Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Авторы благодарят Хелен Crawford за подготовку этой рукописи, Джим Woolace для графического дизайна и Вероника Нельсон и Devikha Chandrasekaran для участия в разработке протокола. В разработке этого протокола был поддержан грантов из низ национального института аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI135953 и AI138329 к H.P.K.) и Национальный сердца, легких и крови института (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 и U19 HL129902 к H.P.K.), а также NIH P51 OD010425 и частично через низ/NCI онкологический центр, поддержка Грант Р30 CA015704. H.P.K. является Markey молекулярной медицины следователь и получил поддержку как первого получателя Хосе Каррерас/э. Donnall Томас наделила Председателя для исследований рака и Председатель наделен Фред загон для клеток и генной терапии.

Аутологичной трансплантации NHP, грунтовка (мобилизации), коллекции клеток и генной модификации, проводятся в соответствии с ранее опубликованные протоколы26. Все экспериментальные процедуры рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использования ?...

LV вектор Инжиниринг является метод наиболее характерны для гена изменить типы клеток, таких как CD34+ HSPCs, для последующей трансплантации в естественных условиях. Протокол, описанные здесь призван увеличить количество генно модифицированных HSPCs, которые сохраняются долгосрочные в ...

Генная терапия стволовой клетки является мощным средством для решения широкого круга человеческих патологий. HSPC генная терапия является особенно привлекательным подход, благодаря i) относительная простота сбора эти клетки от больных, ii богатство знаний, которая доступна относительно клеток поверхности фенотипы и ex vivo культуры параметры и, как и поле расширяется, потому что iii) он представляет ученых с возрастающей toolbox генной модификации стратегий с учетом различных заболеваний, представляющих интерес. Мы активно изучаем HSPC генной терапии подходы с нескольких точек зрения, включая основные науки HSPC биологии, приживления генно модифицированных HSPCs в доклинических моделях в естественных условиях, и применение соответствующих групп пациентов. Мы и другие характеризовали поверхности фенотипа клетки функционально различных HSPC подмножеств1,2,3, мобилизации и принадлежности схем, которые максимально HSPC урожайности и приживления при минимизации токсичности4,5и генной модификации и Джин редактирования стратегии, которые были адаптированы к широкий спектр злокачественных, генетических и инфекционных заболеваний6,,78, 9,10. Функция и приживления генно модифицированных HSPCs может быть оценен в ряд малых и крупных животных моделей, включая мыши, собаки и Евросоюзе. В частности NHP модели выгодно, потому что многие реагентов, например, антител специфических для HSPC клеток поверхности белки как CD34 и CD90, могут использоваться попеременно в человека и NHP клетки. Кроме того в отличие от мышей, крупных животных, таких как Евросоюзе позволяют приближением шкалы генной модификации необходимые для клинической эффективности. Наконец Евросоюзе являются золотым стандартом для моделирования человеческих патологий, таких как ВИЧ-1 инфекции11 и формирующейся модели системы для кандидата противоопухолевой и анти-ВИЧ immunotherapies12,13.
Целью настоящего Протокола является наметить методы для очистки, генетического изменения и подготовку NHP HSPC инфузии. Хотя в сферу применения настоящего Протокола, мы ранее показали, что эти продукты привито в аутологичной NHP хостов, порождают все гемопоэтических линии и предоставлять терапевтическую эффективность в широкий спектр болезней модели1. Мы также характеризуется clonality голокоренные HSPCs и построил платформу для отслеживания кинетики, торговлей и фенотип отдельных HSPCs и их потомства, следующие аутологичной трансплантации1,14. Представленные здесь методы были разработаны с целью: i) чтобы изолировать высоки чисто HSPCs и долгосрочный голокоренные HSC подмножеств, ii) для поддержания примитивных СКК во время ex vivo культуры и iii) эффективно ген изменить либо массовая HSPCs или долгосрочный отлаживание HSC подмножеств. Мы используем магнитные помощь сортировки клеток (ПДК), а также активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS), чтобы изолировать фенотипически/функционально различных HSPC населения, в соответствии с методами многих групп2,15, 16. Поддержание примитивных СКК в культуре (то есть, минимизации дифференцировка этих клеток в совершено прародителей, которые порождают полностью дифференцированной лимфоидных и миелоидного подмножеств) является важным аспектом протокола, описанных здесь. Хотя мы ранее характеризовались подходы к расширению HSPCs при сохранении примитивных фенотип17,18, здесь, мы описываем протокол, который фокусируется на поддержание СКК через минимальный (48 ч) и определены ex vivo культуры.
Эффективное модификации HSPCs и HSC подмножества является главной целью настоящего Протокола. Среди нескольких подходов, мы уже сообщали, два являются на сегодняшний день наиболее исследованных в клинических испытаниях: LV-опосредованной генной модификации и нуклеиназы опосредованной гена редактирования1,6,19. Джин редактирования стратегии использовать один из ряда нуклеиназы платформ для специально изменения целевого гена интереса, например, C-C хемокиновых рецепторов типа 5 (CCR5) для лечения ВИЧ инфекции7,19 или Bcl11A для лечения hemoglobinopathies6. Здесь мы сосредоточены на LV-опосредованной генной модификации, в котором трансгенных грузов интегрировать semirandomly в геном1,8,20. Ключевым преимуществом LV подходов является возможность доставить большое количество генетического материала (до 8 или 9 kilobases). Хотя Джин редактирования стратегии разрабатываются Целевой трансген, представляющие интерес для интеграции только в указанном локусе гомологичных доноров рекомбинации (HDR), эти методы требуют дальнейшего развития в пробирке и в небольших животных моделях. В отличие от LV векторов широко использовались в Евросоюзе и пациентов21,22. Важно отметить, что протокол, описанных здесь, который использует загрунтовать BM как отправной HSPC источника, может быть легко и широко адаптирована, например, изолировать PBSCs. Как описано выше, мы воспользоваться высокой степени генетического сходства между Евросоюзе и людей использовать реагенты, которые применимы для обоих видов. Наконец этот подход был адаптирован для изменения других гемопоэтических подгруппы, а именно T клетки12,,2324; с появлением эффективных подходов Т-клеточной иммунотерапии полагались на той же платформе LV, используемые в настоящем Протоколе. Эти методы являются подходящими для любой исследователь заинтересован в биологии HSPC или LV-опосредованной генной модификации. Например, протокол очистки HSPC, представленные здесь могут использоваться для характеристики Роман HSC-обогащенный подмножеств, как описано ранее в1,15,25. Аналогичным образом LV трансдукции, что представленные здесь методы могут также применяться и дальнейшее развитие для многих других типов клеток и экспериментальных вопросов, как в модели в vitro и in vivo.
Таким образом мы представляем методы изолировать и генетически модифицировать NHP HSPCs. Эти методы могут быть легко адаптированы для других видов и других источников HSPCs. Этот тщательно исследованные протокол показывает большие надежды в моделировании эффективной терапии для многочисленных заболеваний человека.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Трансплантация гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) был краеугольным камнем терапия лейкемии и других раковых заболеваний для почти половины столетия, лежит в основе только известного лечения заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и показывает огромные перспективы в лечение генетических заболеваний, таких как бета-талассемия. Наша группа разработала протокол к модели HSPC генной терапии в нечеловеческих приматов (Евросоюзе), позволяя ученых оптимизировать многие из те же реагенты и методы, которые применяются в клинике. Здесь мы описываем методы для очистки CD34+ HSPCs и долгосрочные сохранение подмножества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) загрунтовать костного мозга (БМ). Идентичные методы могут быть использованы для очистки других HSPC источников (например, мобилизованных периферической крови стволовые клетки [PBSCs]). Приводится 2 день протокол, в котором клетки очищенный, культивированный, изменение с человека (LV) и подготовил для инфузии обратно в аутологичной принимающей. Ключевые индикацию успеха включают в себя чистоту CD34+ HSPC населения, очищенный HSPCs способность образовывать морфологически различные колонии в полутвердых средств массовой информации и, самое главное, эффективности генной модификации. Ключевым преимуществом HSPC генной терапии является способность предоставлять источник долгоживущих клеток, которые порождают все типы гемопоэтических клеток. Таким образом эти методы использовались для модели лечения для рака, генетических заболеваний и инфекционных заболеваний. В каждом случае Терапевтическая эффективность устанавливается путем усиления функции различных HSPC потомства, включая красные кровяные клетки, Т-клетки, клетки B или миелоидной подмножеств. Методы для изоляции, изменять и подготовить HSPC продукты непосредственно применимыми и переводимых для множественных заболеваний человека больных.

Описанные выше протокол предназначен для изоляции и Джин изменить NHP CD34+ HSPCs, которые впоследствии могут быть проникнуты обратно в аутологичной узла (рис. 1 и рис. 2). Когда после этого протокола, мы обычно получить до 8 х 109 всего...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Подготовка и генной модификации нечеловеческих приматов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток

Цель настоящего Протокола заключается в изоляции нечеловеческие приматов CD34+ клеток от загрунтовать костного мозга, ген изменить эти клетки с лентивирусные векторы и подготовить продукт для вливания в аутологичной хозяина. Длина общего протокола составляет около 48 часов.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Для оценки эффективности и безопасности перспективных и новых подходов к генной терапии решающее значение имеет комплексное тестирование генно-модифицированных клеток в проверенных доклинтических моделях in vivo. Сохранение соответствующих маркеров поверхности клеток 'перекрестной реактивности реагентов, и способность применять те же вспомогательные методы лечения, вводимые пациентам вдоль нечеловеческих моделей приматов, чтобы тесно имитировать клинические параметры. Демонстрацией процедуры со мной будет Антай Перес, научный сотрудник лаборатории доктора Ханса-Петера Кима.Начните с добавления от 10 до 12 миллилитров алицитов костного мозга, изолированных от здорового нечеловеческого донора приматов, в 50 миллилитров конических трубок. Довнесите объем трубки до 50 миллилитров с гемолитическим буфером и инкубировать клетки на срок до семи минут при комнатной температуре. Удалите клеточный мусор путем центрифугации, и аспирировать все, кроме последних двух-пяти миллилитров супернатанта.Resuspend гранулы в остаточном сверхнатантного объема, стряхивая трубку, и передачи подвесок костного мозга в новую 50 миллилитровую трубку с помощью 70 микрометров поры клетки ситечко для удаления тромбов. Добавьте свежий гемолитический буфер, чтобы довести объем до 50 миллилитров, и инкубировать клетки в течение еще пяти минут при комнатной температуре перед их сбором центрифугации. Аспирировать все супернатанты и повторно помыть клетки в 10 миллилитров максимального буфера.Перед фильтрацией клеточной подвески через еще 70 микрометровый поры ситечко, промыть трубку с 40 миллилитров свежего буфера, и бассейн мыть с клеточной подвеской. После обогащения для CD34 положительных клеток в соответствии со стандартными магнитными помощниками протоколов сортировки клеток, мыть бисер изолированных клеток до 50 миллилитров свежего буфера макс, и повторно использовать гранулы в HSPC среды. Затем пластины от 10 до 20 миллилитров клеток в вентилируемых тканей культурных лечение T75 колбы для их ночной культуры в 37 градусов по Цельсию и 5%углеродного диоксида инкубатора.Для оценки до и после обогащения чистоты образцов клеток костного мозга создать протокол цитометрии потока с соответствующими участками и иерархии населения, показывающие все ворота для всех событий рассеяния, CD34 положительные, гематопоэтические стволовые клетки, мультипотентные ан-эритро миелоидных прародителей и лимфо миелоидных прародителей. Далее, запустить незапачканные, предварительно обогащения, белые кровяные клетки образца для регулировки напряжения для вперед и стороны рассеяния параметров, и все каналы флуоресценции следуют одного окрашенных шариков компенсации для регулировки компенсации между соседними каналами. Затем запустите все оставшиеся незапачканные и окрашенные образцы с скорректированным и компенсированным протоколом для документирования эффективности обогащения CD34.Когда все компенсации были установлены настроить сортер клеток для сортировки рода CD34 подмножества в колонии формирования клеток анализы, и загрузить окрашенные CD34 обогащенной пробной трубки на цитометр. Затем завехать от 2000 до 3000 событий, и тонко настроить рода ворота, чтобы соответствовать силе сигнала и целевых групп населения. Когда установка завершена приобрести клетки корректировки скорости потока до 500 до 1000 клеток в секунду, и сортировки от 800 до 1200 клеток из рассеяния, CD34 положительные, гематопоэтические стволовые клетки, многопотентные эритро миелоидный предшественник и лимфо миелоидных ворот прародителя в отдельные трубки, содержащие 3,6 миллилитров колонии клеток формирования средней трубки.В конце рода вихрь сбора труб, и добавить один миллилитр клеточной суспензии до трех стерильных 3,5 сантиметра, не-ткани культуры лечение Петри блюда, установленные в рамках отдельных 15 сантиметров Петри блюда на клеточной популяции для их 10-14 день инкубации при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро используйте 10 миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно промыть клетки-адепты со дна каждой колбы стерильным HBSS и собрать собранные клетки путем центрифугации. Resuspend клетки в среде трансдукции на 1 х 10 до 6 клеток на миллилитр концентрации.И добавить один миллилитр клеток для макета управления в одном колодец рекомбинантного фрагмента фибронектина покрытием 12 хорошо пластины для ночной инкубации в инкубаторе культуры клеток. Затем добавьте 10 миллилитров алицитов оставшихся клеток в рекомбинантный фрагмент фибронектина, покрытый колбами T75 в течение 30 минут инкубации в инкубаторе клеточной культуры с вентилируемой крышкой. Во время инкубации вируса оттепели условные средние образцы и рассчитать количество вируса, который будет добавлен на основе титра и количество инфекционных единиц клеток на миллилитр.Возьмите колбу из инкубатора и добавить соответствующий объем вируса обусловленной среде каждой колбы, прежде чем вернуть клетки до 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующее утро перенесите клетки из колбы в отдельные 50 миллилитровые конические трубки. Вымойте клетки до 50 миллилитров HBSS за стирку, и повторить этот шаг до трех раз, чтобы удалить остаточный вирус.Инкубировать клетки в течение двух часов в СРЕДСТВАх массовой информации HSPC дополнены простагландин E2. Затем промыть клетки и повторно помыть клетки в 10 миллилитров HBSS дополняется 2%аутологичной сыворотки на трубку. Затем аспирировать клеточные суспензии с помощью 20 миллилитров шприца оснащен 16,5 калибровочных игл. Вымойте внутреннюю часть трубки со свежим HBSS плюс 2%аутологичной сыворотки, и аспират в шприц.Тщательно крышка шприц с иглой крышкой перед размещением клеточного раствора на льду до его вливания в аутологичный хост. Для определения эффективности генно-модификации трансвиндированных клеток пластина 1 х 10 к 6-й зарезервированной макет или транс индуцированных клеток на миллилитр среды HSPC на неткани культуры обработанных пластин. В дни два, пять и двенадцать после трансдукции, урожай и рассчитывать клетки.В два и пять дней, replate 33% клеток в свежем HSPC среды на 1 х 10 до 6 на миллилитр концентрации. В дни два, пять и двенадцать, заморозить 33% клеток в буфере извлечения ДНК для количественного ПЦР в режиме реального времени, и проанализировать окончательные 33% клеток по потоку цитометрии в соответствии со стандартными протоколами для оценки фенотипического состава гематопоэтического потомства. Для количественной оценки экспрессии трансгена по цитометрии потока добавьте три дополнительных боковых рассеяния против.трансгенные участки; и ворота первый участок на гематопоэтических стволовых клеток, второй участок на многопотентных ан-эритро миелоидных прародителей, и третий сюжет на лимфо миелоидных прародителей, все против трансгена. Затем завехать от 2000 до 3000 событий и тонко настроить ворота сортировки, чтобы соответствовать силе сигнала и целевых групп населения.Используя этот протокол число нечеловеческих приматов CD34 положительные HSPC, которые обогащены, как правило, пропорциональны входной общей количество белых кровяных клеток. Как показали предыдущие выводы, что общий CD34 положительный продукт HSPC включает в себя клетки, которые не являются истинными долгосрочной перспективе и прививки гематопоэтических стволовых клеток, эти поток цитометрии на основе и колонии формирования клеточных методов могут быть использованы для надежного выявления и дифференциации подмножества обогащенных для долгосрочной перспективе гематопоэтических стволовых клеток от совершенных прародителей. CD34 положительные человеческие стволовые клетки обогащенные клетки могут быть эффективно модифицированы геном с помощью лентивирусных векторов.Клетки, несущие неинтегрированную копию вектора, разбавляют в течение 12-дневного периода анализа жидкой культуры, в то время как стабилико интегрированные векторы в геноме передаются всем потомствам. Как подтверждается выражением вектора в колонии формирования клеток анализы. Этот доклинологический метод может быть использован для изоляции генетически модифицированных в качестве контролируемых нечеловеческих приматов гематопоэтических стволовых и прародителя клеток для генной терапии.Этот метод может быть легко адаптирован для других видов, источников гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, инструментов генной терапии и болезней. Этот тщательно проверенный протокол показывает большие перспективы для моделирования эффективных методов лечения многочисленных заболеваний человека. Имейте в виду, что работа с нечеловеческими тканями приматов требует усиленных мер безопасности, включая средства индивидуальной защиты.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Быстрый и количественный метод для столб-поступательные изменения и вариант включено сопоставление пептидов в геномов

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...