריתרו מיאלואידים האבות מיאלואידים. לאחר מכן, הפעל דגימת תאי דם לבנים לא מזוהמים, טרום העשרה, כדי להתאים את המתחים לפרמטרים של פיזור קדימה וצד, וכל תעלות הפלואורסצנטיות ואחריהן חרוזי פיצוי מוכתמים בודדים כדי להתאים את הפיצוי בין הערוצים הסמוכים. לאחר מכן הפעל את כל הדגימות הנותרות שאינן מוכתמות ומוכתמות בפרוטוקול המותאם והמפוצה כדי לתעד את יעילות ההעשרה של CD34.כאשר כל הפיצויים נקבעו להגדיר את סדרן התא עבור טיהור המיון של ערכות המשנה CD34 לתוך המושבה להרכיב מעין תא, ולטעון את צינור מדגם מועשר CD34 מוכתם על הציטרומטר. לאחר מכן הקליטו 2000 עד 3000 אירועים, והתאיימו עין את שערי המיון כך שיתאימו לעוצמת האות ולאוכלוסיות היעד. לאחר השלמת ההתקנה, התאים המתכווים את קצב הזרימה ל- 500 עד 1000 תאים לשניה, ומיון 800 עד 1200 תאים מהפיזור, CD34 חיובי, תא גזע hematopoietic, רב תכליתי א-אריתרו מיאלואיד אבי העורקים לימפו מיאלואיד שערים לתוך צינורות נפרדים המכילים 3.6 מיליליטר של המושבה להרכיב תא בינוני לכל צינור.בסוף המערבולת סוג צינורות האיסוף, ולהוסיף מיליליטר אחד של השעיית תאים לשלושה סטרילי 3.5 ס"מ, תרבות שאינה רקמה מטופלים צלחות פטרי להגדיר בתוך בודדים 15 ס"מ פטרי מנות לכל אוכלוסיית התא עבור הדגירה שלהם 10-14 יום ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר להשתמש פיפט 10 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות את התאים חסידים מתחתית כל בקבוק עם HBSS סטרילי, ולאסוף את התאים שנקטפו על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר בתאים במדיום ההעתקה בריכוז של 1 x 10 לתאים השישיים למיליליטר.ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לשליטה מדומה באר אחת של שבר פיברונקטין רקומביננטי מצופה 12 צלחת גם עבור דגירה לילה באינקובטור תרבות התא. לאחר מכן להוסיף 10 aliquots מיליליטר של התאים הנותרים לתוך שבר פיברונקטין רקומביננטי מצופה T75 בקבוקים עבור דגירה 30 דקות באינקובטור תרבות התא עם הכובעים מאווררים. במהלך הדגירה להפשיר וירוס מותנה דגימות בינוניות ולחשב את כמות הנגיף להתווסף על סמך טיטר ומספר יחידות זיהומיות של תאים למיליליטר.מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ומוסיפים את הנפח המתאים של הנגיף המותנה בינוני לכל בקבוקון לפני החזרת התאים ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת בבוקר להעביר את התאים מהבקבוק לתוך צינורות חרוט בודדים 50 מיליליטר. לשטוף את התאים עד 50 מיליליטר של HBSS לכל לשטוף, ולחזור על צעד זה עד שלוש פעמים כדי להסיר וירוס שיורית.הדגירה את התאים במשך שעתיים במדיה HSPC בתוספת פרוסטגלנדין E2. לאחר מכן לשטוף את התאים ו resuspend התאים ב 10 מיליליטר של HBSS בתוספת 2% סרום אוטולוגי לכל צינור. ואז שאף את מתלי התא באמצעות מזרק 20 מיליליטר מצויד במחט מד 16.5. לשטוף את החלק הפנימי של הצינור עם HBSS טרי בתוספת 2% סרום אוטולוגי, ולשאוף לתוך המזרק.בזהירות לכסות את המזרק עם מכסה המחט לפני הנחת פתרון התא על קרח עד עירוי שלה לתוך מארח אוטולוגי. כדי לקבוע את יעילות שינוי הגנים של התאים המתומרים, לוח 1 x 10 לתאים השמורים השישית או התומרה למיליליטר של מדיום HSPC על לוחות שטופלו בתרבות שאינה רקמה. בימים 2, 5 ו-12 לאחר ההעתקה, לקצור ול לספור את התאים.בימים 2 ו-5, יש להכפיל את עצמם ל-33% מהתאים במדיום HSPC טרי בריכוז של 1 x 10 עד השישי למיליליטר. בימים 2, 5 ו-12, להקפיא 33% מהתאים במאגר מיצוי DNA עבור PCR כמותי בזמן אמת, ולנתח את 33% הסופי של התאים על ידי cytometry זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי להעריך את ההרכב הפנוטיפי של הצאצא hematopoietic. כדי לכמת את ביטוי הטרנסג'ין לפי ציטומטריית זרימה, הוסף שלושה פיזור צד נוסף לעומת.עלילות טרנסג'נדריות;ושער העלילה הראשונה על תאי הגזע המטופויטיים, העלילה השנייה על הא-אריתרו מיאלואידים הרב-תכליתיים, והמזימה השלישית על אבי הלימפה מיאלואידים, כולם נגד הטרנסג'ין. לאחר מכן הקליטו 2000 עד 3000 אירועים והתאיימו עין את שערי המיון כך שיתאימו לעוצמת האות ולאוכלוסיות היעד.באמצעות פרוטוקול זה מספר ה-CD34 החיובי של הפרימט הלא אנושי המועשר הוא בדרך כלל פרופורציונלי לספירת תאי הדם הלבנים הכוללת של הקלט. כמו ממצאים קודמים הראו כי המוצר הכולל CD34 חיובי HSPC כולל תאים כי הם לא נכון לטווח ארוך השתלת תאי גזע hematopoietic, אלה cytometry זרימה מבוסס ומושבה להרכיב טכניקות תא יכול לשמש כדי לזהות ולהבדיל באופן אמין תת קבוצות מועשר עבור תאי גזע hematopoietic לטווח ארוך מן הצאצאים מחויבים. CD34 תאי גזע אנושיים חיוביים מועשרים תאים ניתן לשנות ביעילות באמצעות וקטורים lentiviral.תאים הנושאים עותק לא משולב של הווקטור מדוללים החוצה במהלך תקופת ההתזה של 12 הימים של התרבות הנוזלית, ואילו וקטורים משולבים היטב בגנום מועברים לכל בני העורב. כפי שאושר על ידי הביטוי של הווקטור במושבה ויוצרים משגיחי תאים. שיטה פרה-קלינית זו יכולה לשמש לבידוד מהונדס גנטית בגזע הפרימטים המטופויטיים הנשלטים על ידי איכות ותאי פרימטים ראשוניים לריפוי גנטי.שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות עבור מינים אחרים, מקורות של גזע hematopoietic ותאי ההדגנה, כלי ריפוי גנטי ומחלות. פרוטוקול זה נבדק ביסודיות מראה הבטחה גדולה עבור מידול של טיפולים יעילים עבור מחלות אנושיות רבות. זכור שעבודה עם רקמות פרימטים לא אנושיות דורשת אמצעי אבטחה משופרים, כולל ציוד מגן אישי.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

שיטה כמותית ומהירה השינוי Post-translational וגרסא מופעלת מיפוי של פפטידים כדי הגנום

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...