Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

लेखक इस पांडुलिपि, ग्राफिक डिजाइन के लिए जिम Woolace, और वेरोनिका नेल्सन और Devikha Chandrasekaran प्रोटोकॉल के विकास में भाग लेने के लिए तैयार करने के लिए हेलेन क्रॉफर्ड धंयवाद । इस प्रोटोकॉल का विकास NIH राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान (R01 AI135953 और AI138329 से H.P.K.) और राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173, और U19 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था HL129902 to H.P.K.), साथ ही NIH P51 OD010425 और, भाग में NIH के माध्यम से NCI कैंसर केंद्र, सहायता अनुदान P30 CA015704. H.P.K. एक Markey आणविक दवा अन्वेषक है और जोस Carreras के उद्घाटन प्राप्तकर्ता के रूप में समर्थन प्राप्त/ई. Donnall थॉमस संपंन चेयर कैंसर अनुसंधान के लिए और फ्रेड हच सेल और जीन थेरेपी के लिए संपंन कुर्सी ।

ऑटोलॉगस NHP प्रत्यारोपण, भड़काना (जुड़ाव), कोशिकाओं के संग्रह, और जीन संशोधन पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल26के अनुरूप आयोजित कर रहे हैं । सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु द...

LV वेक्टर इंजीनियरिंग, vivo में क्रमिक प्रत्यारोपण के लिए CD34+ HSPCs जैसे सेल प्रकारों को जीन-संशोधित करने के लिए सर्वोत्तम-विशेषता पद्धति है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित जीन संशोधित HSPCs की संख्या को अधिकतम करने ?...

स्टेम सेल जीन थेरेपी मानव विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता करने के लिए एक शक्तिशाली साधन है । HSPC जीन थेरेपी एक विशेष रूप से आकर्षक दृष्टिकोण है, मैं के कारण) रोगियों से इन कोशिकाओं को इकट्ठा करने के सापेक्ष आसानी, द्वितीय) ज्ञान है कि सेल सतह phenotypes और पूर्व vivo संस्कृति मानकों के बारे में उपलब्ध है धन, और, के रूप में क्षेत्र का विस्तार, क्योंकि iii) यह जीन संशोधन ब्याज के विभिंन रोगों के अनुरूप रणनीतियों के एक कभी बढ़ती toolbox के साथ वैज्ञानिकों को प्रस्तुत करता है । हम सक्रिय रूप से कई कोणों से HSPC जीन थेरेपी के दृष्टिकोण की जांच कर रहे हैं, HSPC जीवविज्ञान के बुनियादी विज्ञान सहित, engraftment में जीन संशोधित HSPCs के नैदानिक में vivo मॉडल, और प्रासंगिक रोगी आबादी के लिए आवेदन । हम और दूसरों को कार्यात्मक विशिष्ट HSPC के सेल सतह phenotype विशेषता है1,2,3, संघटन और कंडीशनिंग परहेजों है कि HSPC उपज और engraftment को अधिकतम जबकि ंयूनतम विषाक्तता4,5, और जीन संशोधन और जीन संपादन रणनीति है कि घातक, आनुवंशिक, और संक्रामक रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सिलवाया गया है6,7,8, 9,10. जीन-संशोधित HSPCs के फंक्शन और engraftment में चूहों, कुत्तों, और NHPs सहित छोटे-और बड़े जानवरों के मॉडलों की संख्या का मूल्यांकन किया जा सकता है । विशेष रूप से, NHP मॉडल लाभप्रद हैं क्योंकि कई रिएजेंट, उदाहरण के लिए, CD34 और CD90 जैसे HSPC सेल सतह प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी, मानव और interchangeably कोशिकाओं में NHP इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, चूहों के विपरीत, इस तरह के NHPs के रूप में बड़े जानवरों नैदानिक प्रभावकारिता के लिए आवश्यक जीन संशोधन के पैमाने के एक करीब सन्निकटन की अनुमति. अंत में, NHPs ऐसे एचआईवी के रूप में मानव विकृतियों की मॉडलिंग के लिए सोने के मानक हैं-1 संक्रमण11 और उंमीदवार विरोधी और विरोधी के लिए एक उभरते मॉडल प्रणाली-एचआईवी immunotherapies12,13हैं ।
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए शुद्ध, आनुवंशिक रूप से संशोधित करने, और NHP HSPC अर्क उत्पादों की तैयारी के लिए तरीकों की रूपरेखा है । हालांकि इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर, हम पहले से पता चला है कि इन उत्पादों ऑटोलॉगस NHP मेजबान में engraft, सभी टेम वंश को जंम दे, और रोग मॉडल1की एक व्यापक रेंज में चिकित्सीय प्रभावकारिता प्रदान करते हैं । हम भी engrafting HSPCs के clonality की विशेषता है और कैनेटीक्स, तस्करी, और व्यक्तिगत phenotype और उनकी संतान के HSPCs, ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण1,14के बाद ट्रैक करने के लिए एक मंच का निर्माण किया । यहां प्रस्तुत तरीकों को निंनलिखित लक्ष्यों के साथ विकसित किया गया है: i) उच्च शुद्ध HSPCs और दीर्घकालिक engrafting HSC उपसमुच्चय, द्वितीय) को अलग करने के लिए पूर्व vivo संस्कृति के दौरान आदिम HSCs बनाए रखने के लिए, और iii) कुशलतापूर्वक जीन-संशोधित या तो थोक HSPCs या दीर्घकालिक engrafting HSC उपसमुच्चय । हम काम चुंबकीय सहायता सेल-छंटाई (एमएसीएस), साथ ही साथ प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS), phenotypically को अलग करने के लिए/कार्यात्मक विशिष्ट HSPC आबादी, कई समूहों के तरीकों के साथ संगत2,15, 16. संस्कृति में आदिम HSCs के रखरखाव (यानी, प्रतिबद्ध progenitors में इन कोशिकाओं के भेदभाव को कम करने कि पूरी तरह से विभेदित लसीकावत् और माइलॉयड सबसेट को जंम दे) यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक आवश्यक पहलू है । हालांकि हम पहले HSPCs विस्तार करने के लिए दृष्टिकोण विशेषता है, जबकि एक आदिम phenotype17,18, यहां बनाए रखने, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ंयूनतम के माध्यम से HSCs को बनाए रखने पर ध्यान केंद्रित का वर्णन (४८ ज) और परिभाषित पूर्व vivo संस्कृति ।
HSPCs और HSC सबसेट के कुशल संशोधन इस प्रोटोकॉल का एक केंद्रीय लक्ष्य है । कई दृष्टिकोण हम रिपोर्ट किया है के अलावा, दो अब तक सबसे नैदानिक परीक्षणों में जांच की है: एल. वी.-मध्यस्थता जीन संशोधन और nuclease-मध्यस्थता जीन संपादन1,6,19. जीन संपादन रणनीतियों nuclease प्लेटफार्मों की संख्या में से एक का उपयोग विशेष रूप से ब्याज की एक लक्षित जीन को संशोधित करने के लिए, उदाहरण के लिए, सी सी chemokine रिसेप्टर प्रकार 5 (CCR5) एचआईवी संक्रमण के उपचार के लिए7,19 या Bcl11A उपचार के लिए की hemoglobinopathies6. यहां, हम LV-मध्यस्थता जीन संशोधन, जिसमें ट्रांसजेनिक कार्गो जीनोम1,8,20में semirandomly एकीकृत पर ध्यान केंद्रित । LV दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण लाभ के लिए आनुवंशिक सामग्री की बड़ी मात्रा में वितरित करने की क्षमता है (अप करने के लिए 8 या 9 kilobases) । हालांकि जीन संपादन रणनीतियों के लिए ब्याज की एक transgene लक्ष्य मुताबिक़ दाता पुनर्संयोजन (HDR) द्वारा एक निर्दिष्ट लोकस में ही एकीकृत करने के लिए विकसित किया जा रहा है, इन तरीकों और इन विट्रो में और छोटे पशु मॉडल में विकास की आवश्यकता है । इसके विपरीत, LV वैक्टर NHPs में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और रोगियों में21,22। महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां वर्णित है, जो एक प्रारंभिक HSPC स्रोत के रूप में प्रधानमंत्री बीएम का उपयोग करता है, आसानी से और मोटे तौर पर अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, PBSCs को अलग करने के लिए । जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम NHPs और मनुष्यों के बीच आनुवंशिक समानता के उच्च डिग्री का लाभ लेने के लिए है कि दोनों प्रजातियों के लिए लागू कर रहे है रिएजेंट का उपयोग करें । अंत में, इस दृष्टिकोण को संशोधित करने के लिए अनुकूलित किया गया है अंय टेम सबसेट, अर्थात् टी कोशिकाओं12,23,24; प्रभावोत्पादक टी के आगमन-सेल immunotherapy दृष्टिकोण एक ही LV इस प्रोटोकॉल में उपयोग मंच पर भरोसा किया है । इन पद्धतियों या तो HSPC जीव विज्ञान या एल. वी. मध्यस्थता जीन संशोधन में रुचि किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयुक्त हैं । उदाहरण के लिए, यहां प्रस्तुत HSPC शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए उपंयास HSC-समृद्ध उपसेट, के रूप में पहले वर्णित1,15,25विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । इसी तरह, LV transduction तरीकों यहां प्रस्तुत इसी तरह लागू किया जा सकता है और आगे कई अंय सेल प्रकार और प्रयोगात्मक प्रश्न, दोनों में इन विट्रो में और vivo मॉडल के लिए विकसित की है ।
संक्षेप में, हम वर्तमान तरीकों को अलग और आनुवंशिक रूप से NHP HSPCs संशोधित । इन तरीकों को आसानी से अंय प्रजातियों और HSPCs के अंय स्रोतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह अच्छी तरह से संचालित प्रोटोकॉल कई मानव रोगों के लिए प्रभावोत्पादक चिकित्सा की मॉडलिंग में महान वादा दिखाता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

टेम स्टेम और जनक सेल (HSPC) ट्रांसप्लांटेशन ल्यूकेमिया और अन्य कैंसर के लिए लगभग आधा सदी के लिए एक आधारशिला चिकित्सा किया गया है, मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी-1) संक्रमण के एकमात्र ज्ञात इलाज पर निर्भर करता है, और में अपार वादा दिखाता है आनुवंशिक रोगों के उपचार जैसे बीटा thalassemia । हमारे समूह के मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है HSPC मानव रहनुमाओं (NHPs) में जीन थेरेपी, वैज्ञानिकों को एक ही एजेंट और तकनीक है कि क्लिनिक में लागू कर रहे है के कई अनुकूलित करने की अनुमति । यहां, हम CD34 शुद्ध करने के लिए तरीकों का वर्णन+ HSPCs और दीर्घकालिक बनी टेम स्टेम सेल (HSC) प्रधान अस्थि मज्जा (बीएम) से सबसेट । समान तकनीक अंय HSPC स्रोतों की शुद्धि के लिए नियोजित किया जा सकता है (जैसे, परिधीय रक्त स्टेम सेल [PBSCs] जुटाए) । उल्लिखित एक 2 दिन प्रोटोकॉल जिसमें कोशिकाओं को शुद्ध कर रहे हैं, संस्कृति, lentivirus (एल. वी.) के साथ संशोधित, और ऑटोलॉगस मेजबान में वापस अर्क के लिए तैयार । सफलता की कुंजी readouts CD34+ HSPC जनसंख्या की शुद्धता, शुद्ध HSPCs की क्षमता आकृति विज्ञान मीडिया में semisolid अलग कालोनियों फार्म का, और सबसे महत्वपूर्ण बात, जीन संशोधन दक्षता शामिल हैं । HSPC जीन थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण लाभ के लिए लंबे समय तक रहने वाले कोशिकाओं है कि सभी टेम कोशिका प्रकार को जंम दे के एक स्रोत प्रदान करने की क्षमता है । जैसे, इन तरीकों को कैंसर, आनुवंशिक रोगों, और संक्रामक रोगों के लिए मॉडल चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्रत्येक मामले में, चिकित्सकीय प्रभावकारिता लाल रक्त कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और/या माइलॉयड सबसेट सहित विशिष्ट HSPC संतान के समारोह को बढ़ाने के द्वारा स्थापित किया गया है । HSPC उत्पादों को अलग करने, संशोधित करने और तैयार करने के तरीकों को मानव रोगियों में कई रोगों के लिए सीधे लागू और अनुवाद योग्य हैं ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को अलग और जीन संशोधित NHP CD34+ HSPCs, जो बाद में वापस ऑटोलॉगस मेजबान में संचार किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2) के लिए डिज़ाइन किया गया है । जब इस प्?...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को गैर अमानवीय रहनुमा CD34+ कोशिकाओं को अलग कर रहा है प्रधान अस्थि मज्जा से, जीन के लिए-lentiviral वैक्टर के साथ इन कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए, और ऑटोलॉगस मेजबान में अर्क के लिए एक उत्पाद तैयार करते हैं । कुल प्रोटोकॉल लंबाई लगभग ४८ एच है ।

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में सीआरआईएसपीआर / कैस 9-मध्यस्थता वाली जीन नॉकआउट्स के चयन-आश्रित और स्वतंत्र जनरेशन

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

डीएनए संशोधनों के लिए Immunostaining: फोकल छवियों की गणना विश्लेषण

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक Vivo में संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

एक तेजी से और मात्रात्मक विधि के बाद अनुवाद संशोधन और संस्करण के लिए पेप्टाइड्स की मैपिंग जीनोम के लिए सक्षम

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

मानव स्टेम और जनक आबादी के आणविक और Immunophenotypic विविधता की विशेषताएं करने के लिए एक मिश्रित एकल सेल दृष्टिकोण

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...