Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Gli autori ringraziano Helen Crawford per la preparazione di questo manoscritto, la Jim Woolace per la progettazione grafica e la Veronica Nelson e la Devikha Chandrasekaran per partecipare allo sviluppo del protocollo. Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto da sovvenzioni da NIH National Institute of Allergy e malattie infettive (R01 AI135953 e AI138329 a H.P.K.) e il National Heart, Lung e Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 e U19 HL129902 a H.P.K.), come pure di NIH P51 OD010425 e, in parte attraverso il NIH/NCI Cancer Center, supporto Grant P30 CA015704. H.P.K. è un ricercatore di medicina molecolare Markey e ricevuto sostegno come destinatario inaugurale della José Carreras/E. Donnall Thomas dotata di sedia per ricerca sul cancro e la sedia dotata di Fred Hutch per cella e Gene Therapy.

Trapianti autologhi NHP, adescamento (mobilizzazione), la raccolta delle cellule e la modificazione genetica sono condotte coerenti con protocolli precedentemente pubblicati26. Tutte le procedure sperimentali sono esaminate e approvate dal comitato di uso del Fred Hutchinson Cancer Research Center e l'Università di Washington e istituzionali Animal Care (protocollo #3235 - 01). Tutti gli studi sono effettuati in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da labo...

Vettore di LV ingegneria è il metodo migliore-caratterizzato da gene-modificare tipi cellulari come CD34+ HSPCs, per il successivo trapianto in vivo. Il protocollo descritto qui è stato progettato per massimizzare il numero di HSPCs gene-modificato che persistono a lungo termine in vivo e fornire benefici clinici ai pazienti con varie malattie maligne, infettive e genetiche. Anche se le strategie di modifica del gene sono emerse nell'ultimo decennio, LV-modificato cellule sono i migliori studiato in vitro, n...

Terapia genica con cellule staminali è un potente mezzo per affrontare una vasta gamma di patologie umane. Terapia genica HSPC è un approccio particolarmente attraente, a causa di i) la relativa facilità di raccolta di queste cellule dai pazienti, ii) la ricchezza di conoscenza che è disponibile per quanto riguarda la superficie fenotipi cellulari ed ex vivo parametri di cultura e, come il campo si espande, perché iii) presenta scienziati con un crescente della casella degli strumenti di modifica genica su misura per varie malattie di interesse. Stiamo attivamente indagando HSPC approcci di terapia genica da angolazioni diverse, tra cui la scienza di base di biologia HSPC, l'attecchimento di HSPCs gene-modificato in modelli preclinici in vivo e l'applicazione di rilevanti popolazioni di pazienti. Noi ed altri abbiamo caratterizzato il fenotipo di superficie delle cellule di funzionalmente distinte HSPC sottoinsiemi1,2,3, la mobilizzazione e regimi di condizionamento che massimizzano il rendimento HSPC e attecchimento, riducendo al minimo tossicità4,5ed il gene modifica e strategie di modifica del gene che sono state adattate ad una vasta gamma di maligno, genetica e malattie infettive6,7,8, 9,10. La funzione e l'attecchimento del HSPCs gene-modificato può essere valutati in una serie di modelli di piccoli e grandi animali, tra cui topi, cani e NHPs. In particolare, modelli NHP sono vantaggiose perché molti reagenti, ad esempio, gli anticorpi specifici per proteine della superficie cellulare HSPC come CD34 e CD90, possono essere utilizzati indifferentemente in umani e cellule NHP. Inoltre, contrariamente ai topi, grandi animali come NHPs consentono una migliore approssimazione della scala di modificazione genetica necessari per efficacia clinica. Infine, NHPs sono il gold standard per la modellazione delle patologie umane come l'HIV-1 infezione11 e un sistema di modello emergente per candidato anticancro e anti-HIV immunoterapie12,13.
Lo scopo del presente protocollo è di delineare i metodi per purificare, geneticamente modificati e preparare NHP HSPC infusione prodotti. Anche se all'esterno dell'ambito del presente protocollo, precedentemente abbiamo indicato che questi prodotti attecchire in host NHP autologo, danno luogo a tutte le filiere emopoietiche e forniscono efficacia terapeutica in una vasta gamma di modelli di malattia1. Abbiamo anche caratterizzato il clonality di attecchimento HSPCs e costruito una piattaforma per monitorare la cinetica, il traffico e il fenotipo di HSPCs individuali e la loro progenie, seguente trapianto autologo1,14. I metodi qui presentati sono stati sviluppati con i seguenti obiettivi: i) per isolare HSPCs altamente puro e a lungo termine attecchimento sottoinsiemi HSC, ii) per mantenere HSCs primitivo durante ex vivo di cultura e iii) di gene-modificare in modo efficiente sia alla rinfusa HSPCs o a lungo termine capacità di integrazione sottoinsiemi HSC. Ci avvaliamo di magnetico-assistita ordinamento delle cellule (MACS), così come fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), per isolare fenotipico/funzionalmente HSPC popolazioni distinte, coerente con i metodi di molti gruppi2,15, 16. La manutenzione di HSCs primitivo nella cultura (cioè, riducendo al minimo la differenziazione di queste cellule nei progenitori che danno luogo a completamente differenziato sottoinsiemi linfoidi e mieloidi) è un aspetto essenziale del protocollo descritto qui. Anche se in precedenza abbiamo caratterizzato gli approcci per espandere HSPCs pur mantenendo un fenotipo primitivo17,18, qui, descriviamo un protocollo che si concentra sul mantenimento di HSCs tramite un minimo (48h) ed è definita ex vivo di cultura.
La modifica efficiente di HSPCs e HSC sottoinsiemi è un obiettivo centrale del presente protocollo. Tra i diversi approcci che abbiamo segnalato, due sono di gran lunga il più studiato in sperimentazioni cliniche: modificazione genetica LV-mediata e nucleasi-mediata del gene editing1,6,19. Strategie di modifica del gene uno di una serie di piattaforme di nucleasi consente di modificare in modo specifico un gene bersaglio di interesse, ad esempio, ricevitore di chemokine C-C tipo 5 (CCR5) per il trattamento di HIV infezione7,19 o Bcl11A per il trattamento di emoglobinopatie6. Qui, ci concentriamo sulla modificazione genetica LV-mediata, in cui carichi transgenici semirandomly integrano il genoma1,8,20. Un vantaggio chiave di approcci di LV è la capacità di fornire grandi quantità di materiale genetico (fino a 8 o 9 kilobasi). Anche se modifica del gene strategie stanno sviluppandi per impostare come destinazione un transgene di interesse a integrare solo in un locus specificato tramite la ricombinazione omologa donatore (HDR), questi metodi richiedono ulteriore sviluppo in vitro e in modelli animali di piccole dimensioni. Al contrario, vettori di LV sono stati ampiamente utilizzati in NHPs e in pazienti21,22. D'importanza, il protocollo descritto qui, che utilizza innescato BM come fonte HSPC iniziale, può essere ampiamente e facilmente adattato, ad esempio, per isolare PBSCs. Come descritto in precedenza, approfittiamo dell'elevato grado di somiglianza genetica tra NHPs e gli esseri umani per usare i reagenti che valgono per entrambe le specie. Infine, questo approccio è stato adattato per modificare altri sottoinsiemi ematopoietici, vale a dire T cellule12,23,24; l'avvento di efficaci approcci di immunoterapia di T-cellula ha fatto affidamento sulla stessa piattaforma LV utilizzata nel presente protocollo. Questi metodi sono adatti per qualsiasi ricercatore interessato in biologia HSPC o modificazione genetica LV-mediata. Ad esempio, il protocollo di purificazione HSPC presentato qui potrebbe essere utilizzato per caratterizzare nuovi sottoinsiemi HSC-arricchito, come descritto in precedenza1,15,25. Allo stesso modo, la trasduzione di LV metodi qui presentati allo stesso modo potrebbero essere applicata e ulteriormente sviluppata per numerosi altri tipi cellulari e domande sperimentali, sia in modelli in vitro ed in vivo.
In sintesi, vi presentiamo metodi per isolare e modificare geneticamente NHP HSPCs. Questi metodi possono essere facilmente adattati per altre specie e altre fonti di HSPCs. Questo protocollo accuratamente controllato Mostra la grande promessa nella modellazione delle terapie efficaci per numerose malattie umane.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Trapianto di cellule (HSPC) di staminali e progenitrici ematopoietico è stato una terapia di pietra angolare per la leucemia e di altri cancri per quasi mezzo secolo, sottende l'unica cura conosciuta dell'infezione del virus di immunodeficenza umana (HIV-1) e Mostra la promessa immenso in il trattamento di malattie genetiche come la beta talassemia. Il nostro gruppo ha sviluppato un protocollo di terapia genica di modello HSPC in primati non umani (NHPs), permettendo agli scienziati di ottimizzare molti dei reagenti e tecniche che vengono applicate nella clinica stessa. Qui, descriviamo i metodi per la purificazione CD34+ HSPCs e sottoinsiemi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) persistenza a lungo termine da innescata del midollo osseo (BM). Tecniche identiche possono essere impiegate per la depurazione di altre fonti HSPC (ad es., mobilitato periferico cellule staminali [PBSCs]). Descritte è un protocollo di 2 giorni in cui le cellule sono purificate, coltivate, modificate con lentivirus (LV) e preparate per infusione nuovamente dentro l'host autologo. Letture di chiave di successo includono la purezza del CD34+ HSPC popolazione, la capacità di HSPCs purificato di formare colonie morfologicamente distinte in supporti semisolidi e, soprattutto, efficienza di modificazione del gene. Il vantaggio chiave di terapia genica HSPC è la capacità di fornire una fonte di cellule longeve che danno origine a tutti i tipi di cellule ematopoietiche. Come tali, questi metodi sono stati utilizzati per terapie di modello per cancro, malattie genetiche e malattie infettive. In ogni caso, l'efficacia terapeutica è stabilito migliorando la funzione della progenie HSPC distinte, tra cui i globuli rossi, cellule T, cellule B, o sottoinsiemi mieloide. I metodi per isolare, modificare e preparare HSPC prodotti sono direttamente applicabili e traducibili per malattie multiple in pazienti umani.

Il protocollo descritto sopra è stato progettato per isolare e gene-modificare NHP CD34+ HSPCs, che può successivamente essere infuso nuovamente dentro l'host autologo (Figura 1 e Figura 2). Quando seguendo questo protocollo, abbiamo solitamente ottenere fino a 8 x 109 totali globuli bianchi da BM innescata da macachi pigtail e, a volte, raddoppiare tale importo da macachi rhesus. In entrambe le specie, il...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Per valutare l'efficienza e la sicurezza di approcci di terapia genica promettenti e nuovi, è fondamentale il test completo delle cellule geneticamente modificate in modelli preclinici in vivo convalidati. La conservazione della reattività incrociata dei reagenti dei marcatori di superficie cellulare pertinenti e la capacità di applicare gli stessi trattamenti di supporto somministrati ai pazienti lungo modelli di primati non umani per imitare strettamente i parametri clinici. A dimostrare la procedura con me sarà Anai Perez, un tecnico di ricerca del laboratorio del Dr.Hans-Peter Kiem.Inizia aggiungendo da 10 a 12 millilitri di midollo osseo isolati da un donatore di primati non umani sani in tubi conici da 50 millilitri. Portare il volume del tubo fino a 50 millilitri con tampone emolitico e incubare le cellule per un massimo di sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione e aspirare tutti tranne gli ultimi due o cinque millilitri del supernatante.Rimescolare il pellet nel volume supernatante residuo facendo scorrere il tubo e trasferire le sospensioni del midollo osseo in un nuovo tubo da 50 millilitri utilizzando un filtro cellulare a poro da 70 micrometri per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Aggiungere un tampone emolitico fresco per portare il volume fino a 50 millilitri e incubare le cellule per altri cinque minuti a temperatura ambiente prima della loro raccolta mediante centrifugazione. Aspirare tutto il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di tampone massimo.Prima di filtrare la sospensione cellulare attraverso un altro filtro poro da 70 micrometri, sciacquare il tubo con 40 millilitri di tampone fresco e mettere in comune il lavaggio con la sospensione cellulare. Dopo aver arricchito per le cellule positive CD34 secondo i protocolli standard di smistamento delle cellule magnetiche assistite, lavare le cellule isolate di perline in un massimo di 50 millilitri di tampone massimo fresco e risospendare il pellet nel mezzo HSPC. Quindi placcare da 10 a 20 millilitri delle cellule in flaconi T75 trattati con tessuto ventilato per la loro coltura notturna in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5%.Per valutare la purezza pre e post arricchimento dei campioni cellulari del midollo osseo creare un protocollo di citometria a flusso con i grafici appropriati e la gerarchia della popolazione che mostra tutte le porte per tutti gli eventi scatter, CD34 positivo, cellule staminali ematopoietiche, progenitori mieloidi an-eritemo multipotenti e progenitori mieloidi linfomio. Successivamente, eseguire un campione di globuli bianchi non contaminato, pre-arricchimento, per regolare le tensioni per i parametri di dispersione avanti e laterale e tutti i canali di fluorescenza seguiti da singole perline di compensazione macchiata per regolare la compensazione tra i canali adiacenti. Quindi eseguire tutti i campioni rimanenti non macchiati e macchiati con il protocollo regolato e compensato per documentare l'efficienza di arricchimento del CD34.Una volta impostate tutte le compensazioni, configurare lo smistatore di celle per il tipo di purificazione dei sottoinsiemi CD34 in test di cellule che formano colonie e caricare il tubo campione arricchito di CD34 colorato sul citometro. Quindi registra da 2000 a 3000 eventi e regola bene i cancelli di ordinamento per adattarsi alla potenza del segnale e alle popolazioni bersaglio. Una volta completata la configurazione, acquisire le cellule regolando la portata a 500-1000 cellule al secondo e ordinando da 800 a 1200 cellule dalla dispersione, CD34 positive, cellule staminali ematopoietiche, progenitore mieloide an-eritemo multipotente e porte progenitrici mieloidi linfoploidi in tubi separati contenenti 3,6 millilitri di colonia che formano il mezzo cellulare per tubo.Alla fine del vortice di ordinamento i tubi di raccolta e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a tre sterili 3,5 centimetri, coltura non tissutale trattata piastre di Petri impostate all'interno di singole piastre di Petri di 15 centimetri per popolazione cellulare per la loro incubazione di 10-14 giorni a 37 gradi celsius. La mattina successiva utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risciacquare delicatamente le cellule aderenti dal fondo di ogni pallone con HBSS sterile e raccogliere le cellule raccolte per centrifugazione. Resospendare le cellule in mezzo di trasduzione ad un 1 x 10 alla 6a concentrazione di cellule per millilitro.E aggiungere un millilitro di cellule per il finto controllo in un pozzo di un frammento di fibronecina ricombinante rivestito con 12 piastre di pozzo per un'incubazione notturna nell'incubatrice di coltura cellulare. Quindi aggiungere aliquote di 10 millilitri delle cellule rimanenti in contenitori di fibronectina ricombinante rivestiti con T75 per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare con i tappi sfiatati. Durante l'incubazione il virus del disgelo ha condizionato campioni medi e calcolato la quantità di virus da aggiungere in base al formicolio e al numero di unità infettive di cellule per millilitro.Esenzi il pallone dall'incubatrice e aggiungi il volume appropriato di mezzo condizionato dal virus a ogni pallone prima di riportare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. La mattina seguente trasferire le cellule dal pallone in singoli tubi conici da 50 millilitri. Lavare le cellule in un massimo di 50 millilitri di HBSS per lavaggio e ripetere questo passaggio fino a tre volte per rimuovere il virus residuo.Incubare le cellule per due ore in mezzi HSPC integrati con prostaglandina E2. Quindi lavare le cellule e rimorsi le cellule in 10 millilitri di HBSS integrati con siero autologo al 2% per tubo. Quindi aspirare le sospensioni cellulari utilizzando una siringa da 20 millilitri dotata di un ago calibro 16,5. Lavare l'interno del tubo con HBSS fresco più siero autologo al 2% e aspirarlo nella siringa.Limitare con cura la siringa con il cappuccio dell'ago prima di posizionare la soluzione cellulare sul ghiaccio fino alla sua infusione in un ospite autologo. Per determinare l'efficienza di modifica genica delle cellule trasdutte, la piastra da 1 x 10 alla 6a cellule fittizie o trasdotto riservate per millilitro di mezzo HSPC su piastre trattate con coltura non tissutale. Nei giorni due, cinque e dodici post-trasduzione, raccogliere e contare le cellule.Nei giorni due e cinque, ripiebrare il 33% delle cellule in mezzo HSPC fresco a una concentrazione da 1 x 10 a 6 ° per millilitro. Nei giorni due, cinque e dodici, congelare il 33% delle cellule nel buffer di estrazione del DNA per la PCR quantitativa in tempo reale e analizzare il 33% finale delle cellule per citometria del flusso secondo protocolli standard per valutare la composizione fenotipico della progenie ematopoietica. Per quantificare l'espressione transgena in base alla citometria del flusso, aggiungere tre dispersione laterale aggiuntiva rispetto.trame transgene;e cancello il primo appezzamento sulle cellule staminali ematopoietiche, il secondo appezzamento sui progenitori mieloidi an-erythro multipotenti, e il terzo appezzamento sui progenitori mieloidi linfomio, tutti contro il transgene. Quindi registra da 2000 a 3000 eventi e regola bene i cancelli di ordinamento per adattarsi alla potenza del segnale e alle popolazioni target.Usando questo protocollo il numero di HSPC positivi CD34 di primati non umani che sono arricchiti è tipicamente proporzionale al numero totale di globuli bianchi in ingresso. Come i risultati precedenti hanno dimostrato che il prodotto HSPC positivo cd34 totale include cellule che non sono vere a lungo termine e innestando cellule staminali ematopoietiche, queste tecniche di cellule a base di citometria a flusso e di formazione di colonie possono essere utilizzate per identificare e differenziare in modo affidabile sottoinsiemi arricchiti per cellule staminali ematopoietiche a lungo termine da progenitori impegnati. Le cellule staminali umane positive CD34 possono essere modificate in modo efficiente utilizzando vettori lentivirali.Le cellule che trasportano una copia non integrata del vettore si diluivano durante il periodo di dosaggio della coltura liquida di 12 giorni, mentre i vettori stabilmente integrati nel genoma vengono trasmessi a tutta la progenie. Come confermato dall'espressione del vettore nella colonia che forma saggi cellulari. Questo metodo preclinico può essere utilizzato per isolare geneticamente modificato in cellule staminali ematopoietiche di primate non umane controllate di qualità e cellule progenitrici per la terapia genica.Questo metodo può essere facilmente adattato per altre specie, fonti di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici, strumenti di terapia genica e malattie. Questo protocollo accuratamente controllato mostra grandi promesse per la modellazione di terapie efficaci per numerose malattie umane. Tieni presente che lavorare con tessuti di primati non umani richiede misure di sicurezza migliorate, compresi i dispositivi di protezione individuale.

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Un metodo veloce e quantitativo per la modificazione post-traduzionale e variante attivato Mapping dei peptidi di genomi

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...