Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Os autores graças Helen Crawford na preparação deste manuscrito, Jim Woolace de design gráfico e Veronica Nelson e Devikha Chandrasekaran para participar no desenvolvimento do protocolo. O desenvolvimento do presente protocolo foi apoiado por concessões do NIH Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (R01 AI135953 e AI138329 para H.P.K.) e nacional de coração, pulmão e Instituto de sangue (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 e sub-19 HL129902 para H.P.K.), bem como NIH P51 OD010425 e, em parte através do centro de câncer NIH/ICN, suporte Grant P30 CA015704. H.P.K. é um investigador de Medicina Molecular Markey e recebeu apoio como o destinatário inaugural de José Carreras/E. Donnall Thomas dotado cadeira para pesquisa do câncer e o Fred Hutch dotado cadeira para celular e Gene Therapy.

Transplantes autólogos de PNC, escorva (mobilização), a coleção de células e modificação genética são conduzidas consistente com protocolos previamente publicado26. Todos os procedimentos experimentais são revistos e aprovados pelo Comitê de uso do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson e a Universidade de Washington e institucional Cuidado Animal (protocolo #3235 - 01). Todos os estudos são realizados em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o u...

Vetor de LV engenharia é o método mais bem caracterizado para gene-modificar tipos de célula como CD34 + HSPCs, para posterior transplante em vivo. O protocolo descrito aqui é projetado para maximizar o número de HSPCs gene modificado que persistem a longo prazo na vivo e fornecem benefícios clínicos aos pacientes com várias doenças malignas, infecciosas e genéticas. Embora o gene-edição estratégias surgiram na última década, LV-modificado células são os melhores estudadas in vitro, em modelos...

Terapia gênica de células-tronco é um meio poderoso para abordar um vasto leque de patologias humanas. Terapia de gene HSPC é uma abordagem particularmente atraente, devido à i) a relativa facilidade de coletar essas células dos pacientes, ii) a riqueza de conhecimentos disponíveis sobre fenótipos de superfície celular e ex vivo parâmetros de cultura, e, como o campo se expande, Porque iii) apresenta cientistas com uma caixa de ferramentas cada vez maior de estratégias de modificação do gene adaptados às várias doenças de interesse. Estamos investigando ativamente HSPC abordagens de terapia de gene de vários ângulos, incluindo a ciência básica da HSPC biologia, a enxertia de HSPCs gene-modificado em modelos in vivo pré-clínicos e a aplicação de populações de pacientes relevantes. Nós e os outros têm caracterizado o fenótipo de superfície celular de funcionalmente distintos HSPC subconjuntos1,2,3, a mobilização e regimes de condicionamento que maximizar o rendimento HSPC e enxertia, minimizando toxicidade de4,5e o gene modificação e edição de gene estratégias que têm sido adaptadas para uma ampla gama de maligno, genética e doenças infecciosas6,7,8, 9,10. A função e a enxertia de HSPCs gene modificado podem ser avaliados em um número de modelos de pequeno e grande-animal, incluindo ratos, cães e NHPs. Em particular, modelos de PNC são vantajosos porque muitos reagentes, por exemplo, os anticorpos específicos para as proteínas superfície celular HSPC como CD34 e CD90, podem ser usados permutavelmente em humanos e células do PNC. Além disso, em contraste com os ratos, animais de grandes porte como NHPs permitem uma maior aproximação da escala da modificação genética necessária para a eficácia clínica. Finalmente, NHPs são o padrão ouro para a modelagem de patologias humanas tais como a infecção de HIV-111 e um sistema de modelo emergente para candidato anticâncer e anti-HIV imunoterapias12,13.
O propósito do presente protocolo é delinear os métodos de purificação, modificação genética, e a preparação de produtos de infusão NHP HSPC. Embora fora do âmbito do presente protocolo, anteriormente mostramos que esses produtos engraft em hospedeiros de PNC autólogos, dão origem a todas as linhagens hematopoiéticas e fornecem eficácia terapêutica em uma ampla gama de modelos de doença1. Temos também caracterizada a clonality de HSPCs engrafting e construiu uma plataforma para rastrear a cinética, o tráfico e o fenótipo dos HSPCs individuais e seus descendentes, seguir transplante autólogo1,14. Os métodos aqui apresentados foram desenvolvidos com os seguintes objetivos: i) para isolar HSPCs altamente puros e subconjuntos HSC engrafting a longo prazo, ii) para manter o primitivos linfócitos durante ex vivo de cultura e iii) eficientemente gene-modificar qualquer granel HSPCs ou a longo prazo engrafting HSC subconjuntos. Nós empregamos magnética assistida por célula-classificação (MACS), bem como fluorescência-ativado da pilha (FACS), para isolar fenotipicamente/funcionalmente HSPC populações distintas, consistentes com os métodos de muitos grupos2,15, de classificação 16. A manutenção da primitivas linfócitos em cultura (ou seja, minimizando a diferenciação dessas células em progenitores comprometidos que dão origem a totalmente diferenciadas subconjuntos mieloides e linfoides) é um aspecto essencial do protocolo descrito aqui. Embora nós anteriormente caracterizaram abordagens para expandir HSPCs mantendo um fenótipo primitivo17,18, aqui, descrevemos um protocolo que centra-se na manutenção de linfócitos através de uma mínima (48 h) e definido ex vivo cultura.
A modificação eficiente de HSPCs e HSC subconjuntos é um objetivo central do presente protocolo. Entre várias abordagens temos relatado, dois são de longe os mais investigados em ensaios clínicos: modificação genética de LV-mediada e mediada por nuclease gene edição1,6,19. Gene-edição estratégias usam um de um número de plataformas de nuclease para modificar especificamente um gene alvo de interesse, por exemplo, o receptor do chemokine C-C tipo 5 (CCR5) para o tratamento da infecção de HIV7,19 ou Bcl11A para o tratamento de Hemoglobinopatias6. Aqui, focalizamos a modificação genética de LV-mediado, no qual cargas transgênicas semirandomly integrarem o genoma1,8,20. A principal vantagem da LV abordagens é a capacidade de entregar grandes quantidades de material genético (até 8 ou 9 kilobases). Embora o gene-edição estratégias estão sendo desenvolvidas para direcionar um transgene de interesse para integrar somente em um locus especificado por recombinação homóloga doador (HDR), esses métodos exigem mais desenvolvimento in vitro e em modelos animais pequenos. Em contraste, vetores de LV têm sido amplamente utilizados em NHPs e em pacientes21,22. Importante, o protocolo descrito aqui, que usa aprontado BM como uma fonte HSPC a partida, pode ser facilmente e amplamente adaptado, por exemplo, para isolar o PBSCs. Conforme descrito acima, podemos aproveitar o alto grau de similaridade genética entre NHPs e os seres humanos usar reagentes que são aplicáveis a ambas as espécies. Finalmente, esta abordagem tem sido adaptada para modificar outros subconjuntos hematopoiéticos, nomeadamente T células12,23,24; o advento das abordagens de imunoterapia eficazes células T tem dependia fortemente a mesma plataforma de LV utilizada neste protocolo. Esses métodos são adequados para qualquer pesquisador interessado em biologia HSPC ou modificação genética mediada por LV. Por exemplo, o protocolo de purificação HSPC apresentado aqui pode ser usado para caracterizar o romance subconjuntos HSC-enriquecido, conforme descrito anteriormente,1,15,25. Da mesma forma, a transdução de LV métodos apresentados aqui da mesma forma poderiam ser aplicada e desenvolvida para vários outros tipos de células e perguntas experimentais, tanto em modelos in vitro e in vivo.
Em resumo, apresentamos métodos para isolar e modificar geneticamente NHP HSPCs. Esses métodos podem ser facilmente adaptados para outras espécies e outras fontes de HSPCs. Este protocolo exaustivamente investigado mostra uma grande promessa na modelagem de terapias eficazes para várias doenças humanas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Transplante de células (HSPC) de haste e progenitoras hematopoiético tem sido uma terapia de pedra angular para a leucemia e outros tipos de câncer há quase meio século, subjaz a única cura conhecida de infecção de vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) e mostra a imensa promessa em o tratamento de doenças genéticas, tais como talassemia beta. O nosso grupo desenvolveu um protocolo para a terapia de gene HSPC modelo em primatas não-humanos (NHPs), permitindo que os cientistas otimizar muitos dos mesmos reagentes e técnicas que são aplicadas na clínica. Aqui, descrevemos os métodos para a purificação CD34+ HSPCs e subconjuntos de células-tronco hematopoiéticas (HSC) persistentes a longo prazo da medula óssea aprontada (BM). Técnicas idênticas podem ser empregadas para a purificação de outras fontes HSPC (por exemplo, sangue periférico mobilizado células-tronco [PBSCs]). Descrito, é um protocolo de 2 dia em que células são purificadas, culta, modificadas com lentivirus (LV) e preparadas para infusão de volta para o host autólogo. Leituras chaves de sucesso incluem a pureza do CD34+ HSPC da população, a capacidade de HSPCs purificados para formar colônias morfologicamente distintas na mídia semi-sólido e, mais importante, eficiência de modificação genética. A principal vantagem para a terapia de gene HSPC é a capacidade de fornecer uma fonte de vida longa células que dão origem a todos os tipos de células hematopoiéticas. Como tal, esses métodos têm sido usados para terapias de modelo para câncer, doenças genéticas e doenças infecciosas. Em cada caso, eficácia terapêutica é estabelecida, aumentando a função de progênie HSPC distintas, incluindo células vermelhas do sangue, as células T, células B, e/ou subconjuntos mieloides. Os métodos de isolar, modificar e preparar HSPC produtos são directamente aplicáveis e traduzíveis para várias doenças em pacientes humanos.

O protocolo descrito acima é projetado para isolar e gene-modificar NHP CD34+ HSPCs, que posteriormente pode ser infundido volta para o host autólogo (Figura 1 e Figura 2). Quando este protocolo a seguir, nós geralmente obter até 8 x 109 glóbulos brancos totais do BM purgado de macacos de pigtail e, às vezes, o dobro desse montante de macacos rhesus. Em ambas as espécies, o número de CD34+...

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Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Para avaliar a eficiência e a segurança de abordagens promissoras e novas de terapia genética, o teste abrangente de células modificadas por genes em modelos in vivo pré-clínicos validados é crucial. A conservação da reatividade cruzada dos marcadores de superfície celular relevantes dos reagentes e a capacidade de aplicar os mesmos tratamentos de suporte administrados aos pacientes ao longo de modelos de primatas não humanos para imitar de perto parâmetros clínicos. Demonstrando o procedimento comigo estará Anai Perez, um técnico de pesquisa do laboratório do Dr. Hans-Peter Kiem.Comece adicionando alíquotas de 10 a 12 mililitros de medula óssea isoladas de um saudável doador de primatas não humanos em tubos cônicos de 50 mililitros. Leve o volume do tubo até 50 mililitros com tampão hemollítico e incuba as células por até sete minutos em temperatura ambiente. Remova os detritos celulares por centrifugação, e aspire todos, exceto os últimos dois a cinco mililitros do supernatante.Resuspenque a pelota no volume de supernacante residual movendo o tubo, e transfira as suspensões da medula óssea para um novo tubo de 50 mililitros usando um coador de células porosas de 70 micrômetros para remover quaisquer coágulos sanguíneos. Adicione um tampão hemollítico fresco para trazer o volume até 50 mililitros, e incubar as células por mais cinco minutos à temperatura ambiente antes de sua coleta por centrifugação. Aspire todos os supernascentes e resuspense as células em 10 mililitros de tampão máximo.Antes de filtrar a suspensão da célula através de outro filtro de poros de 70 micrômetros, enxágue o tubo com 40 mililitros de tampão fresco e acumule a lavagem com a suspensão da célula. Depois de enriquecer para células positivas CD34 de acordo com protocolos padrão de classificação celular assistido magnético, lave as células isoladas de contas em até 50 mililitros de tampão máximo fresco, e resuspenda a pelota no meio HSPC. Em seguida, a placa de 10 a 20 mililitros das células em tecido ventilado cultivados tratados frascos T75 para sua cultura durante a noite em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.Para avaliar a pureza pré e pós-enriquecimento das amostras celulares da medula óssea criam um protocolo de citometria de fluxo com as parcelas apropriadas e a hierarquia populacional mostrando todos os portões para todos os eventos dispersos, células-tronco bamopoiéticas, progenitoras multipotentes an-eritróidas e progenitores mieloides linfo. Em seguida, execute uma amostra de células brancas não manchadas, pré-enriquecimento para ajustar as tensões para os parâmetros de dispersão dianteira e lateral, e todos os canais de fluorescência seguidos de contas de compensação manchada única para ajustar a compensação entre os canais adjacentes. Em seguida, execute todas as amostras restantes não manchadas e manchadas com o protocolo ajustado e compensado para documentar a eficiência de enriquecimento do CD34.Quando todas as compensações tiverem sido definidas, configure o classificador de células para a purificação do tipo de subconjuntos CD34 em ensaios celulares formadores de colônias, e carregue o tubo de amostra enriquecido CD34 manchado no cítmetro. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos, e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações. Quando a configuração estiver completa, a aquisição das células ajustando a taxa de fluxo para 500 a 1000 células por segundo, e classificação de 800 a 1200 células da dispersão, célula-tronco baterótica, hematopoiética, progenitora multipotente an-eritróida e progenitor mieloide linfo em tubos separados contendo 3,6 mililitros de colônia formando meio celular por tubo.No final do tipo vórtice os tubos de coleta, e adicionar um mililitro de suspensão celular a três estéreis 3,5 centímetros, cultura não-tecido tratada placas de petri definidas dentro de placas de petri individuais de 15 centímetros por população celular para sua incubação de 10-14 dias a 37 graus celsius. Na manhã seguinte, use uma pipeta de 10 mililitros para enxaguar suavemente as células aderentes do fundo de cada frasco com HBSS estéril, e coletar as células colhidas por centrifugação. Resuspend as células em meio de transdução em uma 1 x 10 para a 6ª células por concentração mililitro.E adicione um mililitro de células para o controle simulado em um poço de um fragmento de fibronectina recombinante revestido 12 placas de poço para uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular. Em seguida, adicione 10 alíquotas mililitros das células restantes em fragmento de fibronectina recombinante revestido frascos T75 para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura celular com as tampas ventiladas. Durante a incubação, o vírus condigentou amostras médias e calculou a quantidade de vírus a ser adicionada com base no título e no número de unidades infecciosas de células por mililitro.Tire o frasco da incubadora e adicione o volume adequado de vírus condicionado a cada frasco antes de devolver as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, transfira as células do frasco para tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Lave as células em até 50 mililitros de HBSS por lavagem, e repita este passo até três vezes para remover o vírus residual.Incubar as células por duas horas em mídia HSPC complementada com prostaglandina E2. Em seguida, lave as células e resuspenja as células em 10 mililitros de HBSS suplementados com soro 2% autólogo por tubo. Em seguida, aspire as suspensões celulares usando uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha calibre 16,5. Lave o interior do tubo com HBSS fresco mais soro 2% autólogo e aspire na seringa.Corte cuidadosamente a seringa com a tampa da agulha antes de colocar a solução celular no gelo até sua infusão em um hospedeiro autólogo. Para determinar a eficiência de modificação genética das células transduzidas, a placa 1 x 10 até a 6ª células simuladas ou transduzidas reservadas por mililitro de meio HSPC em placas tratadas de cultura não-tecidual. Nos dias dois, cinco e doze pós-transdução, colher e contar as células.Nos dias dois e cinco, repata 33% das células em meio HSPC fresco em uma concentração de 1 x 10 para o 6º por mililitro. Nos dias dois, cinco e doze, congele 33% das células no tampão de extração de DNA para PCR quantitativo em tempo real, e analise os 33% finais das células por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão para avaliar a composição fenotípica da prole hematopoiética. Para quantificar a expressão transgênica por citometria de fluxo, adicione três dispersão lateral adicional vs.transgene plots;and gate the first plot on the hematopoietic stem cells, the second plot on the multipotent an-erythro myeloid progenitors, e o terceiro enredo sobre os progenitores mieloides linfo, todos vs. o transgene. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações.Usando este protocolo, o número de HSPC positivos de primatas não humanos que são enriquecidos é tipicamente proporcional à contagem total de glóbulos brancos de entrada. Como os achados anteriores demonstraram que o produto HSPC positivo cd34 total inclui células que não são verdadeiras a longo prazo e enxertam células-tronco hematopoiéticas, essas técnicas de células baseadas em citometria de fluxo e colônia podem ser usadas para identificar e diferenciar subconjuntos enriquecidos para células-tronco hematopoiéticas de longo prazo de progenitores comprometidos. Células-tronco humanas positivas CD34 podem ser eficientemente modificadas por genes usando vetores lentivirais.As células que carregam uma cópia não integrada do diluir vetorial durante o período de ensaio de cultura líquida de 12 dias, enquanto vetores integrados no genoma são passados para toda a descendência. Como confirmado pela expressão do vetor na colônia formando ensaios celulares. Este método pré-clínico pode ser usado para isolar geneticamente modificado em células hematopoiéticas de primatas não-humanas controladas de qualidade e células progenitoras para terapia genética.Este método pode ser facilmente adaptado para outras espécies, fontes de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, ferramentas de terapia genética e doenças. Este protocolo completamente controlado mostra grande promessa para a modelagem de terapias eficazes para inúmeras doenças humanas. Tenha em mente que trabalhar com tecidos primatas não humanos requer medidas de segurança aprimoradas, incluindo equipamentos de proteção individual.

Research

JoVE Journal

Genetics

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The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Genética

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Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

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Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Um método rápido e quantitativo para a modificação pós-traducional e variante habilitado para mapeamento de peptídeos de genomas

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...