Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

著者は、ヘレン ・ クロフォードがこの原稿、グラフィック デザインのためのジム Woolace とベロニカ ネルソン & Devikha チャンドラセ カラン プロトコルの開発に参加するための準備をありがちましょう。このプロトコルの開発は、NIH アレルギー研究所と感染症 (R01 AI135953 と H.P.K. を AI138329) と国立心臓、肺、血液研究所 (R01 HL136135、HL116217、P01 HL122173、U19 からの補助金によって支えられました。H.P.K. に HL129902)、NIH P51 OD010425 の一部と、NIH/NCI 癌センター、サポート助成金 P30 CA015704。H.P.K. はマーキー分子医学の調査官、細胞・遺伝子治療がん研究とフレッドのハッチ寄附のホセ ・ カレーラス/E. ドナル ・ トーマス寄付研究部門の就任の受け手としてサポートを受け取った。

自家 NHP 移植、プライミング (動員)、細胞、遺伝子の改変のコレクションは、以前に公開されたプロトコル26と一致して実施しています。すべての実験プロシージャを見直し、機関動物ケアとフレッド ・ ハッチンソンがん研究センターとワシントン大学の利用委員会によって承認された (プロトコル #3235-01)。ケアと健康の国民の協会 (「ガイド」); の実験動物の使用のため?...

LV ベクトル工学は遺伝子は CD34 など細胞の種類を変更する最も特徴付けられるメソッド+ HSPCs、その後移植生体内で。ここで説明されているプロトコルは、体内では、長期的な永続化遺伝子の HSPCs の数を最大化し、様々 な悪性、感染症、遺伝的疾患を持つ患者に臨床上の利益を提供する設計されています。遺伝子編集戦略は、過去 10 年間に浮上して、LV 変更セルが最高の in vitro、動?...

幹細胞遺伝子治療は、人間の病理学の広い範囲に対処する強力な手段です。HSPC 遺伝子療法は i) 比較的容易 ii) 細胞表面形質に関すると ex vivo 文化パラメーターが利用できますし、フィールドとして展開、知識豊富な患者からこれらの細胞を収集のための特に魅力的なアプローチiii) それは興味の様々 な疾患に合わせた遺伝子変更戦略の増えツールボックスと科学者を提示します。我々 は積極的に、HSPC 生物学、インビボ モデルで臨床、遺伝子組み換え HSPCs の生着と関連する患者への応用の基礎科学を含めて、複数の角度から HSPC 遺伝子治療の方法を調査しています。私たちと他の人が機能的に異なる HSPC サブセット1,2,3動員、HSPC 収量と最小限に抑えながら生着を最大限ご利用いただけますレジメンの細胞表面形質を特徴します。毒性4、5、および遺伝子変更と幅広い悪性、遺伝、および感染症6,7,8、調整されている遺伝子編集の戦略 9,10。機能と遺伝子組み換え HSPCs の生着は、小型と大型動物モデル、マウス、犬、NHPs など数で評価できます。特に、人間・ NHP 細胞 CD34 など CD90、HSPC セル表面蛋白質のために特定の抗体など多く試薬をどちらも使用できますので、NHP モデルも有利。さらに、マウスと対照をなして NHPs など大型の動物を許可する遺伝子の改変の規模の近い近似臨床に必要です。最後に、NHPs HIV-1 感染11など人間の病理学のモデリングのためのゴールド スタンダードは、抗がん剤の候補者と反 HIV 免疫療法12,13の新興国のモデル系。
このプロトコルの目的は、NHP HSPC 注入製品の準備浄化、遺伝子の変更、およびメソッドの概要を説明することです。このプロトコルの範囲外は、以前、これらの製品はすべて造血系統を生じ、疾患モデル1の広い範囲の治療効果を提供すること、自家 NHP ホストで接がを示しています。また接が HSPCs のクローナリティの特徴して動態、人身売買、および個々 の HSPCs と彼らの子孫、次移植1,14の表現型を追跡するためのプラットフォームを構築します。紹介した方法は、以下の目標に開発されている: 非常に純粋な HSPCs および長期接が HSC サブセット、ii) ex vivo 文化の中に原始的な造血を維持し、iii) 効率的に遺伝子変更いずれかの一括 HSPCs を分離するには i) または長期的な接が HSC のサブセット。蛍光活性化セル (FACS)、表現型/機能的異なる HSPC 集団、多くのグループ2,15の方法に一貫性のあるを分離するための並べ替えだけでなく、磁気援用細胞選別 (MAC) を用いてください。 16。文化の原始の HSCs のメンテナンス (すなわち、リンパ性と骨髄性のサブセットを区別を生じさせる完全にコミットの前駆細胞にこれらの細胞の分化を最小限に抑える) ここで説明したプロトコルの重要な一面です。我々 は以前、原始的な表現型17,18, ここでは、そのまま HSPCs を展開するアプローチを特徴とが最小限 (48 h) 経由で造血を維持することに焦点を当てて、ex vivo 文化定義プロトコルについて述べる。
HSPCs と HSC の効率的な変更のサブセットはこのプロトコルの中心的な目標。報告したいくつかのアプローチの中で 2 つは、これまでで最も研究の臨床試験: LV を介した遺伝子の改変及びヌクレアーゼを介した遺伝子1,6,19を編集します。遺伝子編集戦略は特に興味の対象となる遺伝子を変更するヌクレアーゼ プラットフォームの数は 1 つを使用して、たとえば、C-C ケモカイン受容体は、治療のための HIV 感染症7,19または Bcl11A 治療のため 5 (CCR5) を入力赤血球の溶血6。ここでは、LV を介した遺伝子の改変、ゲノム1,8,20にで semirandomly、トランスジェニック貨物統合に着目します。LV のアプローチの主な利点は、(最大 8 または 9 の kilobases) 遺伝物質の大量に配信する機能です。遺伝子編集戦略は、ドナー相同組換え (HDR) によってのみ指定した軌跡で統合する興味の遺伝子をターゲットに開発されている、これらのメソッド必要がありますさらに in vitro および小さい動物モデルの開発。対照的に、LV ベクトル広く使用されている NHPs と患者21,22。重要なは、使用する下塗り開始 HSPC ソースとして BM、ここでは、説明されたプロトコル容易かつ広範に適応できます、たとえば、PBSCs を分離します。前述のように、我々 を活用 NHPs と人間両方の種に適用される試薬を使用しての間の遺伝的類似性が高いです。最後に、このアプローチは、すなわち T 細胞12,23,24; 他の造血のサブセットを変更するのに適応されています。効果的な T 細胞免疫療法アプローチの出現は、このプロトコルで利用される同じ LV プラットフォーム上大きく頼っています。これらのメソッドは、HSPC 生物学または LV を介した遺伝子の改変に興味がある研究者に適しています。たとえば、HSPC 浄化のプロトコルがここで紹介される可能性があります小説 HSC 濃縮サブセットを特徴付ける1,15,25を前述のよう。同様に、ここで示される方法は同様に可能性があります LV 伝達に適用およびさらに多数の他のセルタイプおよび両方生体外でそして生体内でモデルの実験の質問のために開発します。
要約すると、隔離および遺伝子 NHP HSPCs を変更する方法を提案する.これらのメソッドは、他の種と HSPCs の他のソースのために容易に適応することができます。この徹底的に吟味プロトコルは、多くの人間の病気の効果的な治療法のモデル化の大きい約束を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

造血幹・前駆細胞 (HSPC) 移植白血病の基礎療法とほぼ半世紀、他の癌にされている、ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) 感染の唯一の既知の治療法の基礎となるの巨大な約束を示していますベータサラセミアなど遺伝性疾患の治療。当社グループは、同じ試薬と診療所に適用される技術の多くを最適化するために科学者を許可する (NHPs)、霊長類におけるモデル HSPC 遺伝子治療プロトコルを開発しました。ここで、CD34 を浄化するための方法を説明+ HSPCs と発動を促された骨髄 (BM) から長期保存する造血幹細胞 (HSC) サブセット。他の HSPC のソース (例えば、動員末梢血幹細胞 [PBSCs]) の浄化のため、同一の手法を採用できます。説明は 2 日間プロトコルは、細胞精製、培養、レンチ ウイルス (LV) と変更され自己ホストに注入のために準備です。成功のキー読み出し CD34 の純度は、+ HSPC 人口、精製 HSPCs の能力が半固体のメディア、そして最も重要なは、遺伝子改造効率形態的に異なるコロニーを形成します。HSPC 遺伝子治療する主な利点は、あらゆる造血細胞に上昇を与える寿命の長い細胞のソースを提供する機能です。など、これらのメソッドは、がん、遺伝性疾患、感染症のモデルの治療に使用されています。それぞれのケースで異なる HSPC の子孫、赤色の血液細胞、T 細胞、B 細胞および骨髄性のサブセットを含むの機能を高めることによって治療効果が確立されます。分離、方法の変更、および HSPC の準備の製品が直接適用で変換可能な人間の患者で複数の疾患。

上記プロトコルを特定し遺伝子変更 NHP CD34 です+ HSPCs は、その後自己ホスト (図 1および図 2) に注入が可能です。このプロトコルに従うと、我々 通常最大 8 x 109総白血球はピグテール ニホンザルからプライム BM から入手し、時に、アカゲザルからその量を倍増します。両方の種、cd34 陽性数+を豊か...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

このプロトコルの目標はヒト以外の霊長類 CD34 を分離、+細胞プライミング骨髄、レンチ ウイルスのベクトルでこれらの細胞の遺伝子変更および自己ホストの注入の製品を準備します。総プロトコルの長さは、約 48 時間です。

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

有望で新しい遺伝子治療アプローチの効率と安全性を評価するためには、検証済みの前臨床インビボモデルにおける遺伝子改変細胞の包括的な試験が重要です。関連する細胞表面マーカーの試薬の交差反応性の保全、および非ヒト霊長類モデルに沿って患者に投与される同じ支持的な治療法を適用して臨床パラメータを密接に模倣する能力。私と一緒に手順を実証することは、ハンス・ピーター・キエム博士の研究室の研究技術者であるアナイ・ペレスです。健康な非ヒト霊長類ドナーから50ミリリットルの円錐形チューブに分離された骨髄の10〜12ミリリットルのアリコートを加えることで始めます。チューブの体積を50ミリリットルまで、浸透液で持ち込み、室温で最大7分間培養します。遠心分離によって細胞の破片を取り除き、上清の最後の2〜5ミリリットルを除いてすべてを吸引する。チューブをフリックして残留上清体積中のペレットを再懸濁し、骨髄懸濁液を70マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを使用して新しい50ミリリットルチューブに移し、血栓を除去します。新鮮な血分解バッファーを追加して体積を最大 50 ミリリットルにし、遠心分離によって収集する前に室温でさらに 5 分間細胞をインキュベートします。上清のすべてを吸引し、最大バッファーの10ミリリットルで細胞を再懸濁します。別の70マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過する前に、新鮮なバッファーの40ミリリットルでチューブをすすいで、細胞懸濁液で洗浄をプールします。標準的な磁気補助細胞選別プロトコルに従ってCD34陽性細胞を濃縮した後、ビード単離された細胞を最大50ミリリットルの新鮮な最大バッファーで洗浄し、HSPC培地中のペレットを再懸濁します。その後、培養した細胞の10〜20ミリリットルをベント組織にプレートし、T75フラスコを摂氏37度および5%の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養処理した。骨髄の細胞サンプルの前および後の濃縮純度を評価するために、すべての事象散乱、CD34陽性、造血幹細胞、多能アンエリスロ骨髄性前駆細胞およびリンパ球骨髄性前駆腫の全てのゲートを示す適切なプロットおよび集団階層を有するフローサイトメトリープロトコルを作成する。次に、未染色の、前濃縮、白血球サンプルを実行して、前方および側面散乱パラメータの電圧を調整し、すべての蛍光チャネルに続いて単一の染色補償ビーズを使用して隣接するチャネル間の補償を調整する。次に、CD34濃縮効率を文書化するために調整および補償されたプロトコルで、残りの染色されていないサンプルおよび染色されたサンプルをすべて実行する。全ての補正が設定されている場合、CD34サブセットの並べ替え精製のための細胞ソーターをコロニー形成細胞アッセイに構成し、染色されたCD34濃縮サンプルチューブをサイトメーターにロードする。その後、2000 から 3000 のイベントを記録し、信号強度と目標集団に合わせてソート ゲートを微調整します。セットアップが完了すると、流量を毎秒500〜1000細胞に調整し、散乱から800〜1200細胞を選別し、CD34陽性、造血幹細胞、多能性のアンエリスロ骨髄前駆腫およびリンパ球骨髄前駆ゲートを1つのコロニー1個のチューブを含む別々のチューブに入れる。コレクションチューブのボルテックスの最後に、3つの無菌3.5センチメートルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、非組織培養は、37°Cで10〜14日間のインキュベーションのために細胞集団あたり個々の15センチメートルのシャーレ内に設定されたペトリ皿を処理した。翌朝、10ミリリットルのピペットを使用して、各フラスコの底部からステキンドセルを滅菌HBSSで静かにすすいで、遠心分離によって採取した細胞を回収する。1x10で細胞を1x10から6番目の細胞に再懸濁します。そして、組み換えフィブロネクチンフラグメントの1ウェルにモックコントロール用の1ミリリットルの細胞を追加し、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベーションするために12ウェルプレートをコーティングした。次に、残りの細胞の10ミリリットルのアリコートを組換えフィブロネクチンフラグメントに加え、T75フラスコをコーティングし、キャップをベントして細胞培養インキュベーターに30分間インキュベートする。インキュベーション解凍ウイルスコンディション培地サンプルの間に、価およびミリリットル当たりの感染性単位数に基づいて、添加するウイルスの量を計算する。培養器からフラスコを取り出し、各フラスコに適切な量のウイルス調節培地を加えてから、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%に戻します。翌朝、フラスコから細胞を個々の50ミリリットル円錐形チューブに移す。1回の洗浄で最大50ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄し、このステップを最大3回繰り返して残留ウイルスを除去します。プロスタグランジンE2を補ったHSPC培地で細胞を2時間インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、チューブあたり2%の自己血清を補ったHBSSの10ミリリットルで細胞を再懸濁します。その後、16.5ゲージ針を装備した20ミリリットルの注射器を使用して細胞懸濁液を吸引する。新鮮なHBSSプラス2%の自己血清でチューブの内側を洗浄し、注射器に吸引します。自己宿主に注入するまで氷の上に細胞溶液を置く前に、慎重に針キャップで注射器をキャップします。トランスデューセドされた細胞の遺伝子改変効率を決定するために、プレート1 x 10をHSPC培地のミリリットル当たり1ミリリットル当たり予約mockまたはトランスデュースした細胞を非組織培養処理プレートに投与した。2日目、5日目、12日目の転写後、細胞を収穫して数えます。2日目と5日目に、新鮮なHSPC培地中の細胞の33%を1x10から6ミリリットルの濃度で再プレートする。2日目、5日目、12日目に、定量的リアルタイムPCR用のDNA抽出バッファー内の細胞の33%を凍結し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって細胞の最終33%を分析し、造血原生の表向き組成を評価する。流量サイトメトリーによってトランスジーン発現を定量化するには、3つの側面散乱対を追加する。トランスジーンプロット;とゲート造血幹細胞上の最初のプロット、多能性アンエリスロ骨髄性前駆腫の第2のプロット、およびリンパ筋骨髄性前駆体の第3のプロット、すべて対トランスジーン。その後、2000~3000のイベントを記録し、信号強度と目標集団に合わせてソートゲートを細かく調整します。このプロトコルを用いて、富化された非ヒト霊長類CD34陽性HSPCの数は、典型的には、入力総白血球数に比例する。これまでの知見によると、CD34陽性HSPC製品の合計には、真の長期および移植造血幹細胞ではない細胞が含まれていることが示されているように、これらのフローサイトメトリーベースおよびコロニー形成細胞技術は、長期間の造血幹細胞に富んだサブセットを確実に同定し、分化するために使用することができる。CD34陽性ヒト幹細胞濃縮細胞は、レンチウイルスベクターを用いて効率よく遺伝子改変することができる。12日間の液体培養アッセイ期間にわたって希釈されたベクターの非統合コピーを運ぶ細胞は、ゲノム中の安定的に統合されたベクターが子孫のすべてに渡される。コロニー形成細胞アッセイにおけるベクターの発現によって確認された。この前臨床方法は、遺伝子治療のための品質管理された非ヒト霊長類造血幹細胞および前駆細胞で遺伝子組み換え遺伝子組み換えに使用することができる。この方法は、他の種、造血幹細胞および前駆細胞の供給源、遺伝子治療ツールおよび疾患に容易に適応することができる。この徹底的に吟揚されたプロトコルは、多数のヒト疾患に対する効果的な治療法のモデリングに大きな約束を示しています。非ヒト霊長類組織で作業するには、個人用保護具を含む強化されたセキュリティ対策が必要です。

Research

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Genetics

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Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

翻訳後修飾とバリアントの高速、定量的な方法はペプチドのゲノムへのマッピングを有効に

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...