Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Forfatterne takker Helen Crawford for å forberede dette manuskriptet, Jim Woolace for grafisk design, og Veronica Nelson og Devikha Chandrasekaran for å delta i utviklingen av protokollen. Utviklingen av denne protokollen ble støttet av tilskudd fra NIH National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (R01 AI135953 og AI138329 til H.P.K.) og National hjerte, lunge og blod Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 og U19 HL129902 til H.P.K.), samt NIH P51 OD010425, og delvis gjennom NIH/NCI Cancer Center, støtte Grant P30 CA015704. H.P.K. er en Markey molekylær medisin etterforsker og mottatt støtte som den første mottakeren av José Carreras/E. Donnall Thomas utstyrt stolen for kreftforskning og Fred Hutch utstyrt stolen for celle- og Gene Therapy.

Autologous NHP transplantasjon, grunning (mobilisering), innsamling av celler og genet modifikasjon gjennomføres konsekvent med publisert tidligere protokoller26. Alle eksperimentelle prosedyrer er vurdert og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité bestående av Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Washington (protokoll #3235 - 01). Alle studier er utført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health ("The G...

LV vektor engineering er best preget metoden gen-endre celletyper som CD34+ HSPCs, for etterfølgende transplantasjon i vivo. Protokollen beskrevet her er utformet for å maksimere antall genet modifisert HSPCs som vedvarer langsiktig i vivo, og gi kliniske fordeler til pasienter med ulike ondartet smittsomme og genetiske sykdommer. Selv om gen-redigering strategier har dukket opp det siste tiåret, LV-endret celler er best studerte i vitro, dyremodeller og pasienter,1,,<sup ...

Stilk cellen genterapi er en kraftig måte å løse et bredt spekter av menneskelig patologi. HSPC gene terapi er en spesielt attraktivt tilnærming, på grunn av i) det er relative enkelt å samle disse cellene fra pasienter, ii) vell av kunnskap som er tilgjengelig om cellen overflaten fenotyper og ex vivo kultur parametere, og feltet utvides, fordi iii) det presenterer forskere med en stadig økende verktøykasse genet modifikasjon strategier tilpasset ulike sykdommer av interesse. Vi undersøker aktivt HSPC gene terapi tilnærminger fra flere vinkler, inkludert grunnleggende vitenskapen om HSPC biologi, engraftment av genet endret HSPCs i preklinisk i vivo modeller og programmet relevante pasientgrupper. Vi og andre har preget cellen overflaten fenotypen funksjonelt forskjellige HSPC delsett1,2,3, mobilisering og condition regimer som maksimerer HSPC avkastning og engraftment samtidig toksisitet4,5og genet modifikasjon og gen-redigering strategier som har blitt skreddersydd til en rekke ondartet, genetisk og infeksjonssykdommer6,7,8, 9,10. Funksjonen og engraftment av genet endret HSPCs kan evalueres på en rekke små og store-dyr modeller, inkludert mus, hunder og NHPs. NHP modeller er spesielt fordelaktig fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer spesifikke for HSPC celle overflaten proteiner som CD34 og CD90, kan brukes om hverandre i menneskelige og NHP celler. Videre, i motsetning til mus, store dyr som NHPs gir en nærmere tilnærming av omfanget av genet modifikasjon nødvendig for klinisk effekt. Endelig NHPs er gullstandarden for modellering av menneskelige sykdommer som HIV-1 smitte11 og er en voksende modellsystem for kandidaten anticancer og anti-HIV immunotherapies12,13.
Formålet med denne protokollen er å skissere metoder for rensing, genetisk modifisere og forberede NHP HSPC infusjon produktene. Selv utenfor rammen av denne protokollen, har vi tidligere vist at disse produktene engraft i autologous NHP verter, gi opphav til alle blodkreft linjene og gir terapeutisk effekt i et bredt spekter av sykdom modeller1. Vi har også preget av clonality av engrafting HSPCs og bygget en plattform for å spore kinetikk, smugling og fenotypen av personlige HSPCs og deres avkom, følgende autolog transplantasjon1,14. Metodene presenteres her er utviklet med følgende mål: i) for å isolere svært ren HSPCs og langsiktig engrafting HSC delsett, ii) å opprettholde primitive HSCs under ex vivo kultur og iii) å effektivt gen-endre enten bulk HSPCs eller lang sikt engrafting HSC delsett. Vi bruker magnetisk-assistert celle-sortering (Mac), samt fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), å isolere svært/funksjonelt forskjellige HSPC befolkninger, samsvar med metoder for mange grupper2,15, 16. Vedlikehold av primitive HSCs i kultur (dvs. minimere differensiering av disse cellene i forpliktet progenitors som gir opphav til fullt differensiert lymfoide og myeloide delsett) er en viktig fasett av protokollen beskrevet her. Selv om vi har tidligere preget tilnærminger for å utvide HSPCs samtidig beholde en primitiv fenotypen17,18, her beskriver vi en protokoll som fokuserer på å opprettholde HSCs via en minimal (48 h) og definert ex vivo kultur.
Effektiv endring av HSPCs og HSC delsett er et sentralt mål i denne protokollen. Blant flere tilnærminger vi har rapportert, to er langt den mest undersøkte i kliniske forsøk: LV-mediert genet modifikasjon og nuclease-mediert genet redigering1,6,19. Gene-redigering strategier bruker en av en rekke nuclease plattformer spesielt endre en målrettet genet av interesse, for eksempel C-C chemokine reseptor inn 5 (CCR5) for behandling av HIV infeksjon7,19 eller Bcl11A for behandling hemoglobinopathies6. Her fokusere vi på LV-mediert genet modifikasjon, der transgene Last integrere semirandomly i genomet1,8,20. En viktig fordel med LV tilnærminger er muligheten til å levere store mengder av genetisk materiale (opp til 8 eller 9 kilobases). Selv om gen-redigering strategier utvikles for å målrette en transgene rundt å integrere bare på et bestemt locus av homologe donor rekombinasjon (HDR), krever disse metodene ytterligere utvikling in vitro og små dyr modeller. I kontrast, har LV vektorer blitt brukt mye i NHPs og pasienter21,22. Viktigere, kan protokollen beskrevet her, som bruker primet BM som starter HSPC kilde, enkelt og bredt tilpasses, for eksempel for å isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, tar vi nytte av høye grad av genetisk likhet mellom NHPs og mennesker bruke reagensene som gjelder for begge arter. Til slutt har denne tilnærmingen blitt tilpasset for å endre andre blodkreft undergrupper, nemlig T celler12,23,24; ankomsten av effektiv T-celle immunterapi tilnærminger har støttet seg tungt på LV plattformen benyttet i denne protokollen. Disse metodene er passende for noen forsker interesse HSPC biologi eller LV-mediert genet modifikasjon. For eksempel HSPC rensing protokollen presenteres her kan brukes til å karakterisere romanen HSC-beriket undergrupper, som beskrevet tidligere1,15,25. Likeledes, LV signaltransduksjon metoder presenteres her kunne likeledes anvendt og videreutviklet for mange andre celletyper og eksperimentelle spørsmål, både i vitro og in vivo modeller.
I sammendraget presenterer vi metoder for å isolere og genetisk endre NHP HSPCs. Disse metodene kan lett tilpasses for andre arter og andre HSPCs. Denne nøye utvalgte protokollen viser store løftet i modellering av effektiv terapi for mange menneskelige sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Blodkreft stilk og stamfar (HSPC)-cellen transplantasjon har vært en hjørnestein terapi for leukemi og andre kreftformer for nesten et halvt århundre, ligger under den eneste kjente kuren av humant immunsviktvirus (HIV-1), og viser enorme løftet i behandling av genetiske sykdommer som beta talassemi. Vår gruppe har utviklet en protokoll til modell HSPC genterapi i nonhuman primater (NHPs), slik at forskere til å optimalisere mange av de samme reagenser og teknikker som brukes i klinikken. Her beskriver vi metoder for rensing av CD34+ HSPCs og langsiktig vedvarende blodkreft stem cell (HSC) delsett fra primet benmargen (BM). Identiske teknikker kan anvendes for rensing av andre HSPC kilder (f.eks mobilisert perifert blod stamceller [PBSCs]). Beskrevet er en 2 dagers protokoll der celler er renset, kultivert, modifisert med lentivirus (LV) og forberedt for infusjon tilbake til autologous verten. Nøkkel readouts suksess inkluderer renheten av CD34+ HSPC befolkning, renset HSPCs evnen til å danne morphologically forskjellige koloniene i semisolid medier, og, viktigst, genet modifikasjon effektivitet. Den viktigste fordelen til HSPC genterapi er muligheten til å gi en kilde til langvarige celler som gir opphav til alle blodkreft celletyper. Som sådan, har disse metodene blitt brukt til modell behandling for kreft, genetiske sykdommer og infeksjonssykdommer. I hvert tilfelle, er terapeutiske effekten etablert av forbedrer funksjonen av forskjellige HSPC avkom, inkludert røde blodlegemer, T-celler, B celler eller myelogen delsett. Metodene for å isolere, endre og forberede HSPC produkter er direkte relevant og oversettbare til flere sykdommer i menneskelige pasienter.

Protokollen beskrevet ovenfor er utformet til å isolere og gen-endre NHP CD34+ HSPCs, som senere skal infunderes inn autologous verten (figur 1 og figur 2). Når du følger denne protokollen, vi få vanligvis opptil 8 x 109 totalt WBCs fra primet BM fra pigtail aper og noen ganger dobbel beløpet fra rhesus aper. I begge arter, antall CD34+ HSPCs som vi berike er proporsjonal med input av det tot...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Målet med denne protokollen er å isolere nonhuman primas CD34+ celler fra primet benmargen, gen-endre disse cellene med lentiviral vektorer, og å forberede et produkt infusjon i autologous verten. Totalt er ca 48 timer.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

For å evaluere effektiviteten og sikkerheten til lovende og nye genterapitilnærminger, er den omfattende testingen av genmodifiserte celler i validerte prekliniske in vivo-modeller avgjørende. Bevaring av relevante celleoverflatemarkørers kryssreaktivitet av reagenser, og evne til å anvende de samme støttende behandlingene som administreres til pasienter langs ikke-menneskelige primatmodeller for å etterligne kliniske parametere nøye. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Anai Perez, en forskningstekniker fra Dr.Hans-Peter Kiems laboratorium.Begynn med å legge til 10 til 12 milliliter aliquots av benmarg isolert fra en sunn ikke-menneskelig primat donor i 50 milliliter koniske rør. Ta volumet av røret opp til 50 milliliter med hemolytisk buffer, og inkuber cellene i opptil syv minutter ved romtemperatur. Fjern celleavfallet ved sentrifugering, og aspirer alle unntatt de siste to til fem milliliter av det overnaturante.Gjenbruk pelleten i det gjenværende overnaturlige volumet ved å knipse røret, og overfør benmargssuspensjonene til et nytt 50 milliliter rør ved hjelp av en 70 mikrometer porecellesil for å fjerne blodpropper. Tilsett fersk hemolytisk buffer for å bringe volumet opp til 50 milliliter, og inkuber cellene i ytterligere fem minutter ved romtemperatur før deres samling ved sentrifugering. Aspirer alle de overnaturante og gjenoppusse cellene i 10 milliliter maks buffer.Før du filtrerer cellesuspensjonen gjennom en annen 70 mikrometer pore sil, skyll røret med 40 milliliter frisk buffer, og pool vasken med celle suspensjon. Etter berikelse for CD34 positive celler i henhold til standard magnetisk assistert celle sortering protokoller, vaske perle isolerte celler i opptil 50 milliliter av frisk maks buffer, og resuspend pellet i HSPC medium. Deretter plate 10 til 20 milliliter av cellene i ventilert vev kultivert behandlet T75 flasker for deres overnatting kultur i en 37 grader celsius og 5% karbondioksid inkubator.For å vurdere pre og post berikelse renhet av benmargens celleprøver skape en strømning cytometri protokoll med de riktige tomter og befolkningshierarki som viser alle portene for alle hendelser scatter, CD34 positive, hematopoetiske stamceller, multipotente an-erythro myeloid stamfar og lymfo myeloid stamfar. Deretter kjører du en uopphetet, pre-berikelse, hvite blodlegemer prøve for å justere spenningene for forover og side scatter parametere, og alle fluorescens kanaler etterfulgt av enkelt farget kompensasjon perler for å justere kompensasjon mellom tilstøtende kanaler. Kjør deretter alle de gjenværende uopphetede og beisede prøvene med den justerte og kompenserte protokollen for å dokumentere CD34-berikelseseffektiviteten.Når alle kompensasjonene er satt konfigurere cellesorteringen for sorteringsrensing av CD34-undersettene i kolonien danner celleanalyser, og laste den beisede CD34 beriket prøverør på cytometeret. Deretter registrerer du 2000 til 3000 hendelser, og finjuster sorteringsportene for å passe signalstyrken og målgruppene. Når oppsettet er fullført, får cellene justere strømningshastigheten til 500 til 1000 celler per sekund, og sortering av 800 til 1200 celler fra scatter, CD34 positiv, hematopoetisk stamcelle, multipotent an-erythro myeloid stamfar og lymfo myeloid stamceller i separate rør som inneholder 3,6 milliliter koloni danner celle medium per rør.På slutten av sorten vortex samlingen rørene, og legge til en milliliter celle suspensjon til tre sterile 3,5 centimeter, ikke-vev kultur behandlet petri retter satt innenfor individuelle 15 centimeter petriretter per cellepopulasjon for deres 10-14 dagers inkubasjon ved 37 grader celsius. Neste morgen bruker du en 10 milliliter pipette til å skylle de tilknytte tilhengercellene forsiktig fra bunnen av hver kolbe med steril HBSS, og samle de høstede cellene ved sentrifugering. Resuspend cellene i transduksjon medium på en 1 x 10 til sjette celler per milliliter konsentrasjon.Og legg til en milliliter celler for mock kontroll i en brønn av en rekombinant fibronectin fragment belagt 12 brønnplate for en overnatting inkubasjon i cellekulturinkubatoren. Deretter legger du til 10 milliliter aliquots av de gjenværende cellene i rekombinant fibronectin fragmentbelagte T75 flasker for en 30 minutters inkubasjon i cellekulturinkubatoren med caps ventilert. Under inkubasjonen tine virus betinget medium prøver og beregne mengden av virus som skal legges til basert på titer og antall smittsomme enheter av celler per milliliter.Ta kolben ut av inkubatoren og tilsett riktig volum av viruskonsterte medium til hver kolbe før du returnerer cellene til 37 grader celsius og 5% karbondioksid. Neste morgen overfører cellene fra kolben til individuelle 50 milliliter koniske rør. Vask cellene i opptil 50 milliliter HBSS per vask, og gjenta dette trinnet opptil tre ganger for å fjerne gjenværende virus.Inkuber cellene i to timer i HSPC-medier supplert med prostaglandin E2. Vask deretter cellene og resuspend cellene i 10 milliliter HBSS supplert med 2% autolog serum per rør. Aspirer deretter cellesuspensjonene ved hjelp av en 20 milliliter sprøyte utstyrt med en 16,5 gauge nål. Vask innsiden av røret med frisk HBSS pluss 2% autolog serum, og aspirer inn i sprøyten.Hemp sprøyten forsiktig med nålehetten før du plasserer celleoppløsningen på is til infusjonen i en autolog vert. For å bestemme genmodifiseringseffektiviteten til de transduserte cellene, plate 1 x 10 til 6th reservert mock eller transdusert celler per milliliter HSPC medium på ikke-vev kultur behandlet plater. På dag to, fem og tolv etter transduksjon, høst og telle cellene.På dag to og fem, omplate 33% av cellene i frisk HSPC medium på en 1 x 10 til 6th per milliliter konsentrasjon. På dag to, fem og tolv, fryse 33% av cellene i DNA ekstraksjon buffer for kvantitativ sanntid PCR, og analysere de endelige 33% av cellene ved flyt cytometri i henhold til standard protokoller for å vurdere fenotypisk sammensetning av hematopoetisk avkom. Hvis du vil kvantifisere transgeneuttrykket ved å flyte cytometri, legger du til tre ekstra sidespry vs.transgene tomter;og gate den første tomten på hematopoietiske stamceller, den andre tomten på multipotent an-erythro myeloid stamfar, og den tredje tomten på lymfof myeloid stamfar, alle vs. transgene. Deretter registrerer du 2000 til 3000 hendelser og finjusterer sorteringsportene for å passe signalstyrken og målgruppene.Ved hjelp av denne protokollen er antall ikke-menneskelige primat CD34 positive HSPC-er som er beriket, vanligvis proporsjonal med inngangen totalt antall hvite blodlegemer. Som tidligere funn har vist at det totale CD34-positive HSPC-produktet inkluderer celler som ikke er sanne langsiktige og pode hematopoetiske stamceller, kan disse strømningscytometribaserte og kolonidannende celleteknikker brukes til å identifisere og differensiere undergrupper beriket for langsiktige hematopoetiske stamceller fra engasjerte stamceller. CD34 positive menneskelige stamcelleberikede celler kan effektivt genmodifisert ved hjelp av lentiviralvektorer.Celler som bærer en ikke-integrert kopi av vektoren fortynnes over 12 dagers flytende kulturanalyseperiode, mens stabilt integrerte vektorer i genomet blir overført til alt avkom. Som bekreftet av uttrykket av vektoren i koloni danner celleanalyser. Denne prekliniske metoden kan brukes til å isolere genmodifisert i kvalitetskontrollerte ikke-menneskelige primat hematopoetiske stamceller for genterapi.Denne metoden kan enkelt tilpasses andre arter, kilder til hematopoetisk stamme og stamceller, genterapiverktøy og sykdommer. Denne grundig undersøkte protokollen viser stort løfte for modellering av effektive terapier for mange menneskelige sykdommer. Husk at arbeid med ikke-menneskelig primat vev krever forbedrede sikkerhetstiltak inkludert personlig verneutstyr.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Eksempel forberedelse og analyse av RNASeq-baserte genuttrykk Data fra sebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produksjon og rensing av Baculovirus for genterapi program

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En rask og kvantitativ metode for post-translasjonell modifikasjon og Variant aktivert tilordning av peptider å genomer

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinasjon encellede tilnærming som karakteriserer den molekylære og Immunophenotypic heterogenitet menneskelige stammen og stamfar bestander

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...