Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Los autores agradecen a Helen Crawford para la preparación de este manuscrito, Jim Woolace para diseño gráfico y Veronica Nelson y Devikha Chandrasekaran para participar en el desarrollo del protocolo. El desarrollo de este protocolo fue apoyado por subvenciones del NIH Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (R01 AI135953 y AI138329 a H.P.K.) y nacional del corazón, pulmón y Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 y U19 HL129902 a H.P.K.), así como NIH P51 OD010425 y, en parte, a través del centro del cáncer de NIH/NCI, apoyo beca P30 CA015704. H.P.K. es un investigador de Medicina Molecular de Markey y recibió el apoyo como el recipiente inaugural de la Cátedra José Carreras/E. Donnall Thomas dotado para la investigación del cáncer y la Cátedra Fred aparador para celular y Gene Therapy.

NHP autotrasplantes, cebado (movilización), la colección de células y la modificación genética se llevan a cabo constantes con protocolos previamente publicados26. Todos los procedimientos experimentales son revisados y aprobados por la Comisión de uso del Fred Hutchinson Cancer Research Center y la Universidad de Washington y de institucional Animal Care (protocolo #3235 - 01). Todos los estudios se realizan en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso d...

Vector de LV ingeniería es el método mejor caracterizado gene-modificar tipos de células como CD34+ HSPCs, para el posterior trasplante in vivo. El protocolo descrito aquí está diseñado para maximizar el número de HSPCs gen modificado que persisten a largo plazo en vivo y proporcionan beneficios clínicos en pacientes con diversas enfermedades malignas, infecciosas y genéticas. Aunque han surgido estrategias gene-edición durante la última década, las células modificadas de LV son los mejores estudi...

Terapia génica de la célula de vástago es un medio poderoso para abordar una amplia gama de patologías humanas. La terapia génica HSPC es un enfoque especialmente atractivo, debido a i) la relativa facilidad de la recogida de estas células de pacientes, ii) la riqueza del conocimiento que está disponible en cuanto a fenotipos de superficie celular y ex vivo parámetros de cultura y, como el campo se amplía, porque iii) presenta los científicos con una caja de herramientas cada vez más de estrategias de modificación génica adaptados a varias enfermedades de interés. Estamos investigando activamente HSPC enfoques de terapia de gen desde varios ángulos, incluyendo la ciencia básica de Biología HSPC, el engraftment de HSPCs modificado gen en modelos preclínicos in vivo y la aplicación a las poblaciones de pacientes. Nosotros y otros hemos caracterizado el fenotipo de superficie celular de funcionalmente distintas HSPC subconjuntos1,2,3, la movilización y regímenes de acondicionamiento que maximizan el rendimiento de la HSPC y engraftment minimizando toxicidad4,5y el gene de la modificación y edición de gene estrategias que se ajustan a una amplia gama de maligno, genética y enfermedades infecciosas6,7,8, 9,10. La función y el engraftment de HSPCs gene modificado pueden evaluarse en un número de modelos de animales grandes y pequeños, como ratones, perros, NHPs. En particular, modelos NHP son ventajosos porque muchos reactivos, por ejemplo, anticuerpos específicos para proteínas de superficie de célula HSPC como CD34 y CD90, pueden ser utilizados indistintamente en humanos y células NHP. Además, en contraste con los ratones, animales grandes, como NHPs permiten una mejor aproximación de la magnitud de la modificación genética necesaria para la eficacia clínica. Finalmente, NHPs son el estándar de oro para el modelado de patologías humanas tales como HIV-1 infección11 y son un modelo emergente para candidato anticáncer y anti-VIH inmunoterapias12,13.
El propósito de este protocolo es exponer métodos para purificar, modificar genéticamente y preparación de productos de infusión HSPC NHP. Aunque fuera del alcance de este protocolo, previamente hemos demostrado que estos productos engraft en anfitriones NHP autólogos, dan lugar a todos los linajes hematopoyéticos y proporcionan eficacia terapéutica en una amplia gama de modelos de enfermedad1. También hemos caracterizado el clonality de engrafting HSPCs y construido una plataforma para el seguimiento de la cinética, tráfico y el fenotipo de HSPCs individuales y su progenie, siguiente trasplante autólogo1,14. Los métodos presentados aquí han sido desarrollados con los siguientes objetivos: i) al aislar HSPCs altamente puros y subconjuntos HSC engrafting a largo plazo, ii) para mantener HSCs primitivo durante ex vivo de la cultura y iii) eficacia gene-modificar ya sea a granel HSPCs o a largo plazo engrafting subconjuntos HSC. Empleamos asistida magnética celular clasificación (MACS), así como de células activado por fluorescencia (FACS), para aislar a fenotípicamente/funcionalmente HSPC poblaciones distintas, consistentes con los métodos de muchos grupos2,15, de la clasificación 16. El mantenimiento de HSCs primitivos en la cultura (es decir, minimizar la diferenciación de estas células en progenitores comprometidos que dan lugar a completamente diferenciados subconjuntos linfoides y mieloides) es una faceta esencial del protocolo descrito aquí. Aunque anteriormente hemos caracterizado enfoques para ampliar HSPCs manteniendo un fenotipo primitivo17,18, aquí, se describe un protocolo que se centra en el mantenimiento de las HSCs vía un mínimo (48 h) y define ex vivo de la cultura.
La modificación eficaz de HSPCs y HSC subconjuntos es un objetivo central de este protocolo. Entre varios enfoques hemos divulgado, dos son los más investigados en ensayos clínicos: modificación genética mediada por LV y nucleasa-mediated gene edición1,6,19. Estrategias gene-edición para utilizan uno de un número de plataformas de nucleasa para modificar específicamente un gen específico de interés, por ejemplo, C-C chemokine receptor tipo 5 (CCR5) para el tratamiento de VIH infección7,19 o Bcl11A para el tratamiento de hemoglobinopatías6. Aquí, nos centramos en la modificación genética de LV-mediada, en la cual cargas transgénicas semirandomly integran en el genoma1,8,20. Una ventaja clave de los enfoques de LV es la capacidad para entregar grandes cantidades de material genético (hasta 8 o 9 kilobases). Aunque estrategias gene-edición se están desarrollando para un transgen de interés integrar sólo en un lugar especificado por recombinación homóloga donantes (HDR), estos métodos requieren más desarrollo in vitro y en modelos animales pequeños. Por el contrario, vectores de LV se han utilizado extensivamente en NHPs y en pacientes21,22. Lo importante, el protocolo descrito aquí, que utiliza habían cebada BM como una fuente partida de la HSPC, puede ser fácilmente y ampliamente adaptado, por ejemplo, para aislar PBSCs. Como se describió anteriormente, aprovechamos el alto grado de similitud genética entre NHPs y los seres humanos para utilizar reactivos que son aplicables a ambas especies. Por último, este enfoque ha sido adaptado para modificar otros subconjuntos hematopoyéticos, es decir, T las células12,23,24; la llegada de los eficaces métodos de inmunoterapia de T-cell ha confiado pesadamente en la misma plataforma de LV en este protocolo. Estos métodos son apropiados para cualquier investigador interesado en la biología de la HSPC o modificación genética mediada por LV. Por ejemplo, podría utilizarse el protocolo de purificación de la HSPC presentado aquí para caracterizar nuevos subconjuntos de HSC-enriquecido, como se describió anteriormente1,15,25. Asimismo, la transducción de LV métodos presentados aquí podrían del mismo modo ser aplicada y desarrollada por numerosos tipos celulares y preguntas experimentales, tanto en modelos in vitro e in vivo.
En Resumen, se presentan métodos para aislar y modificar genéticamente HSPCs NHP. Estos métodos pueden ser muy fácilmente adaptables para otras especies y otras fuentes de HSPCs. Este protocolo minuciosamente investigado muestra gran promesa en el modelaje de las eficaces terapias para numerosas enfermedades humanas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Trasplante de la célula de (HSPC) madre y progenitoras hematopoyético ha sido una terapia de la piedra angular para la leucemia y otros cánceres durante casi medio siglo, subyace la única cura conocida de infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y muestra la inmensa promesa en el tratamiento de enfermedades genéticas tales como la talasemia beta. Nuestro grupo ha desarrollado un protocolo de terapia del gene modelo HSPC en primates no humanos (NHPs), permitiendo a los científicos optimizar muchos de los mismos reactivos y técnicas que se aplican en la clínica. Aquí, describimos los métodos para purificar el CD34+ HSPCs y subconjuntos de células madre hematopoyéticas (HSC) que persiste a largo plazo de cebada de la médula (BM). Técnicas idénticas pueden ser empleadas para la purificación de otras fuentes de la HSPC (por ejemplo, sangre periférica movilizada células madre [PBSCs]). Se describe, es un protocolo de 2 días en el que las células son purificadas, cultivadas, modificadas con lentivirus (LV) y preparadas para infusión en el huésped autólogo. Lecturas claves de éxito incluyen la pureza de la CD34+ HSPC población, la capacidad de HSPCs purificadas para formar colonias morfológicamente distintas en medios semisólidos y, lo más importante, eficiencia de modificación genética. La ventaja clave de la terapia génica HSPC es la capacidad de proporcionar una fuente de larga vida células que dan lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas. Como tales, estos métodos se han utilizado para terapias de modelo para el cáncer, enfermedades genéticas y enfermedades infecciosas. En cada caso, eficacia terapéutica se establece al mejorar la función de clara progenie HSPC, incluyendo células de sangre rojas, células T, células B o subconjuntos mieloides. Los métodos para aislar, modificar y preparar HSPC productos son directamente aplicables y traducible a múltiples enfermedades en pacientes humanos.

El protocolo descrito anteriormente está diseñado para aislar y modificar genes de NHP CD34+ HSPCs, que posteriormente puede ser infundido en el host autólogo (figura 1 y figura 2). Al seguir este protocolo, generalmente obtenemos hasta 8 x 109 leucocitos total de cebada BM de macacos de cola de cochino y, doble a veces, esa cantidad de macacos rhesus. En ambas especies, el número de CD34+ HSP...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Para evaluar la eficiencia y la seguridad de enfoques de terapia génica prometedores y novedosos, es crucial realizar pruebas exhaustivas de células modificadas genéticamente en modelos preclínicos in vivo validados. La conservación de la reactividad cruzada de los reactivos de los marcadores de superficie celular relevantes y la capacidad de aplicar los mismos tratamientos de apoyo administrados a los pacientes a lo largo de modelos de primates no humanos para imitar de cerca los parámetros clínicos. Demostrando el procedimiento conmigo estará Anai Pérez, un técnico de investigación del laboratorio del Dr.Hans-Peter Kiem.Comience agregando alícuotas de 10 a 12 mililitros de médula ósea aisladas de un donante sano de primates no humanos en tubos cónicos de 50 mililitros. Lleve el volumen del tubo hasta 50 mililitros con tampón hemolítico e incubar las células hasta siete minutos a temperatura ambiente. Retire los restos celulares por centrifugación, y aspire todos menos los últimos dos a cinco mililitros del sobrenadante.Resuspender el pellet en el volumen de sobrenadante residual moviendo el tubo, y transferir las suspensiones de la médula ósea a un nuevo tubo de 50 mililitros utilizando un colador de células de poro de 70 micrómetros para eliminar cualquier coágulo de sangre. Agregue un tampón hemolítico fresco para subir el volumen a 50 mililitros, e incubar las células durante otros cinco minutos a temperatura ambiente antes de su recolección por centrifugación. Aspirar todo el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de tampón máximo.Antes de filtrar la suspensión celular a través de otro colador de poro de 70 micrómetros, enjuague el tubo con 40 mililitros de tampón fresco y acoja el lavado con la suspensión celular. Después de enriquecer para células positivas CD34 de acuerdo con los protocolos de clasificación de células asistidas magnéticas estándar, lave las células aisladas del cordón en hasta 50 mililitros de tampón máximo fresco, y resuspend el pellet en medio HSPC. A continuación, la placa de 10 a 20 mililitros de las células en el tejido ventilado cultivado T75 comprimidos T75 para su cultivo nocturno en una incubadora de 37 grados centígrados y 5%dióxido de carbono.Para evaluar la pureza previa y posterior al enriquecimiento de las muestras celulares de la médula ósea, cree un protocolo de citometría de flujo con las gráficas adecuadas y la jerarquía poblacional que muestre todas las puertas para la dispersión de todos los eventos, células madre hematopoyéticas CD34 positivas, progenitores mieloides multipotentes an-eritro y progenitores linfometos. A continuación, ejecute una muestra de glóbulos blancos sin mancha, pre-enriquecimiento, para ajustar los voltajes para los parámetros de dispersión hacia adelante y lateral, y todos los canales de fluorescencia seguidos de cuentas de compensación de manchas individuales para ajustar la compensación entre los canales adyacentes. A continuación, ejecute todas las muestras no manchadas y manchadas restantes con el protocolo ajustado y compensado para documentar la eficiencia de enriquecimiento de CD34.Cuando se hayan establecido todas las compensaciones, configure el clasificador de células para la purificación de la clasificación de los subconjuntos CD34 en ensayos de células formadoras de colonias, y cargue el tubo de muestra enriquecido CD34 manchado en el citómetro. A continuación, registre de 2000 a 3000 eventos, y ajuste con precisión las puertas de clasificación para que se ajusten a la intensidad de la señal y a las poblaciones objetivo. Cuando la configuración es completa adquirir las celdas ajustando el caudal a 500 a 1000 celdas por segundo, y la clasificación de 800 a 1200 células de la dispersión, CD34 positivo, célula madre hematopoyética, progenitor mieloide multipotente y compuertas progenitoras mieloide linfáticas en tubos separados que contienen 3,6 mililitros de colonia formando medio de células formadoras por tubo.Al final del vórtice de clasificación, los tubos de recolección, y agregue un mililitro de suspensión celular a tres platos estériles de 3,5 centímetros tratados con cultivo de cultivo no tejido situados dentro de platos individuales de petri de 15 centímetros por población celular para su incubación de 10-14 días a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente utilice una pipeta de 10 mililitros para enjuagar suavemente las células adherentes de la parte inferior de cada matraz con HBSS estéril, y recoger las células cosechadas por centrifugación. Resuspender las células en medio de transducción a una concentración de 1 x 10 a 6a células por mililitro.Y agregue un mililitro de células para el control simulado en un pozo de un fragmento de fibronectina recombinante recubierto de 12 pozos para una incubación durante la noche en la incubadora de cultivo celular. A continuación, añada 10 mililitros alícuotas de las células restantes en matraces T75 recubiertos con fragmentos de fibronectina recombinantes para una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular con las tapas ventiladas. Durante la incubación se descontaron muestras medias condicionadas por el virus y calculan la cantidad de virus que se añadirá en función del título y el número de unidades infecciosas de células por mililitro.Saque el matraz de la incubadora y añada el volumen adecuado de medio condicionado por virus a cada matraz antes de devolver las células a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono. A la mañana siguiente transfiera las células del matraz a tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Lave las células en hasta 50 mililitros de HBSS por lavado, y repita este paso hasta tres veces para eliminar el virus residual.Incubar las células durante dos horas en medios HSPC complementados con prostaglandina E2. Luego lave las células y resusppend las células en 10 mililitros de HBSS complementados con 2%suero autólogo por tubo. A continuación, aspirar las suspensiones celulares utilizando una jeringa de 20 mililitros equipada con una aguja de calibre 16,5. Lave el interior del tubo con HBSS fresco más 2% de suero autólogo, y aspire en la jeringa.Tapar cuidadosamente la jeringa con el capuchón de la aguja antes de colocar la solución celular sobre hielo hasta su perfusión en un huésped autólogo. Para determinar la eficiencia de modificación genética de las células transducidas, la placa 1 x 10 a la 6a células simuladas o transducidas reservadas por mililitro de medio HSPC en placas tratadas de cultivo no tisular. En los días dos, cinco y doce después de la transducción, cosechar y contar las células.En los días dos y cinco, vuelva a planchar el 33% de las células en un medio HSPC fresco a una concentración de 1 x 10 a la 6a por mililitro. En los días dos, cinco y doce, congelar el 33% de las células en el tampón de extracción de ADN para pcR cuantitativa en tiempo real, y analizar el 33% final de las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar para evaluar la composición fenotípica de la progeniedad hematopoyética. Para cuantificar la expresión de transgenes por citometría de flujo, agregue tres dispersión lateral adicionales frente a.parcelas transgenes;y puerta la primera parcela en las células madre hematopoyéticas, la segunda parcela en los progenitores mieloides multipotentes an-eritro, y la tercera parcela sobre los progenitores mieloides linfáticos, todos contra el transgén. A continuación, registre de 2000 a 3000 eventos y ajuste de forma fina las puertas de clasificación para que se ajusten a la intensidad de la señal y a las poblaciones objetivo.Usando este protocolo el número de HSPC positivos CD34 de primate no humanos que se enriquecen es típicamente proporcional al recuento total de glóbulos blancos de entrada. Como los hallazgos anteriores han demostrado que el producto total de HSPC positivo CD34 incluye células que no son verdaderas a largo plazo y el injerto de células madre hematopoyéticas, estas técnicas de células formadoras de colonias basadas en citometría de flujo y basadas en colonias se pueden utilizar para identificar y diferenciar de forma confiable subconjuntos enriquecidos para células madre hematopoyéticas a largo plazo de progenitores comprometidos. Las células enriquecidas con células madre humanas positivas CD34 pueden modificarse eficientemente utilizando vectores lentivirales.Las células que llevan una copia no integrada del vector se diluyen durante el período de ensayo de cultivo líquido de 12 días, mientras que los vectores integrados de forma estable en el genoma se transmiten a toda la progenie. Como confirma la expresión del vector en ensayos celulares formadores de colonias. Este método preclínico se puede utilizar para aislar genéticamente modificado en células hematopoyéticas de primate no humanos controladas de calidad y células progenitoras para la terapia génica.Este método se puede adaptar fácilmente para otras especies, fuentes de células madre y progenitoras hematopoyéticas, herramientas de terapia génica y enfermedades. Este protocolo completamente examinado muestra una gran promesa para el modelado de terapias eficaces para numerosas enfermedades humanas. Tenga en cuenta que trabajar con tejidos de primates no humanos requiere mejores medidas de seguridad, incluido el equipo de protección personal.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigación

Genética

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Un método rápido y cuantitativo para la variante y modificación poste-de translación activado mapeo de péptidos genomas

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...