Name: preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka Helen Crawford för att förbereda detta manuskript, Jim Woolace för grafisk design, och Veronica Nelson och Devikha Chandrasekaran för att delta i utvecklingen av protokollet. Utvecklingen av detta protokoll stöds genom bidrag från NIH nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (R01 AI135953 och AI138329 till H.P.K.) och den nationella hjärta, Lung- och Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 och U19 HL129902 till H.P.K.), samt NIH P51 OD010425 och, delvis genom NIH/NCI cancercentrum, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. är en Markey molekylär medicin utredare och fick stöd som konstituerande mottagare av José Carreras/E. Donnall Thomas begåvad stolen för cancerforskning och Fred Hutch begåvad stolen för Cell- och Gene Therapy.

Autologa NHP transplantationer, priming (mobilisering), insamling av celler och genmodifiering genomförs konsekvent med tidigare publicerade protokoll26. Alla experimentella rutiner granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén för Fred Hutchinson Cancer Research Center och University of Washington (protokoll #3235 - 01). Alla studier genomförs i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av Nationa...

LV vektor engineering är metoden bäst kännetecknas gen-ändra celltyper som CD34+ HSPCs, för efterföljande transplantation invivo. Protokollet beskrivs här är utformad för att maximera antalet gen-modifierat HSPCs som kvarstår långsiktiga i vivo, och ger kliniska fördelar för patienter med olika maligna, infektiös och genetiska sjukdomar. Även om genredigering strategier har dykt upp under det senaste decenniet, LV-modifierade celler är bäst studerade in vitro i djurmodeller och i patienter<sup...

Stem cell genterapi är ett kraftfullt sätt att hantera en lång rad mänskliga sjukdomar. HSPC genterapi är en särskilt attraktiv inställning, på grund av (i) den relativa lätthet att samla dessa celler från patienter, ii) mängden kunskap som finns om cell surface fenotyper och ex vivo kultur parametrar, och, som fältet expanderar, eftersom iii) det presenterar forskare med en ständigt ökande verktygslåda av genen modifiering strategier anpassade till olika sjukdomar av intresse. Vi undersöker aktivt HSPC gen terapi metoder från flera vinklar, inklusive grundläggande vetenskapen av HSPC biologi, engraftment av gen-modifierat HSPCs i prekliniska in vivo modeller och ansökan till relevanta patientgrupper. Vi och andra har präglat cell surface fenotypen av funktionellt distinkta HSPC delmängder1,2,3, mobilisering och förbehandlingsregimer som maximerar HSPC avkastning och engraftment samtidigt minimera toxicitet4,5och genen modifiering och genredigering strategier som har skräddarsytts till ett brett utbud av maligna, genetiska och infektionssjukdomar6,7,8, 9,10. Funktion och engraftment av gen-modifierat HSPCs kan utvärderas i ett antal små - och stora-djur modeller, inklusive möss, hundar och NHPs. NHP modeller är särskilt fördelaktiga eftersom många reagenser, till exempel antikroppar specifika för HSPC cell ytproteiner som CD34 och CD90, kan användas omväxlande i mänskliga och NHP celler. Dessutom, i motsats till möss, stora djur som NHPs medge en närmare uppskattning av omfattningen av genmodifiering behövs för klinisk effekt. Slutligen NHPs är den gyllene standarden för modellering av mänskliga sjukdomar såsom HIV-1 infektion11 och en framväxande modellsystem för kandidat mot cancer och anti-hiv immunterapier12,13.
Syftet med detta protokoll är att beskriva metoder för rening, genetiskt modifiera och förbereda NHP HSPC infusion produkter. Även om inte omfattas av detta protokoll, har vi tidigare visat att dessa produkter engraft i autologa NHP värdar, ge upphov till alla hematopoetiska härstamningar och ge terapeutisk effekt i ett brett spektrum av sjukdom modeller1. Vi har också karakteriserat clonality av implantation HSPCs och byggt en plattform för att spåra kinetik, människohandel och fenotyp av individuella HSPCs och deras avkomma, följande autolog transplantation1,14. De metoder som presenteras här har utvecklats med följande mål: i) att isolera högt rena HSPCs och långsiktig implantation HSC delmängder, ii) att upprätthålla primitiva Förenta under ex vivo kultur och iii) effektivt gen-ändra antingen bulk HSPCs eller långsiktiga implantation HSC delmängder. Vi anställer magnetiska-assisted cell-sortering (Mac), samt fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), för att isolera fenotypiskt/funktionellt distinkta HSPC populationer, överensstämmer med metoderna för många grupper2,15, 16. Underhåll av primitiva Förenta i kultur (dvs minimera differentiering av dessa celler i engagerade stamfäder som ger upphov till fullt differentierade lymfoida och myeloida delmängder) är en viktig aspekt av det protokoll som beskrivs här. Även om vi tidigare karakteriserat strategier för att utöka HSPCs samtidigt behålla en primitiv fenotyp17,18, här beskriver vi ett protokoll som fokuserar på att upprätthålla Förenta via en minimal (48 h) och definieras ex vivo kultur.
Effektiv ändringen av HSPCs och HSC delmängder är ett centralt mål i detta protokoll. Bland flera metoder vi har rapporterat, två är överlägset den mest undersökta i kliniska prövningen: LV-medierad genmodifiering och nuclease-medierad gen redigering1,6,19. Genredigering strategier använder en av ett antal nuclease plattformar specifikt ändra en riktade gen av intresse, till exempel C-C chemokine receptor typ 5 (CCR5) för behandling av HIV infektion7,19 eller Bcl11A för behandling hemoglobinopathies6. Här fokuserar vi på LV-medierad genmodifiering, där transgena laster integrera semirandomly i genomet1,8,20. En viktig fördel av LV metoder är förmågan att leverera stora mängder genetiskt material (upp till 8 eller 9 kilobases). Även om genredigering strategier utvecklas för att rikta en transgen av intresse att integrera endast på en viss locus av homologa givare rekombination (HDR), kräver dessa metoder ytterligare utveckling in vitro och i små djurmodeller. Däremot har LV vektorer använts flitigt i NHPs och patienter21,22. Ännu viktigare, kan i protokollet som beskrivs här, som använder primas BM som börjar HSPC källa, enkelt och allmänt anpassas, till exempel isolera PBSCs. Som beskrivits ovan, dra vi nytta av den höga graden av genetisk likhet mellan NHPs och människor att använda reagenser som gäller för båda arterna. Slutligen, detta tillvägagångssätt har anpassats för att ändra andra hematopoetiska delmängder, nämligen T celler12,23,24; tillkomsten av effektiv T-cell immunterapi metoder har förlitat sig tungt på samma LV plattform utnyttjas i detta protokoll. Dessa metoder är lämpliga för alla forskare som är intresserade av antingen HSPC biologi eller LV-medierad genmodifiering. Exempelvis HSPC rening protokollet presenteras här kunde användas för att karaktärisera roman HSC-berikad delmängder, som tidigare beskrivits1,15,25. Likaså den LV transduktion metoder som presenteras här kan på motsvarande sätt tillämpas och utvecklas ytterligare för många andra celltyper och experimentella frågor, både i in vitro- och in vivo modeller.
Sammanfattningsvis presenterar vi metoder för att isolera och genetiskt modifiera NHP HSPCs. Dessa metoder kan lätt anpassas för andra arter och andra källor av HSPCs. Detta noggrant kontrollerats protokoll visar mycket lovande i modellering av effektiva behandlingar för många mänskliga sjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stemspam SFEM II (&#34;HSPC&#34;) Media</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>09655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>M18027161M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30024-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PS-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 &#181;g/&#181;L)</td>
			<td>TaKaRA</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse IgM magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-047-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Gel 1402</td>
			<td>ReachBio</td>
			<td>1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separators</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS L25 Columns</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM PGE2</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14753-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-TC-treated T-75 flasks</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>13680-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.5 G needles</td>
			<td>BD Precision</td>
			<td>305198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Tip Cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickExtract DNA Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-tube strip cap PCR Tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1402-2708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracomp ebeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lock Syringes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14823435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non TC treated flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNA extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563</td>
			<td>BD horizon</td>
			<td>562449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autologous Serum</td>
			<td>Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus-Conditioned Media (VCM)</td>
			<td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD34 antibody, Clone 12.8</td>
			<td>Kiem Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and gene modification of nonhuman primate hematopoietic stem and progenitor cells

Hematopoetiska stamceller och stamceller (HSPC) stamcellstransplantation har varit en hörnsten behandling för leukemi och andra cancerformer i nästan ett halvt sekel, ligger bakom den enda kända botemedlet av humant immunbristvirus (HIV-1) infektion och visar enorma löfte i behandling av genetiska sjukdomar såsom beta-thalassemi. Vår grupp har utvecklat ett protokoll till modell HSPC genterapin i icke-mänskliga primater (NHPs), tillåter forskare att optimera många av samma reagenser och tekniker som används i kliniken. Här, vi beskriver metoder för rening av CD34+ HSPCs och långsiktiga framhärdande hematopoetiska stamceller (HSC) delmängder från primade benmärg (BM). Identiska tekniker kan användas för rening av andra HSPC källor (t.ex. mobiliserade perifera stamceller [PBSCs]). Beskrivs är en 2 dagars protokoll där är celler renas, odlade, modifierad med lentivirus (LV) och förberett för infusion tillbaka i autologa värden. Nyckeln avläsning av framgång inkluderar renheten av CD34+ HSPC befolkning, renat HSPCs förmåga att bilda morfologiskt skilda kolonier i halvfasta media, och, viktigast av allt, gen ändring effektivitet. Den viktigaste fördelen att HSPC genterapi är förmågan att ge en källa till långlivade celler som ger upphov till alla typer av hematopoetiska celler. Som sådan, har dessa metoder använts till modell behandlingar för cancer, genetiska sjukdomar och infektionssjukdomar. I varje fall upprättas terapeutisk effekt genom att förbättra funktionen av distinkta HSPC avkomma, inklusive röda blodkroppar, T-celler, B-celler eller myeloisk delmängder. Metoder att isolera, ändra och förbereda HSPC produkter är direkt tillämpliga och översättningsbara till flera sjukdomar hos patienter.

Det protokoll som beskrivs ovan är utformad för att isolera och gen-ändra NHP CD34+ HSPCs, som kan därefter infunderas tillbaka till autolog värden (figur 1 och figur 2). När du följer detta protokoll, vi få brukar upp till 8 x 109 totala WBCs från primade BM från tofsar makaker och, ibland, dubbla beloppet från rhesus makaker. Hos båda arterna, antalet CD34+ HSPCs som vi berikar är p...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Förberedelse och genmodifiering av Nonhuman Primate hematopoetiska stamceller och stamceller

Målet med detta protokoll är att isolera ickemänskliga primater CD34+ celler från primade benmärg, gen-ändra dessa celler med lentiviral vektorer, och att förbereda en produkt för infusion i autologa värden. Totala protokoll längd är ca 48 h.

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

För att utvärdera effektiviteten och säkerheten hos lovande och nya genterapi metoder, omfattande testning av genmodifierade celler i validerade prekliniska in vivo-modeller är avgörande. Bevarande av relevanta cellytan markörer'cross-reaktivitet av reagenser, och förmåga att tillämpa samma stödjande behandlingar som administreras till patienter längs icke-mänskliga primater modeller för att nära efterlikna kliniska parametrar. Demonstrera förfarandet med mig kommer att Anai Perez, en forskningstekniker från Dr.Hans-Peter Kiem laboratorium.Börja med att lägga till 10 till 12 milliliter alikvoter av benmärg isolerade från en hälsosam icke-mänsklig primat givare i 50 milliliter koniska rör. För rörets volym upp till 50 milliliter med hemolytisk buffert och inkubera cellerna i upp till sju minuter vid rumstemperatur. Ta bort cellskräp genom centrifugeringen, och aspirera alla utom de två till fem milliliters sista av supernatanten.Resuspend pelleten i den kvarvarande supernatant volymen genom att snärta röret, och överföra benmärgssuspensionerna till ett nytt 50 milliliterrör med hjälp av en 70 mikrometer porcellsil för att avlägsna eventuella blodproppar. Tillsätt färsk hemolytisk buffert för att få volymen upp till 50 milliliter, och inkubera cellerna i ytterligare fem minuter vid rumstemperatur innan de uppsamling genom centrifugering. Aspirera alla supernatant och resuspend cellerna i 10 milliliter av max buffert.Innan du filtrerar cellupphängningen genom ytterligare en 70 mikrometer porsil, skölj röret med 40 milliliter färsk buffert, och poola tvätten med cellupphängningen. Efter att ha berikat för CD34 positiva celler enligt standard magnetiska assisterad cell sortering protokoll, tvätta pärla isolerade celler i upp till 50 milliliter av färsk max buffert, och resuspend pelleten i HSPC medium. Sedan platta 10 till 20 milliliter av cellerna i ventilerad vävnad odlade behandlade T75 flaskor för deras övernattning kultur i en 37 grader celsius och 5% koldioxid inkubator.För att bedöma pre och post anrikning renhet av benmärgens cellprover skapa ett flöde cytometry protokoll med lämpliga tomter och befolkningshierarki som visar alla av portarna för alla händelser scatter, CD34 positiva, hematopoietic stamceller, multipotent an-erythro myeloisk stamfader och lymfo myeloisk progenitors. Därefter kör en obefläckad, pre-anrikning, vita blodkroppar prov för att justera spänningarna för framåt och sida scatter parametrar, och alla fluorescens kanaler följt av enda färgade kompensation pärlor att justera ersättningen mellan intilliggande kanaler. Kör sedan alla de återstående obefläckade och färgade proverna med det justerade och kompenserade protokollet för att dokumentera CD34-anrikningseffektiviteten.När alla kompensationer har ställts in konfigurera cell sorteraren för sortera rening av CD34 delmängder i koloni bildar cell analyser, och ladda den färgade CD34 berikade provröret på cytometern. Sedan spela in 2000 till 3000 händelser, och fin justera sortera grindar för att passa signalstyrka och mål populationer. När inställningen är klar förvärva cellerna justera flödeshastigheten till 500 till 1000 celler per sekund, och sortering 800 till 1200 celler från scatter, CD34 positiva, hematopoitiska stamceller, multipotent an-erythro myeloisk stamfader och lymfo myeloisk progenitor grindar i separata rör som innehåller 3,6 milliliter av koloni bildar cell medium per rör.I slutet av den typ virvel insamlingen rören, och lägga till en milliliter cell suspension till tre sterila 3,5 centimeter, icke-vävnad kulturbehandlade petriskålar som inom enskilda 15 centimeter petriskålar per cell befolkning för deras 10-14 dagars inkubation vid 37 grader celsius. Nästa morgon använder en 10 milliliter pipetter för att försiktigt skölja de vidhäftande cellerna från botten av varje kolv med steril HBSS, och samla de skördade cellerna genom centrifugeringen. Resuspend cellerna i transduktionsmedium vid en 1 x 10 till 6: e celler per milliliter koncentration.Och tillsätt en milliliter celler för mock kontroll i en brunn av en rekombinant fibronectin fragment belagda 12 väl plattan för en övernattning inkubation i cellkultur inkubatorn. Tillsätt sedan 10 milliliter alikvoter av de återstående cellerna i rekombinant fibronectin fragment belagda T75 kolvar för en 30 minuters inkubation i cellkultur inkubatorn med locken ventileras. Under inkubationen tina virus betingade medelstora prover och beräkna mängden virus som skall läggas till baserat på titer och antalet smittsamma enheter av celler per milliliter.Ta ut kolven ur inkubatorn och tillsätt lämplig volym virus som konditioneras till varje kolv innan cellerna återförs till 37 grader celsius och 5 %koldioxid. Nästa morgon överför cellerna från kolven till enskilda 50 milliliter koniska rör. Tvätta cellerna i upp till 50 milliliter HBSS per tvätt, och upprepa detta steg upp till tre gånger för att avlägsna kvarvarande virus.Inkubera cellerna i två timmar i HSPC-medier kompletterat med prostaglandin E2. Tvätta sedan cellerna och resuspend cellerna i 10 milliliter HBSS kompletteras med 2%autolog serum per rör. Aspirera sedan cellupphängningar med hjälp av en 20 milliliter spruta utrustad med en 16,5 gauge nål. Tvätta insidan av röret med färskt HBSS plus 2%autologt serum, och aspirera i sprutan.Ta försiktigt emot sprutan med nålskyddet innan celllösningen placeras på is tills dess infusion i en autolog värd. För att fastställa gen-modifiering effektivitet av de transduced cellerna, platta 1 x 10 till den 6: e reserverade mock eller transduced celler per milliliter av HSPC medium på icke-vävnad kultur behandlade plattor. På dag två, fem och tolv post-transduktion, skörda och räkna cellerna.På dag två och fem, replate 33%av cellerna i färskt HSPC medium vid en 1 x 10 till 6: e per milliliter koncentration. På dag två, fem och tolv, frysa 33%av cellerna i DNA extraktionsbuffert för kvantitativ realtid PCR, och analysera den slutliga 33%av cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll för att bedöma den fenotypiska sammansättningen av den hematomatoetiska avkomman. Om du vill kvantifiera transgenuttrycket efter flödescytometri lägger du till ytterligare tre sidodide kontratransgena tomter;och grind den första tomten på hematopoietiska stamceller, den andra tomten på den multipotenta an-erythro myeloida stamfader, och den tredje tomten på lymfo myeloisk stamfaditorer, alla vs. transgenen. Sedan spela in 2000 till 3000 händelser och fin justera sortering grindar för att passa signalstyrka och mål populationer.Med hjälp av detta protokoll antalet icke-mänskliga primater CD34 positiva HSPC: s som är berikade är typiskt proportionell mot ingång totala antalet vita blodkroppar. Som tidigare resultat har visat att den totala CD34 positiva HSPC produkten omfattar celler som inte är sant lång sikt och ympning hematopoetiska stamceller, dessa flöde cytometry baserade och koloni bildar cell tekniker kan användas för att på ett tillförlitligt sätt identifiera och differentiera delmängder berikas för långsiktiga hematopoietic stamceller från engagerade progenitorer. CD34 positiva mänskliga stamceller berikade celler kan effektivt gen ändras med hjälp av lentiviral vektorer.Celler som bär en nonintegrated kopierar av vektorn som ut späds ut över den vätske- kulturanalysperioden 12 dag, eftersom stably integrerade vektorer i genomet får passerat på till all avkomman. Som bekräftas av uttrycket av vektorn i koloni bildar cell analyser. Denna prekliniska metod kan användas för att isolera genetiskt modifierade i kvalitetskontrollerade icke-mänskliga primater hematopoitisk stam och stamceller för genterapi.Denna metod kan lätt anpassas för andra arter, källor till hematopoetiska stamceller och progenitorceller, genterapiverktyg och sjukdomar. Detta grundligt kontrollerat protokoll visar stort löfte för modellering av effektiva terapier för många mänskliga sjukdomar. Tänk på att arbete med icke-mänskliga primatvävnader kräver förbättrade säkerhetsåtgärder inklusive personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerande och inducerbara system för genetiska In Vivo modifiering av mus hepatocyter använder hydrodynamiska svans ven injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion och rening av baculoviridae för genterapi ansökan

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En snabb och kvantitativ metod för posttranslationella modifieringen och Variant aktiverad mappning av peptider till genomen

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

En kombinatorisk Single-cell strategi att karaktärisera molekylära och Immunophenotypic heterogenitet av mänskliga stamceller och stamceller populationer

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...