Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

저자는이 원고, 그래픽 디자인, 짐 Woolace 그리고 베로니카 넬슨과 Devikha Chandrasekaran 프로토콜의 개발에 참여를 준비 하기 위한 헬렌 크로포드를 감사 합니다. 이 프로토콜의 개발 알레르기의 NIH 국립 연구소와 전염병 (R01 AI135953와 H.P.K. AI138329) 국가 심 혼, 폐, 및 혈액 연구소 (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173, 및 U19에서 교부 금에 의해 지원 되었다 H.P.K. HL129902), NIH P51 OD010425 뿐만 아니라, 일부 NIH/NCI 암 센터, 지원 그랜트 P30 CA015704를 통해. H.P.K.는 마 키 분자 의학 탐정 세포 및 유전자 치료에 대 한 암 연구와 프레드 허 치 부여의 자에 대 한 지원의 호세 카레라스/E. Donnall 토마스 부여 자의 취임 받는 사람으로 받은.

헌 NHP 이식, 못쓰게 (동원), 셀, 및 유전자 수정 컬렉션 이전 게시 프로토콜26일치 실시 합니다. 모든 실험 절차 검토 및 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터와 워싱턴 대학 (프로토콜 #3235-01). 모든 연구는 관심과 건강의 국가 학회 ("가이드");의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드의 권장에 따라 실시 동물 연구에 무작위로 지정 되었다.
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LV 벡터 엔지니어링은 유전자 수정 CD34 셀 유형 베스트 특징이 방법+ HSPCs, 이후 이식 vivo에서. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 수정 HSPCs, vivo에서 장기 유지의 수를 극대화 하 고 다양 한 악성, 감염 및 유전 질환을 가진 환자에 게 임상 혜택을 제공 설계 되었습니다. 유전자 편집 전략 지난 10 년간 등장, LV 수정 세포는 최고의 생체 외에서, 동물 모델, 그리고 환자1,</s...

줄기 세포 유전자 치료 인간 병 리의 넓은 범위를 해결 하는 강력한 수단 이다. HSPC 유전자 치료는 특히 매력적인 접근 이다, i) 상대적으로 완화의 환자에서 이러한 셀을 수집 ii) 사용할 수 셀 표면 고기 및 ex vivo 문화 매개 변수 이며, 필드와 확장, 지식 재산 때문 때문에 iii) 과학자 들은 유전자 수정 전략 관심의 다양 한 질병에 맞게 늘어나는 도구 상자와 함께 제공. 우리는 적극적으로 HSPC 생물학, 유전자 수정 HSPCs 전 임상 생체 조건 모델에서의 engraftment 및 관련 환자 인구를 응용 프로그램의 기초 과학을 포함 하 여 여러 각도에서 HSPC 유전자 치료 접근을 조사 하고있다. 우리와 다른 기능적으로 뚜렷한 HSPC 하위 집합1,2,3, 동원 및 컨디셔닝 regimens HSPC 수율 및 최소화 하면서 engraftment를 극대화 하는 세포 표면 표현 형 특징 있다 독성4,5, 그리고 유전자 수정 및 다양 한 악성, 유전, 그리고 전염병6,7,8,를 맞게 되었습니다 유전자 편집 전략 9,10. 쥐, 개, NHPs를 포함 한 작은 큰-동물 모델의 여러에서 기능과 유전자 수정 HSPCs의 engraftment를 평가할 수 있습니다. 특히, NHP 모델은 많은 시 약, 예를 들어 CD34 CD90, 같은 HSPC 세포 표면 단백질을 위한 특정 항 체를 번갈아 인간과 NHP 셀에 사용할 수 있기 때문에 유리. 또한, 마우스, 달리 NHPs 같은 큰 동물 허용 가까이 근사 유전자 수정의 규모의 임상 효능에 필요한. 마지막으로, NHPs 에이즈-1 감염11 같은 인간의 병 리 모델링에 대 한 황금 표준 고 후보 항 암 및 항 HIV immunotherapies12,13신흥 모델 시스템입니다.
이 프로토콜의 목적은 NHP HSPC 주입 제품 준비 및 정화, 유전자 수정 방법 개요입니다. 이 프로토콜의 범위 밖에 서 우리는 이전에 표시 있지만 이러한 제품 헌 NHP 호스트에서 engraft 모든 조 혈 계보, 하 고 질병 모델1의 광범위 한 범위에서 치료 효능을 제공 합니다. 우리 또한 engrafting HSPCs의 clonality를 특징 하 고 속도 론, 매매, 및 개별 HSPCs 및 그들의 자손, 다음 헌 이식1,14형 추적 플랫폼을 구축. 여기에 제시 된 방법은 다음과 같은 목표와 함께 개발 되었습니다: i)를 매우 순수한 HSPCs 장기 engrafting HSC 하위 집합, ii) 게 유지와 ex vivo 문화, 동안 원시 HSCs iii)를 효율적으로 유전자-수정 중 대량 HSPCs 격리 또는 장기 HSC 하위 집합 engrafting 형광 활성화 된 세포 (FACS), 격리 phenotypically/기능적으로 뚜렷한 HSPC 인구, 많은 그룹2,15의 방법으로 일관 된 정렬 뿐만 아니라 자기 기반 셀 정렬 (맥)을 고용 16. 문화에 기본 HSCs의 유지 보수 (즉, 림프 및 골수성 하위 집합을 분화 완전 하 일으키 다하고 창시자로이 세포의 분화를 최소화) 여기에 설명 된 프로토콜의 필수적인 일 면 이다. 비록 우리는 원시적인 형17,18, 여기, 유지 하면서 HSPCs를 확장 하는 접근을 특징 이전는 최소한의 (48 h) 통해 HSCs를 유지에 초점을 맞추고와 ex vivo 문화 정의 하는 프로토콜을 설명 합니다.
HSPCs 및 HSC의 효율적인 수정 하위 집합이이 프로토콜의 중앙 목표 이다. 몇 가지 방법을 우리는 보고, 중 2 개는 지금까지 가장 조사에서 임상 시험: LV 중재 유전자 수정 및 편집1,,619nuclease 중재 하는 유전자. 유전자 편집 전략 특히 관심의 대상된 유전자 수정 nuclease 플랫폼의 수 중 하나를 사용, 예를 들어 C C chemokine 수용 체 타입-5 (CCR5) 치료에 대 한 HIV 감염7,19 또는 Bcl11A의 치료에 대 한 hemoglobinopathies6의. 여기, 우리는 유전자 변형 화물 통합 semirandomly 게놈1,,820LV 중재 유전자 수정에 집중 한다. LV 방식의 주요 장점은 (최대 8 또는 9 kilobases) 유전 물질의 대용량을 제공 하는 능력입니다. 유전자 편집 전략 transgene 지정 된 장소에만 통합 하는 관심의 대상으로 동종 기증자 재결합 (HDR)에 의해 개발 되고있다, 하지만 이러한 방법을 더 생체 외에서 그리고 작은 동물 모델 개발이 필요 합니다. 대조적으로, LV 벡터 사용 되었습니다 광범위 하 게 NHPs와 환자21,22. 중요 한 것은, 사용 하는 시작 HSPC 소스로 BM 액, 여기에 설명 된 프로토콜 적응 수 있다 수 쉽고 광범위 하 게, 예를 들어 PBSCs을. 위에서 설명한 대로 우리 두 종에 적용 되는 시 약을 사용 하 여 NHPs와 인간 사이의 유전적 유사성의 높은 학위의 활용. 마지막으로,이 이렇게 맞게 조정 되었습니다 다른 조 혈 하위 집합, 즉 T 세포12,,2324; 수정 하 효과 T 세포 immunotherapy 접근의 출현이이 프로토콜에서 동일한 LV 플랫폼 무 겁 게 의존 하고있다. 이러한 메서드는 모든 연구원 HSPC 생물학 또는 LV 중재 유전자 수정에 적합 합니다. 여기에 제시 된 HSPC 정화 프로토콜 소설 HSC 농축 하위 집합의 특성을 사용 하는 수 예를 들어 앞에서 설명한1,,1525. 마찬가지로, 여기에 제시 하는 방법 수 마찬가지로 LV 변환 적용 되며 다른 수많은 세포 유형 및 실험적인 질문, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에 대 한 개발.
요약 하자면, 우리는 분리 및 유전자 NHP HSPCs를 수정 하는 방법을 제시. 이러한 메서드는 다른 종 및 HSPCs의 다른 소스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 철저 하 게 검증 된 프로토콜 수많은 인간의 질병에 대 한 효과가 치료의 모델링에 큰 약속을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPC) 이식 백혈병에 대 한 초석 치료와 거의 반세기 동안 다른 암, 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1) 감염의 유일한 알려진된 치료의 기초가 되었으며에 엄청난 약속을 보여줍니다. 베타 thalassemia 같은 유전 질환의 치료. 우리의 그룹 많은 같은 시 약 및 병원에 적용 되는 기술을 최적화 하는 과학자를 허용 nonhuman 영장류 (NHPs)에 모델 HSPC 유전자 치료 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 우리는 CD34 정화 방법 설명+ HSPCs 및 장기적인 유지 액된 골 (BM)에서 조 혈 줄기 세포 (HSC) 하위 집합. 다른 HSPC 소스 (예: 동원된 주변 혈액 줄기 세포 [PBSCs])의 정화에 대 한 동일한 기법을 사용할 수 있습니다. 설명 하는 것은 2 일 프로토콜 있는 셀은 정화, 교양, lentivirus (LV), 수정 및 헌 호스트에 다시 주입에 대 한 준비. 성공의 주요 정보는 CD34의 순도 포함+ HSPC 인구, 반 고체 미디어, 그리고 가장 중요 한 것은, 진 수정 효율에 형태학 상으로 다른 식민지를 형성 하는 순화 된 HSPCs의 기능. HSPC 유전자 치료의 주요 장점은 모든 조 혈 세포 종류를 수명이 긴 세포의 소스를 제공 하는 기능입니다. 따라서, 이러한 방법은 암, 유전 질환 및 전염 성 질환에 대 한 모델 치료에 사용 되었습니다. 각각의 경우에서 치료 효능 붉은 혈액 세포, T 세포, B 세포, 및 골수성 하위 집합을 포함 하 여 고유 HSPC 자손의 기능을 강화 하 여 설정 됩니다. 를 분리 하는 방법을 수정 하 고 준비 HSPC 제품은 직접 적용 및 번역 인간 환자에서 여러 질병에.

위에서 설명한 프로토콜은 격리 하 고 유전자 수정 NHP CD34 설계 되었습니다+ HSPCs, 이후 헌 호스트 (그림 1 및 그림 2)에 다시 들어갈 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라 때 우리가 일반적으로 피그 원숭이에서 끝났다 BM에서 8 x 10까지9 총 Wbc 얻을 그리고, 때때로, 붉은 털 원숭이에서 그 금액을 두 번. 두 종, CD34의 수...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

유망한 유전자 치료 접근법의 효율성과 안전성을 평가하기 위해 생체 내 모델에서 검증된 전임상에서 유전자 변형 세포의 포괄적인 테스트가 중요합니다. 관련 세포 표면 마커의 보존 시약의 교차 반응성, 그리고 임상 매개 변수를 밀접하게 모방하는 비 인간 영장류 모델을 따라 환자에게 투여 된 동일한 지원 치료를 적용하는 능력. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 아나이 페레즈, 박사 한스 - 피터 키엠의 실험실에서 연구 기술자가 될 것입니다.건강한 비인간 영장류 기증자로부터 분리된 골수의 10-12 밀리리터 알리쿼트를 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가하여 시작합니다. 용혈 완충액으로 튜브의 부피를 최대 50 밀리리터까지 가져와 실온에서 최대 7 분 동안 세포를 배양하십시오. 세포 파편을 원심분리하여 제거하고, 상류체의 마지막 2~5밀리리터를 제외한 모든 것을 흡인시합니다.튜브를 가볍게 하여 잔류 체상체 부피의 펠릿을 다시 중단하고, 골수 현탁액을 70 마이크로미터 모공 세포 여과기를 사용하여 새로운 50 밀리리터 튜브로 이송하여 혈전을 제거합니다. 신선한 용혈 버퍼를 추가하여 최대 50 밀리리터의 부피를 가져오고 원심 분리로 수집하기 전에 실온에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 모든 슈퍼나티를 흡인시키고 최대 버퍼의 10 밀리리터에서 셀을 재일시 중단합니다.또 다른 70 마이크로 미터 공공 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하기 전에, 신선한 버퍼의 40 밀리리터로 튜브를 헹구고, 셀 서스펜션으로 세척을 풀. 표준 자기 보조 세포 선별 프로토콜에 따라 CD34 양수 세포를 농축한 후, 비드 분리 된 세포를 최대 50 밀리리터의 신선한 최대 버퍼로 세척하고 HSPC 배지에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 세포의 10~20밀리리터를 환기 조직 배양된 T75 플라스크로 플레이트하여 섭씨 37도및 이산화탄소 인큐베이터5%에서 야간 배양을 치료하였다.골수의 세포 샘플의 사전 및 후 농축 순도를 평가하기 위해 모든 이벤트가 흩어져 있는 CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다능성 안에리스로 골로이드 전구체 및 림프골성 선조선자를 보여주는 적절한 플롯 및 인구 계층 구조로 유동 세포 측정 프로토콜을 생성합니다. 다음으로, 스테인드, 사전 농축, 백혈구 샘플을 실행하여 전방 및 측면 산란 파라미터의 전압을 조정하고, 모든 형광 채널다음에 는 단일 스테인드 보정 비즈를 사용하여 인접한 채널 간의 보상을 조정한다. 그런 다음 CD34 농축 효율을 문서화하기 위해 조정 및 보상 프로토콜로 나머지 얼룩이 없는 얼룩진 모든 샘플을 모두 실행합니다.모든 보상이 설정된 경우 CD34 서브세트의 정렬 정제를 위한 셀 선별기를 콜로니 형성 세포 소약으로 구성하고, 스테인드 CD34 농축 시료 튜브를 사이토미터에 적재한다. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다. 설정이 완료되면 분란, CD34 양성, 조혈 줄기 세포, 다중 효능 안성 안에리스로 골로이드 전구 및 림프골골선질 3.6 밀리리터를 포함하는 분리된 튜브로 800~1200개의 세포를 분류하는 세포를 초당 500~1000세포로 조정하는 세포를 획득한다.종류의 끝에 수집 튜브, 3 멸균 3.5 센티미터에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가, 비 조직 배양 처리 페트리 접시 는 37 섭씨에서 자신의 10-14 일 인큐베이션에 대한 세포 인구 당 개별 15 센티미터 페트리 접시 내에서 설정. 다음 날 아침 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 플라스크 바닥에서 멸균 HBSS로 부착 된 세포를 부드럽게 헹구고 원심 분리에 의해 수확 된 세포를 수집합니다. 밀리리터 농도당 6세포에 1 x 10에서 트랜스듀션 배지에서 세포를 재연한다.그리고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 12웰 플레이트를 코팅한 재조합 섬유네틴 단편의 한 웰에 모의 제어를 위한 세포의 1밀리리터를 첨가한다. 그런 다음 남은 세포의 10 밀리리터 알리쿼트를 재조합 섬유네틴 단편 코팅 T75 플라스크에 넣고 캡이 배출된 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 잠복식 동안 바이러스가 조건부 된 중간 표본을 조절하고 글리리터 당 전염되는 세포의 티터 및 감염 단위의 수에 기초하여 첨가될 바이러스의 양을 계산한다.인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크에 적절한 양의 바이러스 조절 배지를 추가하여 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 되돌려 보세요. 다음날 아침 플라스크에서 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 전달합니다. 세척당 최대 50밀리리터의 HBSS로 셀을 세척하고 잔류 바이러스를 제거하기 위해 최대 3배까지 이 단계를 반복합니다.프로스타글란딘 E2로 보충된 HSPC 미디어에서 2시간 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 세포를 세척하고 튜브 당 2 %의 자가 혈청으로 보충 된 HBSS의 10 밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 16.5 게이지 바늘을 장착 한 20 밀리리터 주사기를 사용하여 셀 서스펜션을 흡인시합니다. 신선한 HBSS플러스 2%의 자동 혈청으로 튜브 내부를 세척하고 주사기에 흡인합니다.주사기를 바늘 캡으로 조심스럽게 캡을 넣은 후 세포 용액을 얼음위에 올려놓고 자가 호스트로 주입될 때까지 조심스럽게 캡을 씌울 수 있습니다. 변환된 세포의 유전자 변형 효율을 결정하기 위해, 플레이트 1 x 10 에서 6번째 예약된 모의 또는 변형된 세포당 HSPC 배지의 밀리리터당 비조직 배양 처리 플레이트에. 둘째 날, 5일, 12일 후에 세포를 수확하고 계산합니다.2일과 5일에는 신선한 HSPC 배지에서 세포의 33%를 밀리리터 농도당 1 x 10에서 6번째로 재플레이트합니다. 2일, 5일 및 12일에는 정량적 실시간 PCR을 위한 DNA 추출 완충제에서 세포의 33%를 동결하고, 표준 프로토콜에 따라 세포의 최종 33%를 유동 세포측정에 의해 분석하여 조혈자 자손의 피형 조성물을 평가한다. 유동 세포측정에 의한 트랜스진 발현을 정량화하려면, 3개의 추가 측면 산란 대 추가한다.트랜스진 플롯;및 조혈 줄기 세포에 대한 첫 번째 플롯, 다능성 안-에리스로 골수성 전조자에 대한 두 번째 플롯, 림프골골성 전구의 세 번째 플롯, 모두 대 트랜스진. 그런 다음 2000에서 3000 개의 이벤트를 기록하고 신호 강도및 대상 인구에 맞게 정렬 게이트를 미세 조정합니다.이 프로토콜을 사용하여 농축되는 비인간 영장류 CD34 양성 HSPC의 수는 전형적으로 입력 총 백혈구 수에 비례한다. 이전 연구 결과는 총 CD34 양성 HSPC 생성물이 실제장기 및 접목 조혈 줄기 세포를 포함하는 것을 입증했기 때문에, 이러한 유동 세포측정 기반 및 식민지 형성 세포 기술은 헌신적인 선조로부터 장기간 조혈 줄기 세포를 위해 농축된 하위 세트를 안정적으로 식별하고 분화하는 데 사용될 수 있다. CD34 양성 인간 줄기 세포 농축 세포는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 효율적으로 유전자 변형될 수 있다.벡터의 비통합 된 사본을 운반하는 세포는 12 일 액체 배양 분석 기간 동안 희석되는 반면, 게놈내의 안정적으로 통합 된 벡터는 모든 자손에게 전달됩니다. 콜로니 형성 세포 에서 벡터의 발현에 의해 확인된 바와 같이. 이 전임상 방법은 유전자 치료를 위한 고품질 통제된 비인간 영장류 조혈 줄기 및 선조 세포에서 유전자 변형을 격리하는 데 사용될 수 있다.이 방법은 다른 종, 조혈 줄기 및 전구 세포, 유전자 치료 도구 및 질병에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 철저하게 심사 된 프로토콜은 수많은 인간 질병에 대한 효과적인 치료법을 모델링하는 것에 대한 큰 약속을 보여줍니다. 비인간 영장류 조직과 협력하려면 개인 보호 장비를 포함한 향상된 보안 조치가 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

연구

유전학

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...